Niniejszy manuskrypt opisuje trzy komplementarne protokoły służące do oceny toksyczności białek z ekspansją poliglutaminy (polyQ) w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Protokoły te można łatwo zmodyfikować w celu monitorowania toksyczności innych błędnie sfałdowanych białek w drożdżach.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Testy wzrostu do oceny toksyczności poliglutaminy w drożdżach
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Błędne fałdowanie białek wiąże się z wieloma chorobami ludzi, w szczególności z chorobami neurodegeneracyjnymi, takimi jak choroba Alzheimera, choroba Parkinsona i choroba Huntingtona 1. Choroba Huntingtona (HD) jest spowodowana nieprawidłową ekspansją regionu poliglutaminy (polyQ) w białku huntingtynie. Białko huntingtyna z ekspansją polyQ przyjmuje aberracyjną konformację (tj. ulega błędnemu fałdowaniu) i wywołuje toksyczność komórkową 2. Przynajmniej osiem kolejnych chorób neurodegeneracyjnych jest spowodowanych ekspansjami polyQ, w tym ataksje spinocerebellarne i choroba Kennedy'ego 3.
Organizm modelowy, jakim są drożdże, umożliwił uzyskanie istotnych informacji na temat komórkowych i molekularnych podstaw toksyczności polyQ, w tym wpływu wewnątrz- i międzycząsteczkowych czynników toksyczności polyQ oraz identyfikacji szlaków komórkowych, które ulegają upośledzeniu w komórkach ekspresujących białka z ekspansją polyQ 3-8. Co ważne, wiele aspektów toksyczności polyQ odkrytych u drożdży zostało odtworzonych w innych systemach eksperymentalnych oraz w pewnym stopniu w próbkach pobranych od pacjentów z chorobą Huntingtona, co dowodzi znaczenia modelu drożdżowego dla odkrywania podstawowych mechanizmów leżących u podstaw toksyczności polyQ.
Bezpośrednim i stosunkowo prostym sposobem określenia toksyczności polyQ w drożdżach jest pomiar zaburzeń wzrostu komórek drożdżowych wykazujących ekspresję białek z ekspansją polyQ. Niniejszy artykuł opisuje trzy komplementarne podejścia eksperymentalne służące do określania toksyczności polyQ w drożdżach poprzez pomiar wzrostu komórek drożdżowych wykazujących ekspresję białek z ekspansją polyQ. Pierwsze dwa podejścia eksperymentalne polegają na monitorowaniu wzrostu drożdży na płytkach, natomiast trzecie podejście polega na monitorowaniu wzrostu płynnych kultur drożdży przy użyciu urządzenia BioscreenC.
Ponadto niniejszy artykuł opisuje trudności eksperymentalne, które mogą wystąpić podczas pracy z drożdżowymi modelami polyQ, oraz przedstawia strategie pomagające uniknąć lub zminimalizować te problemy. Opisane tutaj protokoły mogą być wykorzystane do identyfikacji i charakteryzacji szlaków genetycznych oraz małych cząsteczek modulujących toksyczność polyQ. Co więcej, opisane testy mogą służyć jako wzorce do dokładnych analiz toksyczności wywołanej przez inne białka związane z chorobami, które ulegają błędnemu sfałdowaniu w modelach drożdżowych.
Protokół
1. Ekspresja toksycznych białek z ekspansją PolyQ w drożdżach
Analiza systematyczna pozwoliła na ustalenie dokładnej sekwencji aminokwasowej białka z ekspansją polyQ, która jest niezbędna do wywołania toksyczności w drożdżach 7. To toksyczne białko z ekspansją polyQ zawiera aminokońcowy znacznik FLAG, po którym następują 17 aminokwasów z oryginalnej sekwencji białka huntingtyny, region polyQ oraz karboksykońcowe połączenie z białkiem fluorescencyjnym (GFP lub CFP, patrz Rysunek 1 a). Ekspresja białek z ekspansjami polyQ obejmującymi 46 lub więcej glutamin (np. 72 i 103 glutaminy) wywołuje toksyczność w drożdżach, gdy są one wyrażane pod kontrolą indukowalnego i stosunkowo silnego promotora GAL1 7, 9.
