Ilościowa analiza pod mikroskopią fluorescencyjną żywych komórek drożdży rozszczepieniowych

Summary

Drożdże rozszczepienia, Schizosaccharomyces pombe, są dobrym modelowym systemem do badania podstawowych procesów komórkowych. W tym miejscu opisujemy metodę przeprowadzania ilościowej analizy żywych komórek drożdży rozszczepialnych. W tym konkretnym eksperymencie skupiamy się na organizacji genomu w jądrze komórkowym, ale metoda może być również wykorzystana do badania czynników cytozolowych.

Abstract

Obecnie dostępnych jest kilka technik mikroskopowych, które mogą wykryć określone białko w komórce. W ciągu ostatniej dekady coraz popularniejsze stawało się obrazowanie żywych komórek przy użyciu fluorochromów, takich jak zielone białko fluorescencyjne (GFP), bezpośrednio przyłączone do białka będącego przedmiotem ^{zainteresowania1.} Za pomocą GFP i podobnych fluorochromów można wykryć subkomórkowe lokalizacje i ruchy białek w mikroskopie fluorescencyjnym. Co więcej, za pomocą tej techniki można również badać subjądrową lokalizację pewnego regionu chromosomu. GFP jest połączony z białkiem represorowym Lac (LacR) i ulega ektopowej ekspresji w komórce, w której tandemowe powtórzenia sekwencji lacO zostały wstawione do obszaru zainteresowania na chromosomie². LacR-GFP zwiąże się z powtórzeniami lacO i ten obszar genomu będzie widoczny jako zielona kropka w mikroskopie fluorescencyjnym. Drożdże są szczególnie odpowiednie do tego typu manipulacji, ponieważ rekombinacja homologiczna jest bardzo wydajna, a tym samym umożliwia ukierunkowaną integrację powtórzeń lacO i zmodyfikowanych białek fuzyjnych z GFP ³. Tutaj opisujemy ilościową metodę analizy żywych komórek drożdży rozszczepialnych. Można znaleźć dodatkowe protokoły analizy żywych komórek drożdży rozszczepialnych, na przykład na temat tego, jak nakręcić film przedstawiający mejotyczne zachowanie chromosomów ⁴. W tym konkretnym eksperymencie skupiamy się na organizacji subjądrowej i jej wpływie podczas indukcji genów. Oznaczyliśmy klaster genów o nazwie Chr1 poprzez wprowadzenie miejsc wiązania lacO w pobliżu genów. Klaster genów jest wzbogacony o geny, które są indukowane wcześnie podczas głodu azotu drożdży rozszczepieniowych ⁵. W szczepie błona jądrowa (NM) jest znakowana przez przyłączenie mCherry do białka NM Cut11, co powoduje powstanie czerwonego sygnału fluorescencyjnego. Związek Sid4 korpusu wrzeciona (SPB) jest połączony z białkiem czerwonej fluorescencji (Sid4-mRFP) ⁶. W wegetatywnie rosnących komórkach drożdży centromery są zawsze przyłączone do SPB, który jest osadzony w NM ⁷. SPB jest identyfikowany jako duża okrągła struktura w NM. Poprzez obrazowanie przed i 20 minut po wyczerpaniu źródła azotu możemy określić odległość między klastrem genów (GFP) a NM/SPB. Porównuje się średnie lub mediany odległości przed i po wyczerpaniu azotu, dzięki czemu możemy określić ilościowo, czy po wyczerpaniu azotu następuje zmiana w subkomórkowej lokalizacji klastra genów.

