Ilościowa analiza fluorescencyjna żywych komórek drożdży szczepowych przy użyciu mikroskopii

Podsumowanie

Drożdże szczapowe, Schizosaccharomyces pombe, stanowią dobry system modelowy do badania podstawowych procesów komórkowych. W niniejszej pracy opisujemy metodę ilościowej analizy żywych komórek drożdży szczapowych. W tym konkretnym doświadczeniu skupiamy się na organizacji genomu w obrębie jądra komórkowego, jednak metoda ta może być również wykorzystana do badania czynników cytozolowych.

Streszczenie

Obecnie dostępnych jest wiele technik mikroskopowych, które umożliwiają detekcję specyficznego białka wewnątrz komórki. W ciągu ostatniej dekady coraz popularniejsze stało się obrazowanie żywych komórek z wykorzystaniem fluorochromów, takich jak zielone białko fluorescencyjne (GFP), bezpośrednio przyłączonych do białka będącego przedmiotem zainteresowania ¹. Dzięki zastosowaniu GFP i podobnych fluorochromów w mikroskopie fluorescencyjnym można wykryć subkomórkową lokalizację i ruchy białek. Ponadto technika ta pozwala na badanie lokalizacji subjądrowej określonego regionu chromosomu. GFP zostaje połączone z białkiem represora Lac (LacR) i ektopowo wyeksponowane w komórce, do której w badanym regionie chromosomu wprowadzono tandemowe powtórzenia sekwencji lacO². Kompleks LacR-GFP zwiąże się z powtórzeniami lacO, a ten obszar genomu będzie widoczny jako zielona kropka w mikroskopie fluorescencyjnym. Drożdże są szczególnie odpowiednie do tego typu manipulacji, ponieważ rekombinacja homologiczna jest w nich bardzo wydajna, co umożliwia ukierunkowaną integrację powtórzeń lacO oraz zaprojektowanych białek fuzyjnych z GFP ³. W niniejszej pracy opisujemy ilościową metodę analizy żywych komórek drożdży rozszczepialnych. Dodatkowe protokoły analizy żywych komórek drożdży rozszczepialnych można znaleźć na przykład w instrukcji dotyczącej przygotowania filmu przedstawiającego zachowanie chromosomów podczas mejozy ⁴. W tym konkretnym eksperymencie skupiamy się na organizacji subjądrowej i tym, jak ulega ona zmianie podczas indukcji genów. Oznaczyliśmy klaster genów, nazwany Chr1, poprzez wprowadzenie miejsc wiązania lacO w sąsiedztwie genów. Klaster ten jest wzbogacony w geny, które są indukowane wczesną fazą głodzenia azotowego drożdży rozszczepialnych ⁵. W badanym szczepie błona jądrowa (NM) jest znakowana poprzez przyłączenie mCherry do białka NM Cut11, co daje czerwony sygnał fluorescencyjny. Białko Sid4 z ciała bieguna wrzeciona (SPB) jest połączone z czerwonym białkiem fluorescencyjnym (Sid4-mRFP) ⁶. W wegetatywnie rosnących komórkach drożdży centromery są zawsze przytwierdzone do SPB, które jest osadzone w NM ⁷. SPB jest identyfikowane jako duża, okrągła struktura w NM. Poprzez obrazowanie przed i 20 minut po usunięciu źródła azotu możemy wyznaczyć odległość między klastrem genów (GFP) a NM/SPB. Porównując średnie lub mediany odległości przed i po usunięciu azotu, możemy ilościowo określić, czy po usunięciu azotu następuje zmiana lokalizacji subkomórkowej klastra genów.