Jak opisano wcześniej, toksyczność polyQ u drożdży jest widoczna tylko w komórkach zawierających białko Rnq1p w konformacji prionowej, [RNQ+], np. w szczepie drożdży W303 9. Toksyczne białko z ekspansją polyQ odtwarza kluczowe aspekty biologii polyQ u drożdży, takie jak zależna od długości polyQ toksyczność (patrz poniżej) oraz agregacja (Rycina 1 b). Co istotne, toksyczne białka z ekspansją polyQ nie zabijają komórek drożdży natychmiastowo; zamiast tego upośledzają lub zatrzymują cykl komórkowy i podział komórek, spowalniając lub hamując tym samym wzrost kolonii drożdży na płytkach lub w kulturach płynnych (nasze niepublikowane dane).
2. Potencjalne problemy z komórkami drożdży ekspresującymi toksyczne białka z ekspansją PolyQ
Komórki drożdży wykazujące ekspresję w przeciwnym razie toksycznych białek z ekspansją polyQ mogą nie wykazywać żadnych zaburzeń wzrostu 9. Genetyczna natura tych supresorów toksyczności polyQ nie wydaje się opierać na prostych mutacjach mendlowskich, w związku z czym mogą one występować z relatywnie wysoką częstotliwością (nasze nieopublikowane wyniki). Przypuszczamy, że te spontaniczne supresory są spowodowane eliminacją niezidentyfikowanych prionów, które działają podobnie do [RNQ+] w określaniu toksyczności polyQ. Te spontaniczne supresory toksyczności polyQ mogą zagrozić pomyślnemu wynikowi każdego eksperymentu mającego na celu charakterystykę toksyczności polyQ lub identyfikację i charakterystykę modyfikatorów toksyczności polyQ.
Aby uniknąć częstego występowania tych spontanicznych supresorów, należy przestrzegać opisanych poniżej środków ostrożności, które okazały się bardzo skuteczne:
- Do eksperymentów nad toksycznością należy używać świeżych komórek drożdży. Nie należy przechowywać drożdży przez dłuższy czas. Należy regularnie pobierać świeże kolonie drożdży z mrożonych zapasów.
- Należy często monitorować ekspresję i agregację toksycznych białek z ekspansją polyQ za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
- Przed rozpoczęciem jakichkolwiek pomiarów toksyczności komórki drożdży należy przez cały czas utrzymywać w pożywkach hamujących ekspresję toksycznych sekwencji polyQ (tj. w pożywkach selektywnych zawierających glukozę jako jedyne źródło węgla).
- Do każdego eksperymentu nad toksycznością polyQ należy użyć co najmniej trzech niezależnych transformantów.
3. Testy wzrostu
- Dla każdego warunku doświadczalnego zaszczep jedną kolonię z trzech niezależnych transformantów komórek drożdży zawierających toksyczne białko z ekspansją polyQ w 3 ml selektywnego podłoża dla drożdży z glukozą jako jedynym źródłem węgla.
- Inkubować te kultury przez noc w temperaturze 30 °C. W tych warunkach komórki nie wykazują ekspresji białka z ekspansją polyQ, ponieważ glukoza w podłożu hamuje ich ekspresję. Nie dopuścić do przerośnięcia kultur; utrzymać OD600 (absorbancja światła o długości fali 600 nm) kultur nocnych poniżej 1.
- W celu monitorowania wad wzrostu komórek drożdży wykazujących ekspresję toksycznego białka z ekspansją polyQ rutynowo stosujemy trzy różne testy:
3.1 Hodowla na płytkach
- Rozcieńczyć nocne hodowle drożdży (hodowane przy wytrząsaniu z prędkością 220 rpm) do poziomu OD600 wynoszącego 0,0005 (tj. rozcieńczenie 1:1000 hodowli o OD600 = 0,5) w pożywce selektywnej 7 zawierającej glukozę.