Protocol

1. Kultura drożdży rozszczepieniowych

1. Przygotuj pożywkę Edinburgh Minimal (EMM) i EMM bez chlorku amonu (EMM-N) ⁸. Aby zmniejszyć autofluorescencję, roztwór glukozy nie powinien być sterylizowany w autoklawie, ale zamiast tego należy go przefiltrować, wysterylizować za pomocą filtra 0,2 μm, a następnie dodać do autoklawowanych pożywek.
2. Zaszczepić komórki drożdży rozszczepialnych świeżo wyhodowane na płytce agarowej pożywką wzbogaconą YEA ⁸ w 3 ml płynnych pożywek EMM z filtrem sterylizowanej glukozy. Używaj probówek o pojemności 13 ml z lekko wciśniętą nakrętką, aby zapewnić dobrą wentylację komórek. Pozwól komórkom rosnąć, potrząsając nimi z prędkością 225 obr./min w temperaturze 30 °C. Utrzymuj komórki rosnące w fazie logarytmicznej (1 X 10⁶ - 2 X 10⁷ komórek / ml) przez 2 dni, licząc je przy użyciu komory Burkera, a następnie odpowiednio rozcieńczając, codziennie rano i wieczorem.
3. W dniu eksperymentu upewnij się, że masz komórki we wczesnej fazie logarytmicznej, 5 X 10⁶ - 1 X 10⁷ komórek / ml.
4. Aby pozbawić komórki azotu w ciągu 20 minut, zmień pożywkę z EMM na pożywkę EMM-N. Odbywa się to poprzez zebranie 3 ml komórek z probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 ml w wirówce stołowej przy maksymalnej wartości 1,5 rcf, ponieważ wirowanie z większą prędkością może wywołać reakcję stresową u drożdży rozszczepialnych ⁹. Użyj techniki podwójnego wirowania, co oznacza; najpierw wirować przez 2 minuty, następnie obrócić rurkę Eppendorfa o 180° i ponownie wirować przez 1,5 rcf 2 min ¹⁰. Pomaga to zebrać wszystkie komórki w jednym granulku na dnie tuby. Przemyć raz preparatem EMM-N, a następnie rozpuścić osad w EMM-N i inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze 30 °C, wytrząsając z prędkością 225 obr./min, a następnie przejść do punktu 2. Przygotowanie próbki.

2. Przygotowanie próbki

1. Zbierz 1,5 ml komórek w probówce Eppendorfa o pojemności 1,5 ml w wirówce stołowej przy maksymalnej prędkości 1,5 rcf, ponieważ wirowanie z większą prędkością może wywołać reakcję stresową u drożdży rozszczepialnych ⁹. Użyj techniki podwójnego wirowania, co oznacza; najpierw wirować przez 2 minuty, następnie obrócić rurkę Eppendorfa o 180° i ponownie wirować przez 1,5 rcf przez 2 ^{minuty 10}. Pomaga to zebrać wszystkie komórki w jednym granulku na dnie tuby.
2. Usunąć supernatant, ale pozostawić 10-15 μl i ponownie zawiesić komórki w pozostałym podłożu. Alternatywnie można dodać 10 μl świeżej pożywki, aby ponownie zawiesić osad komórkowy.
3. Upewnij się, że masz przezroczyste szkiełka podstawowe i szkło nakrywkowe (nr 1.5). Zwykle nie musisz ich czyścić, ale upewnij się, że nie są pełne kurzu.
4. Wyjąć z zamrażarki porcję roztworu podstawowego 1 mg/ml lektyny, która została wysterylizowana przez filtr. Roztwór lektyny można kilkakrotnie ponownie zamrozić. Lektyna służy do mocowania komórek drożdży na szkle nakrywkowym.
5. Umieścić 5 μl EMM z filtrem wysterylizowanej glukozy na szkiełku obiektywu.
6. Umieścić 5 μl roztworu lektyny w rogu szkła nakrywkowego. Następnie umieść 5 μl hodowli komórkowej w tym samym rogu, tj. w kropli lektyny. Wymieszać przez kilka razy, pipetując, a następnie rozprowadzić mieszaninę bakterii komórkowych i lektyny w szkle nakrywkowym, używając dłuższego boku końcówki pipety. W zależności od gęstości mieszaniny komórek, pozostaw wszystko lub zassaj nadmiar płynu w przeciwległym rogu szkła nakrywkowego.
7. Umieść szklankę nakrywkową, uzupełnioną do góry, jedną stroną na szkle obiektywu, a drugą stroną na stole. Pozostaw szklankę nakrywkową do wyschnięcia na kilka minut. Absolutnie nie powinien być całkowicie suchy, ale na szkle nie powinno być zbyt dużo płynu.
8. Umieść szkło nakrywkowe w odległości około 70° od szkła obiektywu za pomocą kropli EMM. Puść szklankę nakryciową tak, aby opadła od góry do dołu na kroplę EMM.
9. Aby uszczelnić krawędzie smarem silikonowym, przygotuj strzykawkę o pojemności 2 ml. Odciąć szeroki koniec końcówki o pojemności 200 μl i przymocować ją do strzykawki. Napełnić strzykawkę około 1 ml smaru silikonowego. Cienką linię silikonu nakłada się na krawędzie szkła nakrywkowego, delikatnie naciskając tłok strzykawki. Teraz masz małą komorę wzrostową komórek S. pombe.

