Ilościowa analiza fluorescencyjna żywych komórek drożdży szczepowych przy użyciu mikroskopii

Podsumowanie

Drożdże szczapowe, Schizosaccharomyces pombe, stanowią dobry system modelowy do badania podstawowych procesów komórkowych. W niniejszej pracy opisujemy metodę ilościowej analizy żywych komórek drożdży szczapowych. W tym konkretnym doświadczeniu skupiamy się na organizacji genomu w obrębie jądra komórkowego, jednak metoda ta może być również wykorzystana do badania czynników cytozolowych.

Streszczenie

Obecnie dostępnych jest wiele technik mikroskopowych, które umożliwiają detekcję specyficznego białka wewnątrz komórki. W ciągu ostatniej dekady coraz popularniejsze stało się obrazowanie żywych komórek z wykorzystaniem fluorochromów, takich jak zielone białko fluorescencyjne (GFP), bezpośrednio przyłączonych do białka będącego przedmiotem zainteresowania ¹. Dzięki zastosowaniu GFP i podobnych fluorochromów w mikroskopie fluorescencyjnym można wykryć subkomórkową lokalizację i ruchy białek. Ponadto technika ta pozwala na badanie lokalizacji subjądrowej określonego regionu chromosomu. GFP zostaje połączone z białkiem represora Lac (LacR) i ektopowo wyeksponowane w komórce, do której w badanym regionie chromosomu wprowadzono tandemowe powtórzenia sekwencji lacO². Kompleks LacR-GFP zwiąże się z powtórzeniami lacO, a ten obszar genomu będzie widoczny jako zielona kropka w mikroskopie fluorescencyjnym. Drożdże są szczególnie odpowiednie do tego typu manipulacji, ponieważ rekombinacja homologiczna jest w nich bardzo wydajna, co umożliwia ukierunkowaną integrację powtórzeń lacO oraz zaprojektowanych białek fuzyjnych z GFP ³. W niniejszej pracy opisujemy ilościową metodę analizy żywych komórek drożdży rozszczepialnych. Dodatkowe protokoły analizy żywych komórek drożdży rozszczepialnych można znaleźć na przykład w instrukcji dotyczącej przygotowania filmu przedstawiającego zachowanie chromosomów podczas mejozy ⁴. W tym konkretnym eksperymencie skupiamy się na organizacji subjądrowej i tym, jak ulega ona zmianie podczas indukcji genów. Oznaczyliśmy klaster genów, nazwany Chr1, poprzez wprowadzenie miejsc wiązania lacO w sąsiedztwie genów. Klaster ten jest wzbogacony w geny, które są indukowane wczesną fazą głodzenia azotowego drożdży rozszczepialnych ⁵. W badanym szczepie błona jądrowa (NM) jest znakowana poprzez przyłączenie mCherry do białka NM Cut11, co daje czerwony sygnał fluorescencyjny. Białko Sid4 z ciała bieguna wrzeciona (SPB) jest połączone z czerwonym białkiem fluorescencyjnym (Sid4-mRFP) ⁶. W wegetatywnie rosnących komórkach drożdży centromery są zawsze przytwierdzone do SPB, które jest osadzone w NM ⁷. SPB jest identyfikowane jako duża, okrągła struktura w NM. Poprzez obrazowanie przed i 20 minut po usunięciu źródła azotu możemy wyznaczyć odległość między klastrem genów (GFP) a NM/SPB. Porównując średnie lub mediany odległości przed i po usunięciu azotu, możemy ilościowo określić, czy po usunięciu azotu następuje zmiana lokalizacji subkomórkowej klastra genów.