- Równomiernie rozprowadzić 50 μl (co daje ok. 700 kolonii na płytkę) każdej rozcieńczonej hodowli na jednej płytce (średnica 10 cm) z pożywką selektywną zawierającą glukozę jako jedyne źródło węgla oraz na jednej płytce z pożywką selektywną zawierającą galaktozę jako jedyne źródło węgla.
- Inkubować płytki przez trzy do czterech dni w temperaturze 30 °C. Po inkubacji wykonać zdjęcia każdej płytki i policzyć liczbę kolonii na płytkach z glukozą oraz liczbę kolonii na płytkach z galaktozą. W idealnych warunkach, przy użyciu komórek drożdży ekspresujących wysoce toksyczne białko z ekspansją polyQ (103Q, Ryc. 2a), na płytce z galaktozą nie powinno być kolonii lub powinno być ich bardzo mało.
3.2 Testy kropelkowe (spotting assays)
Ten test ma charakter bardziej ilościowy niż opisany powyżej test z wysiewem na płytki, dzięki czemu pozwala wykryć nawet subtelne różnice w toksyczności polyQ w ramach jednego eksperymentu na tej samej płytce.
- Rozcieńczyć hodowle nocne wyhodowane w medium z glukozą do OD600 wynoszącej 0.1.
- Pipetować 200 μl tych rozcieńczonych hodowli do sterylnych płytek 96-dołkowych i przygotować pięciokrotne rozcieńczenia seryjne w sterylnej wodzie przy użyciu pipety wielokanałowej.
- Za pomocą froggera (zwanego również spotterem, z 8 x 6 pinami do przenoszenia zawiesin komórkowych) przenieść zawiesiny komórkowe na płytki zawierające media selekcyjne z glukozą jako jedynym źródłem węgla oraz na płytki zawierające media selekcyjne z galaktozą jako jedynym źródłem węgla.
- Pozostawić płytki do wyschnięcia przed ich inkubacją w temperaturze 30 °C przez trzy do czterech dni.
- Po inkubacji wykonać zdjęcia każdej płytki (Ryc. 2b).
3.3. Monitorowanie toksyczności polyQ w drożdżach poprzez wzrost kultur w cieczy
Niniejszy protokół jest najbardziej ilościowy (wartości OD600) spośród trzech opisanych tutaj testów i pozwala nawet na wykrycie bardzo subtelnych różnic w toksyczności polyQ. Wspomniane wcześniej występowanie spontanicznych supresorów może jednak potencjalnie prowadzić do błędnych wyników. Dlatego zalecam połączenie tego testu z co najmniej jednym z dwóch opisanych powyżej testów wysiewowych. Do tych eksperymentów proponujemy użycie urządzenia BioscreenC. BioscreenC to instrument, który automatycznie mierzy gęstość optyczną kultur drożdży w płytkach 100-dołkowych podczas inkubacji w określonych temperaturach i przy zdefiniowanym wytrząsaniu. Można również zastosować inne metody hodowli komórek drożdży i pomiaru ich gęstości optycznej.
- Przemyć komórki drożdży z pożywki minimalnej zawierającej glukozę jako jedyne źródło węgla trzykrotnie w 3 ml sterylnej wody.
- Rozcieńczyć nocne kultury hodowane na pożywce z galaktozą do poziomu OD600 wynoszącego 0,1.
- Napełnić każdą dołek 100-dołkowej płytki BioscreenC 300 μl kultur drożdży.
- Otworzyć program Easy Bioscreen Experiment. Określić liczbę próbek do monitorowania (wliczając w to próbki ślepe i kontrole zawierające tylko pożywkę), ustawić temperaturę na 30 °C, czas trwania eksperymentów na 3 dni, odstępy między pomiarami na 15 minut, filtr na 600 nm /Brown oraz tryb wstrząsania na 15 sekund przed każdym pomiarem z umiarkowaną intensywnością.
