Sterowana polem elektrycznym migracja kierunkowa komórek progenitorowych neuronów w środowiskach 2D i 3D

Podsumowanie

Niniejszy protokół demonstruje metody wykorzystywane do tworzenia środowisk 2D i 3D w specjalnie zaprojektowanych komorach elektrotaktycznych, które umożliwiają śledzenie komórek in vivo/ex vivo przy użyciu rejestracji time-lapse na poziomie pojedynczych komórek, w celu zbadania galwanotaksji/elektrotaksji oraz innych odpowiedzi komórkowych na elektryczne pola (EFs) prądu stałego (DC).

Streszczenie

Endogenne pola elektryczne (EF) występują naturalnie in vivo i odgrywają kluczową rolę podczas rozwoju i regeneracji tkanek oraz narządów, w tym ośrodkowego układu nerwowego^1,2. Endogenne EF są generowane przez komórkową regulację transportu jonowego w połączeniu z oporem elektrycznym komórek i tkanek. Wykazano, że zastosowanie terapii EF może wspomagać funkcjonalną naprawę uszkodzeń rdzenia kręgowego u zwierząt i ludzi^3,4. W szczególności udowodniono, że migracja komórek sterowana przez EF zachodzi w szerokiej gamie typów komórek^5,6, w tym w komórkach progenitorowych neuronów (NPC)^7,8. Stosowanie pól elektrycznych prądu stałego (DC) nie jest powszechną techniką w większości laboratoriów. Wcześniej opisaliśmy szczegółowe protokoły stosowania DC EF w kulturach komórek i tkanek^5,11. W niniejszym materiale prezentujemy demonstrację wideo standardowych metod opartych na obliczonej natężeniu pola w celu przygotowania środowisk 2D i 3D dla NPC oraz zbadania odpowiedzi komórkowych na stymulację EF zarówno w warunkach wzrostu pojedynczych komórek w 2D, jak i w organotypowym skrawku rdzenia kręgowego w 3D. Skrawek rdzenia kręgowego jest idealną tkanką biorcą do badania zachowań NPC ex vivo po transplantacji, ponieważ organizacja cytoarchitektoniczna tkanki jest dobrze zachowana w tych kulturach^9,10. Ponadto ten model ex vivo umożliwia procedury, które nie są technicznie wykonalne przy śledzeniu komórek in vivo, dzięki zastosowaniu rejestracji time-lapse na poziomie pojedynczej komórki. Krytycznie istotne jest ocenianie zachowań komórek nie tylko w środowisku 2D, ale także w organotypowych warunkach 3D, które naśladują środowisko in vivo. System ten pozwoli na obrazowanie o wysokiej rozdzielczości z wykorzystaniem naczyń z kryształem przedmiotowym w kulturze tkanek lub narządów, z 3D śledzeniem migracji pojedynczych komórek in vitro oraz ex vivo, i może stanowić krok pośredni przed przejściem do paradygmatów in vivo.

Protokół

1. Izolacja neuralnych komórek progenitorowych

1. Wypreparować całe mózgi myszy w dniach embrionalnych E14-16 i umieścić je w zimnej pożywce podstawowej DMEM/F12. Usunąć wszystkie opony mózgowe pod mikroskopem anatomicznym, a następnie przenieść mózgi do szalki Petriego o średnicy 35 mm.
2. Za pomocą precyzyjnej pęsety mechanicznie rozdrobić mózgi na fragmenty tkanki i przenieść je do probówki o pojemności 15 ml, a następnie odwirować próbki z prędkością 800 rpm przez 3 min w celu usunięcia zanieczyszczeń.
3. Dodać pożywkę DMEM/F12 zawierającą bFGF i EGF, a następnie homogenizować za pomocą pipety 1 ml.
4. Przepuścić zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek.
5. Wysiać komórki do kolb w zagęszczeniu 2-5 x 10⁴ komórek/ml, następnie przeprowadzać całkowitą wymianę pożywki co 3 dni i pasażować komórki co 6 dni.
6. Po co najmniej 5 pasażach rozbić neurosfery do pojedynczych komórek przy użyciu trypsyny i EDTA, a następnie hodować je w komorach elektrotaktycznych powlekanych poli-D-lizyną/lamininą (przygotowanych zgodnie z opisem w punkcie 2 poniżej). Przez cały czas stosować pożywkę wzrostową zawierającą suplement N2, bFGF i EGF, aby zachować właściwości NPC.

