Sterowana polem elektrycznym ukierunkowana migracja neuronalnych komórek progenitorowych w środowiskach 2D i 3D

Podsumowanie

Ten protokół demonstruje metody używane do tworzenia środowisk 2D i 3D w specjalnie zaprojektowanych komorach elektrotaktycznych, które mogą śledzić komórki in vivo/ex vivo za pomocą zapisu poklatkowego na poziomie pojedynczej komórki, w celu zbadania galwanotaksji/elektrotaksji i innych reakcji komórkowych na pola elektryczne prądu stałego (DC) (EFs).

Streszczenie

Endogenne pola elektryczne (EF) występują naturalnie in vivo i odgrywają kluczową rolę podczas rozwoju i regeneracji tkanek/narządów, w tym ośrodkowego układu nerwowego^1,2. Te endogenne EF są generowane przez komórkową regulację transportu jonowego w połączeniu z oporem elektrycznym komórek i tkanek. Doniesiono, że stosowane leczenie EF może sprzyjać funkcjonalnej naprawie urazów rdzenia kręgowego u zwierząt i ludzi^3,4. W szczególności wykazano migrację komórek kierowaną przez EF w wielu różnych typach komórek^5,6, w tym w nerwowych komórkach progenitorowych (NPC)^7,8. Zastosowanie EF prądu stałego (DC) nie jest powszechnie dostępną techniką w większości laboratoriów. Opisaliśmy wcześniej szczegółowe protokoły stosowania DC EF do hodowli komórkowych i tkankowych^5,11. W tym miejscu prezentujemy demonstrację wideo standardowych metod opartych na obliczonym natężeniu pola do tworzenia środowisk 2D i 3D dla NPC oraz do badania odpowiedzi komórkowych na stymulację EF zarówno w warunkach wzrostu pojedynczej komórki w 2D, jak i organotypowego przekroju rdzenia kręgowego w 3D. Wycinek rdzenia kręgowego jest idealną tkanką biorcy do badania zachowań NPC ex vivo, po przeszczepie, ponieważ organizacja tkanki cytoarchitektonicznej jest dobrze zachowana w tych kulturach^9,10. Ponadto ten model ex vivo umożliwia również procedury, które nie są technicznie wykonalne, aby śledzić komórki in vivo przy użyciu zapisu poklatkowego na poziomie pojedynczej komórki. Niezwykle istotna jest ocena zachowania komórek nie tylko w środowisku 2D, ale także w warunkach organotypowych 3D, które naśladują środowisko in vivo. System ten umożliwi obrazowanie w wysokiej rozdzielczości przy użyciu naczyń na bazie szkła nakrywkowego w hodowli tkanek lub narządów ze śledzeniem 3D migracji pojedynczych komórek in vitro i ex vivo i może być krokiem pośrednim przed przejściem do paradygmatów in vivo.

Protokół

1. Izolacja neuronalnej komórki progenitorowej

1. Wypreparuj całe mózgi myszy E14-16 i umieść w zimnym podłożu podstawowym DMEM/F12. Usuń wszystkie opony mózgowe pod mikroskopem anatomicznym i przenieś mózg na szalkę Petriego o średnicy 35 mm.
2. Użyj cienkich kleszczy, aby mechanicznie zdysocjować mózg na fragmenty tkanek i przenieś je do probówki o pojemności 15 ml, a następnie odwiruj próbki z prędkością 800 obr./min przez 3 minuty, aby usunąć zanieczyszczenia.
3. Dodać DMEM/F12 zawierający bFGF i EGF i rozprowadzić pipetą o pojemności 1 ml.
4. Przepuścić zawiesinę komórek przez sitko do komórek, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.
5. Umieść komórki w kolbach w proporcjach 2-5 x 10⁴ komórek/ml, a następnie wykonaj pełną zmianę pożywki co 3 dni i pasaż komórek co 6 dni.
6. Po co najmniej 5 pasażach trawić neurosfery do pojedynczych komórek za pomocą trypsyny i EDTA i hodować w komorach elektrotaktycznych pokrytych poli-D-lizyną/lamininą (przygotowanych zgodnie z opisem poniżej w 2). Używaj podłoża uprawowego zawierającego suplement N2, bFGF i EGF przez cały czas, aby utrzymać właściwości NPC.