Protokół

1. Hodowla drożdży szczelinowych

1. Przygotować minimalne podłoże edynburskie (EMM) oraz EMM bez chlorku amonu (EMM-N) ⁸. Aby zredukować autofluorescencję, roztwór glukozy nie powinien być autoklawowany, lecz sterylizowany przez filtr o porach 0,2 μm, a następnie dodany do autoklawowanego podłoża.
2. Zaszczepić komórki drożdży szczelinowych, świeżo wyhodowane na płytce agarowej z bogatym podłożem YEA ⁸, w 3 mL ciekłego podłoża EMM z glukozą sterylizowaną przez filtr. Należy użyć probówek o pojemności 13 mL z lekko nasadzoną zakrętką, aby zapewnić odpowiednią wentylację komórek. Hodować komórki, wstrząsając je z prędkością 225 rpm w temperaturze 30 °C. Przez 2 dni utrzymywać komórki w fazie wzrostu logarytmicznego (1 X 10⁶ - 2 X 10⁷ cells / mL), kontrolując ich liczbę każdego ranka i wieczora za pomocą komory Bürkera, a następnie stosując odpowiednie rozcieńczenie.
3. W dniu eksperymentu upewnić się, że komórki znajdują się we wczesnej fazie logarytmicznej, w stężeniu 5 X 10⁶ - 1 X 10⁷ cells / mL.
4. Aby poddać komórki 20-minutowemu głodzeniu azotowemu, należy zmienić podłoże z EMM na EMM-N. W tym celu zebrać 3 ml hodowli do probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 mL w wirówce laboratoryjnej przy maksymalnej sile 1,5 rcf, ponieważ wirowanie z większą prędkością może wywołać odpowiedź stresową u drożdży szczelinowych ⁹. Zastosować technikę podwójnego wirowania: najpierw wirować przez 2 min, następnie obrócić probówkę Eppendorfa o 180° i ponownie wirować przy 1,5 rcf przez 2 min ¹⁰. Pomaga to zebrać wszystkie komórki w jednym osadzie na dnie probówki. Przemyć raz podłożem EMM-N, a następnie resuspender osad w EMM-N i inkubować komórki przez 15 minut w 30 °C przy wstrząsaniu z prędkością 225 rpm, po czym przejść do punktu 2: Przygotowanie próbek.

2. Przygotowanie próbek

1. Zwiaduj 1,5 mL komórek w probówce Eppendorfa o pojemności 1,5 mL w wirówce naktowej przy maksymalnej sile odśrodkowej 1,5 rcf, ponieważ wirowanie z większą prędkością może wywołać odpowiedź stresową u drożdży szczapowych ⁹. Zastosuj technikę podwójnego wirowania, polegającą na tym, że najpierw wiruje się przez 2 min, następnie obraca probówkę Eppendorfa o 180° i ponownie wiruje przy 1,5 rcf przez 2 min ¹⁰. Pomaga to zebrać wszystkie komórki w jednym osadzie na dnie probówki.
2. Usuń nadsącz, pozostawiając 10-15 μL, i resuspenduj komórki w pozostałym medium. Alternatywnie dodaj 10 μL świeżego medium, aby resuspendować osad komórkowy.
3. Upewnij się, że dysponujesz czystymi szkiełkami przedmiotowymi i szkiełkami nakrywkami (Nr 1,5). Zazwyczaj nie trzeba ich myć, ale upewnij się, że nie są zakurzone.
4. Wyjmij z zamrażarki alikwot roztworu zapasowego lektyny o stężeniu 1mg/mL, który został wysterylizowany przez filtrowanie. Roztwór lektyny można zamrażać i rozmrażać kilka razy. Lektyna służy do unieruchomienia komórek drożdży na szkiełku nakrywce.
5. Nanieś 5 μL medium EMM z wysterylizowaną przez filtrowanie glukozą na szkiełko przedmiotowe.
6. Nanieś 5 μL roztworu lektyny w narożnik szkiełka nakrywki. Następnie nanieś 5 μL kultury komórkowej w ten sam narożnik, tj. do kropli lektyny. Wymieszaj pipetując kilka razy, a następnie rozprowadź mieszaninę kultury komórkowej i lektyny po całym szkiełku nakrywce, używając długiej strony końcówki pipety. W zależności od gęstości mieszaniny komórkowej pozostaw wszystko lub odessij nadmiar cieczy z przeciwległego narożnika szkiełka nakrywki.
7. Ułóż szkiełko nakrywkę stroną górną do góry, tak aby jedna krawędź spoczywała na szkiełku przedmiotowym, a druga na blacie. Pozostaw szkiełko nakrywkę do lekkiego podeschnięcia przez kilka minut. Absolutnie nie powinno być całkowicie suche, ale na szkle nie powinno znajdować się zbyt dużo cieczy.
8. Ustaw szkiełko nakrywkę pod kątem około 70° względem szkiełka przedmiotowego przy kropli EMM. Puść szkiełko nakrywkę tak, aby opadło stroną górną do kropli EMM.
9. Aby uszczelnić krawędzie smarem silikonowym, przygotuj strzykawkę 2 mL. Odetnij szeroki koniec końcówki 200 μl i przymocuj ją do strzykawki. Napełnij strzykawkę około 1 mL smaru silikonowego. Cienką linią silikonu należy pokryć krawędzie szkiełka nakrywki, delikatnie naciskając tłok strzykawki. W ten sposób otrzymasz małą komorę wzrostu komórek S. pombe.