2. Przygotowanie komory elektrotaktycznej

1. Przygotować szklane paski o wymiarach 22 x 11 mm, dzieląc autoklawowane szkiełka podstawkowe o grubości no.1 i wymiarach 22 x 22 mm na pół za pomocą rysika diamentowego.
2. Utworzyć wolnostojącą szklaną studzienkę o wymiarach wewnętrznych 22 x 10 mm, sklejając ze sobą cztery pionowo ustawione paski 22 x 11 mm za pomocą wysokopróżniowego smaru silikonowego. Pozostawić studzienki do całkowitego wyschnięcia i utwardzenia przez noc.
3. Następnego dnia przymocować dwa szklane paski 22 x 11 mm równolegle do siebie, zachowując odstęp 10 mm, do dna szalki hodowlanej o średnicy 100 mm, używając smaru silikonowego. Odizolować obszar między paskami, umieszczając szkiełko podstawkowe 22 x 22 mm na każdym z końców, przymocowane do dna szalki smarem z trzech stron, z wyjątkiem strony najbliższej środkowi.
4. Umieścić szklaną studzienkę przygotowaną w kroku 2.2 na szkiełkach podstawkowych w taki sposób, aby wewnętrzne ścianki stworzyły zamkniętą przestrzeń do wysiewu komórek na dno szalki. Uszczelnić wszystkie połączenia smarem silikonowym. Pokryć ten zamknięty obszar sekwencyjnie poli-D-lizyną, a następnie lamininą: dodać 1 ml poli-D-lizyny do komory i pozostawić na 5 min, aby poli-D-lizyna związała się z dnem szalki; przemyć komorę sterylnym PBS dwa razy, następnie rozcieńczyć lamininę w sterylnym PBS do stężenia 20 μg/ml i pokryć nią dno szalki. Pozostawić w temperaturze pokojowej przez noc.
5. Następnego dnia zebrać komórki i przygotować 1 ml zawiesiny zawierającej 1 x 10⁴ komórek. Usunąć lamininę ze szklanej studzienki, pozwalając jej całkowicie wyschnąć, i zastąpić ją 1 ml zawiesiny komórkowej. Umieścić szalkę w inkubatorze w temperaturze 37° C na minimum 4 godziny, aby umożliwić adhezję.
6. Po osiągnięciu przez komórki odpowiedniej konfluencji usunąć całe medium z komory. Ostrożnie zdjąć szklaną studzienkę. Utworzyć „dach” nad komórkami, ostrożnie przymocowując za pomocą smaru silikonowego autoklawowane szkiełko podstawkowe 22 x 22 mm, rozpięte między dwoma paskami 22 x 11 mm. Przykryć komórki kilkoma kroplami medium, aby zapobiec ich wysychaniu.
7. Utworzyć izolowany rezerwuar medium na każdym końcu komory, tworząc dwie wodoszczelne bariery ze smaru silikonowego, które biegną od jednej krawędzi szalki do drugiej, nad dachem komory. Wypełnić komorę świeżym medium, zapewniając przepływ z jednego rezerwuaru medium do drugiego. Przenieść szalkę z powrotem do inkubatora na 12 godzin, aby umożliwić regenerację komórek.