3. Mikroskopia

1. Zainicjuj mikroskopię fluorescencyjną, włączając lampę rtęciową/ksenonową, mikroskop i komputer. Umieść komorę wzrostu drożdży w mikroskopie fluorescencyjnym. Użyj obiektywu 63X lub 100X z NA=1.3 lub wyższym. Jeśli używany jest obiektyw olejowy, dodaj olej.
2. Użyj jasnego pola, aby znaleźć komórki i uzyskać ostry obraz.
3. Ustawienia mikroskopii fluorescencyjnej różnią się w zależności od fluorochromów używanych do znakowania komórek drożdży i mikroskopu. Używamy mikroskopu konfokalnego Zeiss LSM 700 Laserowy mikroskop skaningowy z planapochromatyczną soczewką obiektywu olejowego 63x (NA=1,4) z 16-liniowym ustawieniem średniego skanowania płaszczyzny. Otworek powinien być ustawiony na 1-1,1 jednostki Airy, co daje wycinek optyczny 0,8 mm. Wykrywamy GFP na ścieżce 1 za pomocą zestawu filtrów dla Alexa 488 z rozdzielaczem wiązki przy 582 nm, wykrywając w ten sposób długości fal od 488 do 582 nm. W ścieżce 2 używamy optymalnego dla mCherry zestawu filtrów wykorzystującego rozdzielacz wiązki o długości fali 578 nm, wykrywając w ten sposób długości fal od 578 do 600 nm. Oznacza to, że na ścieżce 2 zostanie wykryty zarówno mRFP (SPB), jak i NM (mCherry).
4. Zrób tyle zdjęć, ile potrzeba, aby móc zmierzyć w 60 różnych komórkach dla każdego szczepu. Zazwyczaj wystarczy 15 zdjęć niezależnych pól mikroskopowych. Zaleca się wykonanie nowej komory wzrostowej ze świeżymi komórkami, jeśli czas mikroskopii przekracza 60 minut.