2. Przygotowanie komory elektrotaktycznej

1. Przygotuj paski szkła o wymiarach 22 x 11 mm, dzieląc autoklawowane szkiełka nakrywkowe o grubości 22 x 22 mm nr 1 na pół za pomocą pisaka diamentowego.
2. Stwórz wolnostojącą szklaną studnię o wymiarach wewnętrznych 22 x 10 mm, sklejając ze sobą cztery pionowo stojące paski 22 x 11 mm za pomocą wysokopróżniowego smaru silikonowego. Pozostaw studzienki do całkowitego wyschnięcia i stwardnienia przez noc.
3. Następnego dnia przymocuj dwa szklane paski o wymiarach 22 x 11 mm, równolegle do siebie, pozostawiając odstęp 10 mm, do podstawy naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm za pomocą smaru silikonowego. Uszczelnij obszar między tymi paskami, umieszczając na każdym końcu szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 x 22 mm, przymocowane do dna naczynia smarem z trzech stron, ale nie najbliżej środka.
4. Umieść szklankę dobrze przygotowaną w kroku 2.2 na szkiełkach nakrywkowych, tak aby ścianki wewnętrzne tworzyły ograniczoną przestrzeń do wysiewania komórek na dnie płytki. Uszczelnij wszystkie połączenia smarem silikonowym. Pokryj ten ograniczony obszar kolejno poli-D-lizyną, a następnie lamininą: dodaj 1 ml poli-D-lizyny do komory i pozostaw na 5 minut, aby poli-D-lizyna związała się z dnem płytki; dwukrotnie przemyć komorę sterylnym PBS, następnie rozcieńczyć lamininę w sterylnym PBS do uzyskania 20 μg/ml i użyć do przykrycia dna płytki. Pozostaw w temperaturze pokojowej na noc.
5. Następnego dnia należy pobrać komórki i przygotować 1 ml zawiesiny zawierającej 1 x 104 komórki. Usuń lamininę ze szklanki, pozwalając jej całkowicie wyschnąć na powietrzu, i zastąp 1 ml zawiesiny komórek. Umieść naczynie w inkubatorze w temperaturze 37°C na co najmniej 4 godziny, aby umożliwić zamocowanie.
6. Gdy komórki wystarczająco się zlewają, usuń całe podłoże z komory. Ostrożnie wyjmij szklankę. Uformuj dach nad komórkami, ostrożnie mocując smarem silikonowym autoklawizowane szklane szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 x 22 mm łączące dwa paski o wymiarach 22 x 11 mm. Przykryj komórki kilkoma kroplami pożywki, aby uniknąć wysuszenia.
7. Uformuj izolowany zbiornik pożywki na każdym końcu komory, tworząc dwie wodoszczelne bariery ze smaru silikonowego, które biegną od jednej krawędzi naczynia do drugiej, nad dachem komory. Napełnij komorę świeżym medium, zapewniając przepływ z jednego zbiornika medium do drugiego. Włóż naczynie z powrotem do inkubatora na 12 godzin, aby umożliwić odzyskanie komórek.