3. Przyłożenie pola elektrycznego do komory elektrotaktycznej

1. Przygotuj pokrywkę do naczynia, wywiercając w niej dwa otwory, po jednym nad każdym zbiornikiem komory migracyjnej.
2. Wymień całe medium w komorze na pożywkę hodowlaną zawierającą 25 mM buforu HEPES i przenieś naczynie do systemu obrazowania z kontrolą temperatury. Ustaw parametry eksperymentalne dla rejestracji time-lapse i wielopozycyjnej. Wyrównaj komorę tak, aby katoda i anoda znajdowały się odpowiednio po lewej i prawej stronie, co zapewni poziomy przebieg wektora EF w widoku przez mikroskop i w zapisie systemu obrazowania.
3. Napełnij dwa zlewki roztworem Steinberga (58 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 0,44 mM Ca(NO₃)₂.4H₂0, 1,3 mM MgSO₄.7H₂0 i 4,6 mM Trizma base, pH 7,4). Połącz oddzielną zlewkę z każdym zbiornikiem medium za pomocą wcześniej przygotowanych mostków szklanych (rurki szklane o długości ~13 cm i średnicy ~3 mm, wygięte w kształt litery U poprzez podgrzewanie w płomieniu palnika Bunsena), wypełnionych 2% (w/v) roztworem agaru Steinberga, przechodzącymi przez otwory w pokrywce. Zamknij obwód elektryczny, umieszczając elektrody Ag/AgCl podłączone do zasilacza DC w każdej zlewce z roztworem Steinberga.
4. Ustaw pokrętło napięcia w zasilaczu na 0 i włącz urządzenie. Pomierz napięcie w komorze elektrotaktycznej, zwiększając wartość na pokrętle za pomocą woltomierza, a następnie dostosuj je do wymagań eksperymentalnych.
5. Rozpocznij rejestrację time-lapse. Co godzinę wymieniaj medium i w razie potrzeby ponownie dostosuj napięcie. Do zbiorników można dodawać świeże medium, leki lub odczynniki chemiczne zgodnie z potrzebami. Podczas wymiany medium można rozważyć dwie poniższe opcje:
   1. Opcja nr 1 – aby tymczasowo wstrzymać rejestrację time-lapse, ostrożnie wyjmij mostki szklane z komory, aby uniknąć poruszenia pokrywki, użyj sterylnej pipety Pasteura, by delikatnie zastąpić całe medium świeżym, włóż z powrotem mostki szklane, a następnie wznowij rejestrację.
   2. Opcja nr 2 – alternatywnie do wymiany medium można użyć specjalnie wykonanej pokrywki z 4 otworami (po dwa nad każdym zbiornikiem komory migracyjnej). Dwa otwory służą do połączenia mostków szklanych, a pozostałe dwa do wymiany medium. Opcja 2 umożliwia ciągłą rejestrację bez zakłóceń podczas wymiany medium.

4. Przygotowanie organotypowego skrawka rdzenia kręgowego

1. Przeprowadzić sekcję lędźwiowego rdzenia kręgowego u 2-tygodniowych myszy C57 BL/6.
2. Pokroić rdzenie kręgowe na sekcje o grubości 500 μm za pomocą tnącego urządzenia do tkanek McIlwain.
3. Rozdzielić sekcje pod mikroskopem anatomicznym i wybrać te z nienaruszoną strukturą strzałkową/osiową rdzenia kręgowego.
4. Umieścić sekcje w szalce Petriego o średnicy 35 mm zawierającej 30 μl Matrigelu, starając się ulokować je jak najbliżej centrum, a następnie inkubować w inkubatorze z 5 % CO₂ w temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 min, aż białka Matrigelu samoorganizują się, tworząc cienką warstwę pokrywającą powierzchnię sekcji rdzenia kręgowego. Bardzo ważne jest upewnienie się, że Matrigel uległ całkowitej polimeryzacji; w razie potrzeby inkubować szalkę Petriego w 37 °C przez kolejne 30 min.
5. Bardzo delikatnie dodać 4-6 ml pożywki DMEM/F-12 zawierającej 25 mM buforu HEPES i 15-20% płodowej surowicy cielęcej, tak aby uniknąć bezpośredniego przepływu pożywki na sekcję. Należy dopilnować, aby sekcja nie była całkowicie zanurzona w pożywce, pozostawiając powierzchnię eksplantów dobrze wystawioną na działanie powietrza. Wymieniać pożywkę dwa razy w tygodniu.