4. Ilościowy pomiar odległości subkomórkowych

1. Otwórz zdjęcia w programie Zeiss Zen Light Edition. Za pomocą narzędzia pomiarowego zmierz odległość w μm między różnymi fluorochromami we wszystkich komórkach, w których wszystkie sygnały znajdują się w tej samej płaszczyźnie ogniskowej. Dostosuj natężenie światła i kontrast, aby zidentyfikować środek sygnału fluorescencyjnego. Ten uproszczony protokół wykorzystuje tylko dwa różne kolory, a zatem SPB i NM są w tym samym kanale. SPB wyróżnia się dużą okrągłą strukturą w NM. Przenieś odległości na arkusz notatnika. Zmierz w co najmniej 60 komórkach. Inne programy, takie jak ImageJ, mogą być również używane do pomiaru odległości, ale Zeiss Zen Light jest preferowany ze względu na wyższą rozdzielczość obrazu i łatwość powiększania i pomniejszania za pomocą tego programu. Zdjęcia w formacie lsm otwarte w ImageJ będą miały dwa kanały nałożone na siebie. Aby zrobić obraz z obydwoma kanałami, najpierw podziel dwa kanały, a następnie je połącz. Następnie narzędzie liniowe może być używane do mierzenia odległości, jak opisano powyżej.
2. Porównaj średnie lub medianę odległości subkomórkowych między różnymi szczepami i zabiegami za pomocą programu statystycznego, na przykład testu t lub testu sumy rang Manna-Whitneya, na przykład za pomocą oprogramowania SigmaStat-3.5. Często dane nie są rozkładane normalnie, ponieważ będzie wybór komórek o krótszych odległościach między sygnałami fluorescencyjnymi, ponieważ wszystkie sygnały muszą znajdować się w tej samej płaszczyźnie ogniskowej, aby można było je zmierzyć. Test t może być używany tylko wtedy, gdy dane mają rozkład normalny, podczas gdy test sumy rang Manna-Whitneya umożliwia porównanie zestawów danych, które nie mają rozkładu normalnego. W teście t porównuje się średnią z dwóch różnych zestawów danych, natomiast w teście sumy rang Manna-Whitneya porównuje się medianę.

5. Reprezentatywne wyniki

Szczep PJ1185:(h⁺ his7⁺::dis1placR-GFP Chr1[::ura4⁺ hphMX6 lacO] sid4-mRFP::kanMX6 cut11-mCherry::natMX6 ura4-D18 leu1-32 ade6-DN/N ) był uprawiany w EMM. Próbkę pobrano i umieszczono w małej komorze wzrostowej, a następnie wykonano zdjęcia (ryc. 1A + N). Następnie pożywkę wzrostową zastąpiono EMM bez chlorku amonu (EMM-N), a komórki hodowano przez 15 minut podczas wstrząsania. Komórki pozbawione azotu umieszczono następnie w komorze wzrostowej z EMM-N i wykonano zdjęcia (ryc. 1A -N). Przyrząd pomiarowy posłużył do pomiaru odległości między locus (GFP) a SPB (rys. 1B i tabela 1). Ponadto zmierzono odległość między locus (GFP) a NM (ryc. 1B i tab. 2). Medianę odległości subkomórkowych przed i po wyczerpaniu azotu porównano za pomocą oprogramowania SigmaStat-3.5 (Tabela 3). Stwierdzono statystycznie istotną zmianę w lokalizacji klastra genów oddalającego się od NM w kierunku SBP. Dane mierzące odległość między GFP a SBP miały rozkład normalny, a zatem średnie odległości (1,777 μm + N i 1,587 μm -N) można było porównać za pomocą testu t (tabele 1 i 3). Stwierdzono istotną różnicę między dwiema średnimi wartościami (P = 0,008, test t). Dane mierzące odległość między GFP a NM nie miały rozkładu normalnego, w związku z czym mediany odległości (0 μm + N i 0,390 μm -N) porównano za pomocą testu sumy rang Manna-Whitneya (tabela 2 i 3). Stwierdzono istotną różnicę między dwiema medianami (P < 0,001, test sumy rang Manna-Whitneya).

Rysunek 1. Lokalizacja klastra genów o nazwie Chr1, oznaczonego przez GFP, zmieniła się po głodzie azotu. (A) Lewa kolumna, +N, reprezentatywne jądro komórkowe z komórki hodowanej w prawej kolumnie EMM, -N, reprezentatywne jądro komórkowe z komórki hodowanej w EMM-N. Kolor zielony to sygnał GFP oznaczający klaster Chr1, czerwony to mRFP i mCherry oznaczający odpowiednio SPB i NM. (B) To samo jądro komórkowe co (A), ale teraz z zmierzonymi odległościami subjądrowymi; żółty: średnica jądra komórkowego, niebieski: odległość między sygnałem SPB i GFP, a różowy: odległość między sygnałem GFP a błoną jądrową.