3. Zastosowanie pola elektrycznego do komory elektrotaktycznej

1. Przygotuj pokrywkę, aby przykryć naczynie, wiercąc dwa otwory, po jednym umieszczonym nad każdym zbiornikiem komory migracyjnej.
2. Zastąp całą pożywkę w komorze pożywką hodowlaną zawierającą 25 mM bufor HEPES i przenieś szalkę do systemu obrazowania o kontrolowanej temperaturze. Skonfiguruj parametry eksperymentalne dla nagrywania poklatkowego i wielopozycyjnego. Ustaw komorę tak, aby katoda i anoda znajdowały się odpowiednio po lewej i prawej stronie, aby upewnić się, że wektor EF przebiega poziomo, tak jak jest oglądany w dół mikroskopu i zarejestrowany w systemie obrazowania.
3. Napełnij dwie zlewki roztworem Steinberga (58 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 0,44 mM Ca(NO₃)_{2,4H 2}0, 1,3 mM MgSO,_4,7H2 0 i 4,6 mM zasada Trizma, pH7,4). Podłączyć oddzielną zlewkę do każdego zbiornika pożywki za pomocą wstępnie przygotowanych szklanych mostków (szklane rurki o długości ~13 cm i średnicy ~3 mm, wygięte w kształt litery U przez ogrzewanie w płomieniu Bunsena), wypełnionych 2 % (m/v) roztworem agaru Steinberga, przechodząc przez otwory w pokrywie. Uzupełnij obwód elektryczny, umieszczając elektrody Ag/AgCl podłączone do zasilacza prądu stałego w każdej zlewce roztworu Steinberga.
4. Ustaw pokrętło napięcia na zasilaczu na 0 i włącz. Zmierz napięcie w komorze elektrotaktycznej, jednocześnie zwiększając pokrętło napięcia za pomocą miernika napięcia i dostosuj do wymagań eksperymentalnych.
5. Rozpocznij nagrywanie poklatkowe. Wykonaj wymianę medium i ponownie wyreguluj napięcie, zgodnie z wymaganiami, co godzinę. W razie potrzeby do zbiorników można dodać świeże podłoże, leki lub środki chemiczne. Podczas wykonywania zmiany podłoża można rozważyć dwie opcje, jak poniżej:
   1. Opcja nr 1 - Aby tymczasowo wstrzymać nagrywanie poklatkowe, ostrożnie wyjmij szklane mostki z komory, aby uniknąć zakłóceń pokrywy, użyj wysterylizowanej pipety Pasteura, delikatnie zastąp całe podłoże świeżym medium i włóż szklane mostki z powrotem, a następnie wznów nagrywanie.
   2. Opcja nr 2 - Alternatywnie, wykonana na zamówienie pokrywa z 4 otworami (dwa umieszczone nad każdym zbiornikiem komory migracyjnej) może być również używana do wymiany medium. Dwa do podłączenia mostków szklanych, pozostałe dwa do wymiany medium. Opcja 2 umożliwia ciągłe nagrywanie bez zakłóceń podczas zmiany nośnika.

4. Przygotowanie organotypowego wycinka rdzenia kręgowego

1. Wypreparuj lędźwiowy rdzeń kręgowy 2-tygodniowych myszy C57 BL/6.
2. Pokrój rdzeń kręgowy na odcinki o grubości 500 μm za pomocą rozdrabniacza do tkanek McIlwaina.
3. Oddziel plastry pod mikroskopem anatomicznym i wybierz plastry z nienaruszoną strzałkową/osiową strukturą rdzenia kręgowego.
4. Na płytce Petriego o średnicy 35 mm i 30 μl Matrigel należy umieścić je jak najbliżej środka, a następnie przechowywać w inkubatorze z 5 % stężeniem_{CO2 w} temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut, aż białka Matrigelu ulegną samoorganizacji i wytworzą cienką warstwę pokrywającą powierzchnię wycinka rdzenia kręgowego. Bardzo ważne jest, aby upewnić się, że Matrigel został całkowicie zmontowany, w razie potrzeby inkubować szalkę Petriego w temperaturze 37 °C przez kolejne 30 minut.
5. Bardzo delikatnie dodaj 4-6 ml pożywki DMEM/F-12 zawierającej 25 mM buforu HEPES i 15-20% płodowej surowicy cielęcej, aby uniknąć przepływu pożywki bezpośrednio na plasterek. Upewnij się, że plasterek nie jest całkowicie zanurzony w podłożu, pozostawiając powierzchnię eksplantatów dobrze wystawioną na działanie powietrza. Zmieniaj podłoże dwa razy w tygodniu.