Protokół

1. Hodowla drożdży szczelinowych

1. Przygotować minimalne podłoże edynburskie (EMM) oraz EMM bez chlorku amonu (EMM-N) ⁸. Aby zmniejszyć autofluorescencję, roztwór glukozy nie powinien być autoklawowany, lecz wysterylizowany przez filtr o rozmiarze 0,2 μm i następnie dodany do autoklawowanego podłoża.
2. Zaszczepić komórki drożdży szczelinowych, świeżo wyhodowane na płytce agarowej z bogatym podłożem YEA ⁸, w 3 mL płynnego podłoża EMM z wysterylizowaną przez filtr glukozą. Należy użyć probówek o pojemności 13 mL z lekko nasuniętą zakrętką, aby zapewnić komórkom odpowiednią wentylację. Hodować komórki w temperaturze 30 °C przy wytrząsaniu z prędkością 225 rpm. Przez 2 dni utrzymywać komórki w fazie logarytmicznej (1 X 10⁶ - 2 X 10⁷ komórek / mL), wykonując każdego ranka i wieczora odczyt za pomocą komory Bürkera, a następnie stosując odpowiednie rozcieńczenie.
3. W dniu eksperymentu należy upewnić się, że komórki znajdują się we wczesnej fazie logarytmicznej, w stężeniu 5 X 10⁶ - 1 X 10⁷ komórek / mL.
4. Aby poddać komórki 20-minutowemu głodzeniu azotowemu, należy przenieść je z podłoża EMM do podłoża EMM-N. W tym celu zebrać 3 ml hodowli do probówki Eppendorfa 1,5 mL w wirówce laboratoryjnej przy maksymalnej sile 1,5 rcf, ponieważ wirowanie z większą prędkością może wywołać odpowiedź stresową u drożdży szczelinowych ⁹. Zastosować technikę podwójnego wirowania, polegającą na wirowaniu przez 2 min, następnie obróceniu probówki Eppendorfa o 180° i ponownym wirowaniu przy 1,5 rcf przez 2 min ¹⁰. Pomaga to zebrać wszystkie komórki w jednym osadzie na dnie probówki. Przepłukać raz podłożem EMM-N, a następnie zawiesić osad w EMM-N i inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze 30 °C przy wytrząsaniu z prędkością 225 rpm, po czym przejść do punktu 2. Przygotowanie próbek.

2. Przygotowanie próbek

1. Odwiruj 1,5 mL komórek w probówce Eppendorfa 1,5 mL w wirówce nakładkowej przy maksymalnej sile 1,5 rcf, ponieważ wirowanie z większą prędkością może wywołać reakcję stresową u drożdży rozdzielających ⁹. Zastosuj technikę podwójnego wirowania: najpierw wiruj przez 2 min, następnie obróć probkę Eppendorfa o 180° i ponownie wiruj przy 1,5 rcf przez 2 min ¹⁰. Pomaga to zebrać wszystkie komórki w jednym osadzie na dnie probówki.
2. Usuń supernatant, pozostawiając 10-15 μL, i resuspenduj komórki w pozostałym medium. Alternatywnie dodaj 10 μL świeżego medium, aby resuspendować osad komórkowy.
3. Upewnij się, że posiadasz czyste szkiełka przedmiotowe i szkiełka nakrywki (No 1.5). Zazwyczaj nie trzeba ich czyścić, ale upewnij się, że nie są zakurzone.
4. Wyjmij z zamrażarki alikwot roztworu stokowego lektyny o stężeniu 1mg/mL, który został wysterylizowany przez filtrowanie. Roztwór lektyny można zamrażać i rozmrażać kilka razy. Lektyna służy do unieruchomienia komórek drożdży na szkiełku nakrywce.
5. Nanieś 5 μL medium EMM z wysterylizowaną przez filtrowanie glukozą na szkiełko przedmiotowe.
6. Nanieś 5 μL roztworu lektyny w narożnik szkiełka nakrywki. Następnie nanieś 5 μL kultury komórkowej w ten sam narożnik, czyli do kropli lektyny. Wymieszaj, pipetując kilka razy, a następnie rozprowadź mieszaninę kultury komórkowej i lektyny po całym szkiełku nakrywce, używając długiej strony końcówki pipety. W zależności od gęstości mieszaniny komórkowej pozostaw całość lub odsącz nadmiar cieczy z przeciwległego narożnika szkiełka nakrywki.
7. Połóż szkiełko nakrywkę stroną górną do góry, tak aby jedna krawędź opierała się o szkiełko przedmiotowe, a druga o blat. Pozostaw szkiełko nakrywkę do lekkiego podeschnięcia przez kilka minut. Nie może ono być całkowicie suche, ale na szkle nie powinno znajdować się zbyt dużo cieczy.
8. Ustaw szkiełko nakrywkę pod kątem około 70° względem szkiełka przedmiotowego w miejscu kropli EMM. Puść szkiełko nakrywkę tak, aby opadło stroną górną do dołu w kroplę EMM.
9. Aby uszczelnić krawędzie smarem silikonowym, przygotuj strzykawkę 2 mL. Odetnij szeroki koniec końcówki 200 μl i przymocuj ją do strzykawki. Napełnij strzykawkę około 1 mL smaru silikonowego. Delikatnie naciskając tłok strzykawki, nanieś cienką linię silikonu na krawędzie szkiełka nakrywki. W ten sposób powstanie mała komora wzrostu komórek S. pombe.