3. Mikroskopia

1. Przygotuj mikroskop fluorescencyjny, włączając lampę rtęciową/ksenonową, mikroskop oraz komputer. Umieść komorę wzrostową drożdży w mikroskopie fluorescencyjnym. Użyj obiektywu 63 X lub obiektywu 100 X z NA=1.3 lub wyższym. W przypadku użycia obiektywu olejowego, nanieś olej.
2. Użyj jasnego pola, aby zlokalizować komórki i uzyskać ostry obraz.
3. Ustawienia mikroskopii fluorescencyjnej różnią się w zależności od fluorochromów użytych do znakowania komórek drożdży oraz od rodzaju mikroskopu. Używamy konfokalnego mikroskopu skaningowego Zeiss LSM 700 z obiektywem olejowym Plan-Apochromat 63x (NA=1.4) z ustawieniem średniej z 16 linii skanowania płaszczyzny. Pinhole powinien być ustawiony na 1-1.1 jednostek Airy, co daje przekrój optyczny 0.8 mm. GFP wykrywamy w Kanale 1, używając zestawu filtrów dla Alexa 488 z dzielnikiem wiązki przy 582 nm, wykrywając tym samym długości fal między 488 a 582 nm. W Kanale 2 używamy zestawu filtrów optymalnych dla mCherry z dzielnikiem wiązki przy 578 nm, wykrywając długości fal między 578 a 600 nm. Oznacza to, że w Kanale 2 będą wykrywane zarówno mRFP (SPB), jak i NM (mCherry).
4. Wykonaj tyle zdjęć, ile jest konieczne do przeprowadzenia pomiarów w 60 różnych komórkach dla każdego szczepu. Zazwyczaj wystarcza 15 zdjęć niezależnych pól widzenia. Zaleca się przygotowanie nowej komory wzrostowej ze świeżymi komórkami, jeśli czas mikroskopii przekroczy 60 minut.