5. Wstrzyknięcie NPC oznaczonych jako Hoechst 33342 do organotypowego wycinka rdzenia kręgowego

1. Przygotować zawiesinę NPC w stężeniu 1 × 10⁶ komórek/μl.
2. Zawiesinę komórkową należy wstępnie inkubować w pożywce z 5 μM Hoechst 33342 przez 30 minut.
3. Za pomocą szklanej rurki kapilarnej powoli pod mikroskopem wstrzyknąć 2 μl zawiesiny do wycinka rdzenia kręgowego. Upewnij się, że szklana rurka kapilarna przechodzi przez matrycę (różowa część pod mikroskopem) i sięga do wnętrza wycinka rdzenia kręgowego (szara tkanka pod mikroskopem), pozostaje wewnątrz wycinka rdzenia kręgowego przez co najmniej 30 sekund, aby uniknąć przesunięcia zawiesiny komórek. Umieść szalkę Petriego zawierającą plaster rdzenia kręgowego w inkubatorze (37°C 5%CO₂) i pozostaw na noc.
4. Następnego dnia nałóż EF 500 mV/mm na wycinek rdzenia kręgowego zawierający NPC znakowane Hoechst 33342 w komorze elektrotaktycznej (stosując metody opisane w 3).

6. Reprezentatywne wyniki

Gdy NPC byli narażeni na szereg fizjologicznych EF, wykazywali wysoce ukierunkowaną migrację komórek w kierunku katody (Rysunek 1). Ta sama obserwacja została również dokonana na poziomie pojedynczej komórki na organotypowym wycinku rdzenia kręgowego ex vivo, środowisku 3D naśladującym warunki in vivo (ryc. 2).

Rysunek 1. NPC pokazują ukierunkowaną migrację w EF. PC wykazywały wysoce ukierunkowaną migrację w kierunku katody po wystawieniu na działanie EF, czerwone linie i niebieskie strzałki reprezentują trajektorie i kierunek ruchu komórki (A). B pokazuje ścieżki migracji NPC. Bar: 50 μm.

Rysunek 2. Przeszczepione NPC wykazują ukierunkowaną migrację w kierunku katody w organotypowym wycinku rdzenia kręgowego. (A) NPC oznaczeni Hoechst 33342 zostali przeszczepieni do organotypowego wycinka rdzenia kręgowego w momencie rozpoczęcia leczenia EF. NPC migrowały kierunkowo w kierunku katody przez 2,5 godziny, w którym to momencie polaryzacja EF została odwrócona (B). Zmiana polaryzacji EF spowodowała gwałtowne odwrócenie elektrotaksji w kierunku nowej katody (C). (D) Obraz przeszczepionych NPC w obrębie wycinka rdzenia kręgowego na końcu nagrania poklatkowego. (E) Rekonstrukcja 3D przeszczepionych NPC w obrębie wycinka rdzenia kręgowego. Sekcje skanowania 3D miały grubość 300 μm, zaczynając od środka, a kończąc na dole plastru. Linie przerywane wskazują względne położenie tej samej populacji przeszczepionych komórek w punkcie początkowym, odwróceniu i końcowym leczenia EF (odpowiednio A - C). Groty strzałek wskazują tę samą populację NPC oznaczonych jako Hoechst 33342. Bar: 50 μm.

Dyskusja

Stosowane przez nas protokoły oparte są na wcześniejszych badaniach^5,11. Korzystając z tych metod, można utrzymać stabilne warunki hodowli i prądu elektrycznego podczas nakładania EF za pomocą mostków agarowych, roztworu Steinberga i elektrod Ag/AgCl do komórek lub plastrów hodowanych w specjalnie zaprojektowanych komorach elektrotaktycznych o znormalizowanych i precyzyjnych wymiarach. Głębokość komór można dostosować, aby dostosować się do różnych grubości próbek¹¹, a w przypadku komórek wielkość k...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
FGF-basic Rekombinowany ludzki	Invitrogen		PHG0026 20 ng/ml
EGF Rekombinowany ludzki	Invitrogen	PHG0311	20 ng/ml
N2-Suplement (100X) w płynie	Invitrogen	02048
DMEM/F12 medium (wysoki poziom glukozy)	Invitrogen	31330-095
Poli-D-lizyna	EMD Milipor	A-003-E
Mysz naturalna Laminin	Invitrogen	23017-015
Obniżony czynnik wzrostu Macierz błony podstawnej (Matrigel)	BD Biosciences	354230
Bufor HEPES	GIBCO, firmy Life Technologies	15630
Rozdrabniacz tkanek McIlwain	Mickle Laboratory Engineering Co Ltd	TC752-PD
Wysokopróżniowy smar	silikonowy Dow CorningSigma-Aldrich	Z273554