3. Mikroskopia

1. Uruchom mikroskop fluorescencyjny, włączając lampę rtęciową/ksenonową, mikroskop oraz komputer. Umieść komorę wzrostową drożdży w mikroskopie fluorescencyjnym. Użyj obiektywu 63 X lub 100 X z NA=1.3 lub wyższym. W przypadku użycia obiektywu imersyjnego nanieś olej.
2. Użyj pola jasnego, aby zlokalizować komórki i uzyskać ostry obraz.
3. Ustawienia mikroskopii fluorescencyjnej różnią się w zależności od użytych fluorochromów do znakowania komórek drożdży oraz rodzaju mikroskopu. W tej procedurze wykorzystano konfokalny mikroskop skaningowy Zeiss LSM 700 z obiektywem olejowym Plan-Apochromat 63x (NA=1.4) przy ustawieniu średniego skanu płaszczyzny 16 linii. Apertura pinhole powinna być ustawiona na 1-1.1 jednostek Airy, co zapewnia optyczny przekrój o grubości 0.8 mm. Detekcję GFP w kanale Track 1 przeprowadzono przy użyciu zestawu filtrów dla Alexa 488 z dzielnikiem wiązki przy 582 nm, co pozwala na detekcję długości fal między 488 a 582 nm. W kanale Track 2 wykorzystano zestaw filtrów optymalnych dla mCherry z dzielnikiem wiązki przy 578 nm, detekując długości fal między 578 a 600 nm. Oznacza to, że w kanale Track 2 wykrywane będą zarówno mRFP (SPB), jak i NM (mCherry).
4. Wykonaj tyle zdjęć, ile jest konieczne do przeprowadzenia pomiarów w 60 różnych komórkach dla każdego szczepu. Zazwyczaj wystarczające jest 15 zdjęć niezależnych pól widzenia. Zaleca się przygotowanie nowej komory wzrostowej ze świeżymi komórkami, jeśli czas mikroskopii przekroczy 60 minut.

4. Ilościowy pomiar odległości subkomórkowych

1. Otwórz obrazy w programie Zeiss Zen Light Edition. Za pomocą narzędzia pomiarowego zmierz odległość w μm pomiędzy różnymi fluorochromami we wszystkich komórkach, w których wszystkie sygnały znajdują się w tej samej płaszczyźnie ogniskowania. Dostosuj natężenie światła i kontrast, aby zidentyfikować środek sygnału fluorescencyjnego. Ten uproszczony protokół wykorzystuje tylko dwa różne kolory, w związku z czym SPB i NM znajdują się w tym samym kanale. SPB można rozpoznać po dużej, okrągłej strukturze w obrębie NM. Przenieś zmierzone odległości do arkusza notatnika. Wykonaj pomiary w co najmniej 60 komórkach. Do pomiaru odległości można wykorzystać również inne programy, takie jak ImageJ, jednak preferowany jest Zeiss Zen Light ze względu na wyższą rozdzielczość obrazu oraz łatwość przybliżania i oddalania widoku. Obrazy w formacie lsm otwarte w ImageJ będą miały dwa kanały nałożone na siebie. Aby utworzyć obraz z obydwoma kanałami, najpierw rozdziel oba kanały, a następnie je połącz. Po tym zabiegu można użyć narzędzia linii do pomiaru odległości zgodnie z powyższym opisem.
2. Porównaj średnie lub mediany podkomórkowych odległości pomiędzy różnymi szczepami i wariantami traktowania za pomocą programu statystycznego, na przykład stosując test t lub test suma rang Manna-Whitneya, np. przy użyciu oprogramowania SigmaStat-3.5. Dane często nie mają rozkładu normalnego, ponieważ występuje selekcja komórek z krótszymi odległościami między sygnałami fluorescencyjnymi, gdyż wszystkie sygnały muszą znajdować się w tej samej płaszczyźnie ogniskowania, aby można było je zmierzyć. Test t można zastosować tylko wtedy, gdy dane mają rozkład normalny, natomiast test suma rang Manna-Whitneya pozwala na porównanie zbiorów danych, które nie wykazują rozkładu normalnego. W teście t porównuje się średnie z dwóch różnych zbiorów danych, podczas gdy w teście suma rang Manna-Whitneya porównuje się mediany.