4. Ilościowy pomiar odległości subkomórkowych

1. Otwórz obrazy w programie Zeiss Zen Light Edition. Za pomocą narzędzia pomiarowego zmierz odległość w μm pomiędzy różnymi fluorochromami we wszystkich komórkach, w których wszystkie sygnały znajdują się w tej samej płaszczyźnie ogniskowania. Dostosuj intensywność światła i kontrast, aby zidentyfikować środek sygnału fluorescencyjnego. Ten uproszczony protokół wykorzystuje tylko dwa różne kolory, w związku z czym SPB i NM znajdują się w tym samym kanale. SPB można wyróżnić po dużej, okrągłej strukturze wewnątrz NM. Przenieś wyniki pomiarów odległości do notatnika. Wykonaj pomiary w co najmniej 60 komórkach. Do pomiaru odległości można użyć innych programów, takich jak ImageJ, jednak preferowany jest Zeiss Zen Light ze względu na wyższą rozdzielczość obrazu oraz łatwość przybliżania i oddalania widoku. Obrazy w formacie lsm otwarte w ImageJ będą miały oba kanały nałożone na siebie. Aby uzyskać obraz z oboma kanałami, należy najpierw rozdzielić oba kanały, a następnie je połączyć. Następnie można użyć narzędzia linii do pomiaru odległości w opisany wyżej sposób.
2. Porównaj średnie lub mediany odległości subkomórkowych pomiędzy różnymi szczepami i wariantami traktowania za pomocą programu statystycznego, na przykład stosując test t lub test suma rang Manna-Whitneya, np. przy użyciu oprogramowania SigmaStat-3.5. Często dane nie mają rozkładu normalnego, ponieważ występuje selekcja komórek z krótszymi odległościami między sygnałami fluorescencyjnymi, gdyż wszystkie sygnały muszą znajdować się w tej samej płaszczyźnie ogniskowania, aby można było je zmierzyć. Test t można zastosować tylko wtedy, gdy dane mają rozkład normalny, podczas gdy test suma rang Manna-Whitneya umożliwia porównanie zestawów danych, które nie wykazują rozkładu normalnego. W teście t porównuje się średnie dwóch różnych zestawów danych, natomiast w teście suma rang Manna-Whitneya porównuje się mediany.

5. Reprezentatywne wyniki

Szczep PJ1185:(h⁺ his7⁺::dis1placR-GFP Chr1[::ura4⁺ hphMX6 lacO] sid4-mRFP::kanMX6 cut11-mCherry::natMX6 ura4-D18 leu1-32 ade6-DN/N ) hodowano w pożywce EMM. Pobrano próbkę, umieszczono ją w małej komorze wzrostowej i wykonano zdjęcia (Ryc. 1A +N). Następnie pożywkę wzrostową zastąpiono pożywką EMM bez chlorku amonu (EMM-N), a komórki hodowano przez 15 minut przy wytrząsaniu. Komórki poddane głodzeniu azotowemu umieszczono następnie w komorze wzrostowej z EMM-N i wykonano zdjęcia (Ryc. 1A -N). Za pomocą narzędzia pomiarowego zmierzono odległość między locus (GFP) a SPB (Ryc. 1B i Tabela 1). Dodatkowo zmierzono odległość między locus (GFP) a NM (Ryc. 1B i Tabela 2). Mediany odległości wewnątrzkomórkowych przed i po usunięciu azotu porównano przy użyciu oprogramowania SigmaStat-3.5 (Tabela 3). Odnotowano statystycznie istotne przesunięcie w lokalizacji klastra genów, który przemieścił się z NM w stronę SBP. Dane dotyczące odległości między GFP a SBP miały rozkład normalny, dlatego średnie odległości (1,777 μm +N i 1,587 μm -N) można było porównać za pomocą testu t (Tabela 1 i 3). Stwierdzono istotną różnicę między dwiema wartościami średnimi (P = 0,008, test t). Dane dotyczące odległości między GFP a NM nie miały rozkładu normalnego, dlatego odległości medianowe (0 μm +N i 0,390 μm -N) porównano za pomocą testu sum rang Manna-Whitneya (Tabela 2 i 3). Stwierdzono istotną różnicę między dwiema wartościami medianowymi (P < 0,001, test sum rang Manna-Whitneya).

Rysunek 1. Lokalizacja klastra genów nazwanego Chr1, oznakowanego GFP, uległa zmianie po głodzeniu azotowym. (A) Lewa kolumna, +N, reprezentatywne jądro komórkowe komórki hodowanej w EMM; prawa kolumna, -N, reprezentatywne jądro komórkowe komórki hodowanej w EMM-N. Kolor zielony oznacza sygnał GFP znakujący klaster Chr1, czerwony to mRFP i mCherry znakujące odpowiednio SPB oraz NM. (B) To samo jądro komórkowe co w (A), ale z pomiarami odległości wewnątrzjądrowych; żółty: średnica jądra komórkowego, niebieski: odległość między SPB a sygnałem GFP, a różowy: odległość między sygnałem GFP a błoną jądrową.