5. Iniekcja NPC znakowanych Hoechst 33342 do organotypowego skrawka rdzenia kręgowego

1. Przygotować zawiesinę NPC o stężeniu 1 × 10⁶ komórek/μl.
2. Preinkubować zawiesinę komórek w medium z dodatkiem 5 μM Hoechst 33342 przez 30 min.
3. Za pomocą szklanej kapilary powoli mikroiniekować 2 μl zawiesiny do skrawka rdzenia kręgowego pod mikroskopem. Należy upewnić się, że szklana kapilara przechodzi przez matrigel (część różowa pod mikroskopem) i dociera do wnętrza skrawka rdzenia kręgowego (tkanka szara pod mikroskopem); kapilarę należy pozostawić wewnątrz skrawka rdzenia kręgowego przez co najmniej 30 sekund, aby zapobiec wypłynięciu zawiesiny komórek. Płytkę Petri z zawartym skrawkiem rdzenia kręgowego umieścić w inkubatorze (37°C 5%CO₂) i pozostawić na noc.
4. Następnego dnia, w komorze elektrotaktycznej, przyłożyć pole elektryczne (EF) o natężeniu 500 mV/mm do skrawka rdzenia kręgowego zawierającego NPC znakowane Hoechst 33342 (stosując metody opisane w punkcie 3).

6. Reprezentatywne wyniki

Pod wpływem szeregu fizjologicznych pól elektrycznych (EF) komórki NPC wykazywały silnie ukierunkowaną migrację w stronę katody (Rysunek 1). Tą samą obserwację poczyniono również na poziomie pojedynczych komórek w organotypowym skrawku rdzenia kręgowego. ex vivo model, środowisko 3D naśladujące in vivo warunki (rycina 2).

Rycina 1. NPCs wykazują ukierunkowaną migrację w EFs. PCs wykazały silnie ukierunkowaną migrację w stronę katody po narażeniu na EFs; czerwone linie i niebieskie strzałki reprezentują trajektorie i kierunek ruchu komórek (A). B przedstawia ścieżki migracji NPCs. Pasek skali: 50 μm.

Rysunek 2. Przeszczepione NPC wykazują kierunkową migrację w stronę katody w organotypowym skrawku rdzenia kręgowego. (A) NPC znakowane Hoechst 33342 zostały przeszczepione do organotypowego skrawka rdzenia kręgowego w punkcie początkowym traktowania polem elektrycznym (EF). NPC migrowały kierunkowo w stronę katody przez 2,5 godziny, po czym odwrócono polaryzację EF (B). Zmiana polaryzacji EF wywołała gwałtowny odwrót elektrotaksji w stronę nowej katody (C). (D) Obraz przeszczepionych NPC wewnątrz skrawka rdzenia kręgowego na koniec rejestracji time-lapse. (E) Rekonstrukcja 3D przeszczepionych NPC wewnątrz skrawka rdzenia kręgowego. Sekcje skanowania 3D miały grubość 300 μm, zaczynając od środka i kończąc na dole skrawka. Linie przerywane wskazują względne pozycje tej samej populacji przeszczepionych komórek w punktach początkowym, odwrócenia i końcowym traktowania EF (odpowiednio A - C). Groty strzałek wskazują tę samą populację NPC znakowanych Hoechst 33342. Pasek skali: 50 μm.

Dyskusja

Stosowane przez nas protokoły opierają się na wcześniejszych badaniach^5,11. Dzięki tym metodom można utrzymać stabilną hodowlę i warunki prądu elektrycznego podczas przykładania EF poprzez mostki agarowe, roztwór Steinberga oraz elektrody Ag/AgCl do komórek lub skrawków hodowanych w specjalnie zaprojektowanych komorach elektrotaktycznych o ustandaryzowanych i precyzyjnych wymiarach. Głębokość komór można dostosować do różnych grubości próbek¹¹, a w przypadku komórek, rozmiar komory można zmodyfikowa...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rekombinowany ludzki FGF-basic	Invitrogen	PHG0026	20 ng/mL
Rekombinowany ludzki EGF	Invitrogen	PHG0311	20 ng/mL
Suplement N2 (100X) w formie ciekłej	Invitrogen	02048
Pożywka DMEM/F12 (wysoka zawartość glukozy)	Invitrogen	31330-095
Poly-D-Lizyna	EMD Millipore	A-003-E
Naturalna laminina mysia	Invitrogen	23017-015
Macierz błony podstawnej z obniżoną zawartością czynników wzrostu (Matrigel)	BD Biosciences	354230
Bufor HEPES	GIBCO, by Life Technologies	15630
Krojanka do tkanek McIlwaina	The Mickle Laboratory Engineering Co Ltd	TC752-PD
Smar silikonowy wysokopróżniowy Dow Corning	Sigma-Aldrich	Z273554