5. Reprezentatywne wyniki

Szczep PJ1185:(h⁺ his7⁺::dis1placR-GFP Chr1[::ura4⁺ hphMX6 lacO] sid4-mRFP::kanMX6 cut11-mCherry::natMX6 ura4-D18 leu1-32 ade6-DN/N ) hodowano w pożywce EMM. Pobrano próbkę i umieszczono ją w małej komorze wzrostowej, a następnie wykonano zdjęcia (Rys. 1A +N). Następnie podłoże wzrostowe zastąpiono pożywką EMM bez chlorku amonu (EMM-N) i hodowano komórki przez 15 minut przy wstrząsaniu. Komórki poddane deprywacji azotu umieszczono następnie w komorze wzrostowej z EMM-N i wykonano zdjęcia (Rys. 1A -N). Do pomiaru odległości między locus (GFP) a SPB wykorzystano narzędzie pomiarowe (Rys. 1B i Tabela 1). Dodatkowo zmierzono odległość między locus (GFP) a NM (Rys. 1B i Tabela 2). Mediany odległości wewnątrzkomórkowych przed i po usunięciu azotu porównano za pomocą oprogramowania SigmaStat-3.5 (Tabela 3). Odnotowano statystycznie istotną zmianę lokalizacji klastra genów, który przemieścił się z NM w stronę SBP. Dane dotyczące odległości między GFP a SBP miały rozkład normalny, zatem średnie odległości (1,777 μm +N oraz 1,587 μm -N) można było porównać za pomocą testu t (Tabela 1 i 3). Stwierdzono istotną różnicę między dwiema wartościami średnimi (P = 0,008, test t). Dane dotyczące odległości między GFP a NM nie miały rozkładu normalnego, dlatego odległości medianowe (0 μm +N oraz 0,390 μm -N) porównano za pomocą testu sum rang Manna-Whitneya (Tabela 2 i 3). Stwierdzono istotną różnicę między dwiema wartościami medianowymi (P < 0,001, test sum rang Manna-Whitneya).

Rycina 1. Lokalizacja klastra genów nazwanego Chr1, znakowanego białkiem GFP, uległa zmianie po wprowadzeniu głodówki azotowej. (A) Lewa kolumna, +N, reprezentatywne jądro komórkowe komórki hodowanej w pożywce EMM; prawa kolumna, -N, reprezentatywne jądro komórkowe komórki hodowanej w pożywce EMM-N. Kolor zielony to sygnał GFP znakujący klaster Chr1, kolor czerwony to mRFP i mCherry znakujące odpowiednio SPB oraz błonę jądrową (NM). (B) To samo jądro komórkowe co w (A), ale z naniesionymi pomiarami odległości subnuklearnych; żółty: średnica jądra komórkowego, niebieski: odległość między SPB a sygnałem GFP oraz różowy: odległość między sygnałem GFP a błoną jądrową.