Tabela 1. Zmierzone odległości podjądrowe w μm dla szczepu PJ1185 hodowanego w EMM. Pierwszy wiersz: średnica komórki (d), drugi wiersz: odległość między GFP a SPB, trzeci wiersz: odległość między GFP a NM.

Tabela 2. Zmierzone odległości subnuklearne w μm dla szczepu PJ1185 hodowanego w EMM-N. Pierwszy wiersz: średnica komórki (d), drugi wiersz: odległość między GFP a SPB, trzeci wiersz: odległość między GFP a NM.

Tabela 3. Statystyki opisowe zaobserwowanych odległości wewnątrzjądrowych w szczepie PJ1185 przed (+N) i po (-N) głodzeniu azotowym. Pierwszy wiersz: liczba zmierzonych komórek, drugi wiersz: średnia średnica (d), trzeci wiersz: mediana średnicy (d), czwarty wiersz: średnia odległość między GFP a SPB, piąty wiersz: mediana odległości między GFP a NM.

Dyskusja

W ciągu ostatniej dekady obrazowanie żywych komórek w celu monitorowania zdarzeń komórkowych stało się coraz bardziej popularne. Zaczęło się od zastosowania zielonego białka fluorescencyjnego z meduzy Aequorea victoria, a obecnie dostępnych jest wiele różnych fluorochromów emitujących fluorescencję w szerokim spektrum, od cyjanowego (475 nm) do dalekiej czerwieni (648 nm) ¹¹. Jedną z głównych zalet obrazowania żywych komórek w stosunku do immunofluorescence jest fakt, że komórki nie są utrwalane formaldehydem ani traktowane etanolem/acetonem przed mikroskopią, co pozwala uniknąć możliwych artefaktów wynikających z procesu utrwalania. Ponadto obrazowanie żywych komórek daje możliwość śledzenia pojedynczych komórek i wykonywania zdjęć w częstych odstępach czasu podczas wielogodzinnej lub wielodniowej inkubacji, co umożliwia rejestrowanie filmów z przebiegu zdarzeń komórkowych ¹². Komórki ssacze mają tę zaletę, że są większe, o średnicach około 100 μm, w porównaniu do mniejszych komórek drożdży o średnicy około 3-4 μm. Z drugiej strony zaletą drożdży jest łatwo manipulowalny genom. Rekombinacja homologiczna zachodzi w drożdżach bardzo wydajnie i jest wykorzystywana do fuzji białek zainteresowania z różnymi fluorochromami ³. Co więcej, zastosowanie ukierunkowanej integracji sekwencji lacO i późniejsza ekspresja białka LacR-GFP pozwala na detekcję konkretnej części genomu w obrębie jądra komórkowego ². Wykorzystanie komórek S. pombe w mikroskopii ma dodatkowe zalety, ponieważ są to naturalne organizmy jednokomórkowe o krótkim czasie generacji, rosnące w niskokosztowych warunkach hodowli komórkowej. Ponadto S. pombe jest doskonałym eukariotycznym organizmem modelowym, ponieważ posiada geny homologiczne do genów metazoa.

Jednym z głównych ograniczeń tej techniki jest autofluorescencja komórek drożdży, która zakłóca detekcję właściwego sygnału. Problem ten można rozwiązać, stosując minimalne pożywki z glukozą sterylizowaną przez filtr zamiast autoklawowania. Dodatkowo komórki drożdży powinny być hodowane przez 2 dni w fazie logarytmicznej przed ich osadzeniem na preparacie. Przedstawiony tutaj protokół oferuje stosunkowo prostą, a jednocześnie ilościową metodę określania subkomórkowej lokalizacji białek w komórce drożdży. Ponadto, wykonując zdjęcia w różnych punktach czasowych, możemy śledzić zdarzenia komórkowe.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Lektyna	Sigma-Aldrich	L1395
Smar silikonowy	Dow Corning
Mikroskop skaningowy laserowy LSM 700	Carl Zeiss, Inc.	LSM 700	Można zastosować inny mikroskop konfokalny.
SigmaStat3.5	Statcon	SigmaStat3.5	Można wykorzystać dowolne oprogramowanie do analizy statystycznej.