Tabela 1. Zmierzone odległości subjądrowe w μm szczepu PJ1185 wyhodowanego w EMM. Pierwszy wiersz, średnica komórki (d), drugi wiersz, odległość między GFP a SPB, trzeci rząd, odległość między GFP a NM.

Tabela 2. Zmierzone odległości subjądrowe w μm szczepu PJ1185 wyhodowanego w EMM-N. Pierwszy wiersz, średnica komórki (d), drugi wiersz, odległość między GFP a SPB, trzeci rząd, odległość między GFP a NM.

Tabela 3. Statystyki opisowe obserwowanych odległości subjądrowych w szczepie PJ1185 przed (+N) i po (-N) głodzie azotu. Pierwszy wiersz: liczba mierzonych komórek, drugi wiersz: średnia średnica (d), trzeci wiersz: mediana średnicy (d), czwarty wiersz: średnia odległość między GFP a SPB, piąty wiersz: mediana odległości między GFP a NM.

Discussion

W ciągu ostatniej dekady coraz bardziej popularne stawało się obrazowanie żywych komórek do monitorowania zdarzeń komórkowych. Zaczęło się od użycia białka zielonej fluorescencji z meduzy Aequorea victoria , a obecnie dostępnych jest wiele różnych fluorochromów emitujących fluorescencję w szerokim spektrum od cyjanu (475 nm) do dalekiej czerwieni (648 nm) ¹¹. Jedną z głównych zalet obrazowania żywych komórek w porównaniu z immunofluorescencją jest to, że komórki nie są utrwalane przez formaldehyd lub obróbkę etanolem/acetonem przed mikroskopią, co pozwala uniknąć możliwych artefaktów z procesu utrwalania. Ponadto obrazowanie żywych komórek daje możliwość śledzenia poszczególnych komórek i robienia zdjęć w częstych odstępach czasu w ciągu godzin lub dni inkubacji, co umożliwia uzyskanie filmów ze zdarzeń komórkowych ¹². Komórki ssaków mają tę zaletę, że mają większy rozmiar, o średnicy około 100 μm, w porównaniu z mniejszymi komórkami drożdży o średnicy około 3-4 μm. Z drugiej strony zaletą drożdży jest to, że genom jest łatwy do manipulowania. Rekombinacja homologiczna zachodzi bardzo efektywnie w drożdżach i służy do fuzji białek będących przedmiotem zainteresowania z różnymi fluorochromami ³. Co więcej, zastosowanie ukierunkowanej integracji sekwencji lacO i późniejszej ekspresji białka LacR-GFP pozwala na wykrycie określonej części genomu w jądrze komórkowym ². Wykorzystanie komórek S. pombe w mikroskopii ma dodatkowe zalety, ponieważ są to naturalne organizmy jednokomórkowe, które rosną z szybkim czasem generacji w tanich warunkach hodowli komórkowej. Co więcej, S. pombe jest doskonałym eukariotycznym organizmem modelowym, ponieważ ma geny homologiczne metazoanu.

Jednym z głównych ograniczeń tej techniki jest autofluorescencja w komórce drożdży, która zakłóca wykrywanie prawdziwego sygnału. Problem ten można rozwiązać, stosując minimalną pożywkę wzrostową z filtrem sterylizowanym glukozą zamiast autoklawowania. Ponadto komórki drożdży powinny być hodowane przez 2 dni w fazie logarytmicznej przed ich zamontowaniem. Przedstawiony tutaj protokół oferuje stosunkowo prostą, ale jednak ilościową metodę określania subkomórkowej lokalizacji białek w komórce drożdży. Co więcej, robiąc zdjęcia w różnych punktach czasowych, możemy śledzić wydarzenia komórkowe.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lectin	Sigma-Aldrich	L1395
Smar silikonowy	Dow Corning
Laserowy mikroskop skaningowy LSM 700	Carl Zeiss, Inc.	LSM 700	Można użyć innego mikroskopu konfokalnego.
SigmaStat3.5	Statcon	SigmaStat3.5	Można użyć dowolnego oprogramowania do analizy statystycznej.