Tabela 1. Zmierzone odległości wewnątrzjądrowe w μm dla szczepu PJ1185 hodowanego w EMM. Pierwszy wiersz: średnica komórki (d), drugi wiersz: odległość między GFP a SPB, trzeci wiersz: odległość między GFP a NM.

Tabela 2. Zmierzone odległości podjądrowe w μm dla szczepu PJ1185 hodowanego w EMM-N. Pierwszy wiersz: średnica komórki (d), drugi wiersz: odległość między GFP a SPB, trzeci wiersz: odległość między GFP a NM.

Tabela 3. Statystyki opisowe obserwowanych odległości wewnątrzjądrowych w szczepie PJ1185 przed (+N) i po (-N) zagłodzeniu azotowym. Pierwszy wiersz: liczba zmierzonych komórek, drugi wiersz: średnica średnia (d), trzeci wiersz: średnica mediana (d), czwarty wiersz: średnia odległość między GFP a SPB, piąty wiersz: mediana odległości między GFP a NM.

Dyskusja

W ciągu ostatniej dekady obrazowanie żywych komórek w celu monitorowania zdarzeń komórkowych stało się coraz bardziej popularne. Zaczęło się od zastosowania zielonego białka fluorescencyjnego z meduzy Aequorea victoria, a obecnie dostępnych jest wiele różnych fluorochromów emitujących fluorescencję w szerokim spektrum, od cyjanowego (475 nm) do dalekiej czerwieni (648 nm) ¹¹. Jedną z głównych zalet obrazowania żywych komórek w stosunku do immunofluorescence jest fakt, że komórki nie są utrwalane formaldehydem ani traktowane etanolem/acetonem przed mikroskopią, co pozwala uniknąć możliwych artefaktów wynikających z procesu utrwalania. Ponadto obrazowanie żywych komórek daje możliwość śledzenia pojedynczych komórek i wykonywania zdjęć w częstych odstępach czasu podczas wielogodzinnej lub wielodniowej inkubacji, co umożliwia rejestrowanie filmów z przebiegu zdarzeń komórkowych ¹². Komórki ssacze mają tę zaletę, że są większe, o średnicach około 100 μm, w porównaniu do mniejszych komórek drożdży o średnicy około 3-4 μm. Z drugiej strony zaletą drożdży jest łatwo manipulowalny genom. Rekombinacja homologiczna zachodzi w drożdżach bardzo wydajnie i jest wykorzystywana do fuzji białek zainteresowania z różnymi fluorochromami ³. Co więcej, zastosowanie ukierunkowanej integracji sekwencji lacO i późniejsza ekspresja białka LacR-GFP pozwala na detekcję konkretnej części genomu w obrębie jądra komórkowego ². Wykorzystanie komórek S. pombe w mikroskopii ma dodatkowe zalety, ponieważ są to naturalne organizmy jednokomórkowe o krótkim czasie generacji, rosnące w niskokosztowych warunkach hodowli komórkowej. Ponadto S. pombe jest doskonałym eukariotycznym organizmem modelowym, ponieważ posiada geny homologiczne do genów metazoa.

Jednym z głównych ograniczeń tej techniki jest autofluorescencja komórek drożdży, która zakłóca detekcję właściwego sygnału. Problem ten można rozwiązać, stosując minimalne pożywki z glukozą sterylizowaną przez filtr zamiast autoklawowania. Dodatkowo komórki drożdży powinny być hodowane przez 2 dni w fazie logarytmicznej przed ich osadzeniem na preparacie. Przedstawiony tutaj protokół oferuje stosunkowo prostą, a jednocześnie ilościową metodę określania subkomórkowej lokalizacji białek w komórce drożdży. Ponadto, wykonując zdjęcia w różnych punktach czasowych, możemy śledzić zdarzenia komórkowe.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Lektyna	Sigma-Aldrich	L1395
Smar silikonowy	Dow Corning
Mikroskop skaningowy laserowy LSM 700	Carl Zeiss, Inc.	LSM 700	Można zastosować inny mikroskop konfokalny.
SigmaStat3.5	Statcon	SigmaStat3.5	Można wykorzystać dowolne oprogramowanie do analizy statystycznej.