- Urządzenie BioscreenC oraz dołączone oprogramowanie wygenerują arkusze Excel dla każdego punktu danych zarejestrowanego podczas eksperymentu.
- Przygotować w programie Excel krzywe wzrostu dla każdej próbki i porównać wzrost różnych próbek (Rysunek 2c). Szczegółowy opis analizy danych uzyskanych w eksperymentach BioscreenC został przedstawiony wcześniej 10.
4. Reprezentatywne wyniki
Rycina 1. Drożdżowy model polyQ. a) Schematyczne przedstawienie toksycznego białka z ekspansją polyQ. b) Mikroskopia fluorescencyjna przedstawiająca komórki drożdży wykazujące ekspresję krótkiego, nietoksycznego białka z ekspansją polyQ (25Q, panel lewy) oraz komórki drożdży wykazujące ekspresję długiego, toksycznego białka z ekspansją polyQ (103Q, panel prawy).
Rysunek 2. Reprezentatywne wyniki testów wzrostu komórek drożdży wykazujących ekspresję białek z ekspansją polyQ. a) Test wysiewu. Około 700 komórek drożdży wysiano na płytki i inkubowano przez trzy dni w temperaturze 30 °C. Górny panel przedstawia płytkę z podłożem glukozowym, tzn. ekspresja toksycznego białka z ekspansją polyQ (103Q) nie jest indukowana. Dolny panel przedstawia płytkę drożdży z podłożem galaktozowym, tzn. ekspresja toksycznego białka z ekspansją polyQ jest indukowana. Należy zauważyć, że w przedstawionym tutaj eksperymencie nie wystąpił spontaniczny supresor. b) Test kropelkowy (spotting assay). Pięć pięciokrotnych rozcieńczeń seryjnych komórek drożdży zawierających albo nietoksyczne białko polyQ (25Q), albo toksyczne białko z ekspansją polyQ (103Q) naniesiono kropelkowo na płytki glukozowe, które hamują ekspresję białek (lewy panel), lub na płytki galaktozowe, które indukują ich ekspresję. Płytki inkubowano następnie przez trzy dni w temperaturze 30 °C. c) Eksperyment BioscreenC. Wzrost kultur komórek drożdży wykazujących ekspresję albo nietoksycznego białka polyQ (25Q), albo toksycznego białka z ekspansją polyQ (103Q) monitorowano za pomocą instrumentu BioscreenC. Warunki eksperymentalne oraz analiza eksperymentów BioscreenC zostały opisane w tekście głównym.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Niniejszy artykuł przedstawia trzy komplementarne podejścia eksperymentalne do pomiaru toksyczności polyQ w organizmie modelowym, jakim są drożdże, w oparciu o zahamowanie wzrostu komórek drożdży ekspresujących toksyczne białka z ekspansją polyQ. Badania na drożdżach dostarczyły cennych informacji na temat podstawowych komórkowych i molekularnych mechanizmów błędnego zwijania białek i wynikającej z tego toksyczności, w tym błędnego zwijania i toksyczności białek z ekspansją polyQ 9,11,12. Eksperymenty oparte n...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono konfliktów interesów.
Podziękowania
Prace w laboratorium Duennwalda są wspierane przez granty z American Federation for Aging Research (AFAR), Hereditary Disease Foundation (HDF) oraz William Wood Foundation.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Frogger (6x8 pinów) | V&P Scientific | VP 407 AH | |
| BioscreenC | Growth Curves USA | 5101370 | |
| Płytki plastrem miodu 100-dołkowe | Growth Curves USA | 9602550 |
Bibliografia
- Soto, C., Estrada, L. D. Protein misfolding and neurodegeneration. Arch. Neurol. 65, 184-189 (2008).
- Ross, C. A., Tabrizi, S. J. Huntington's disease: from molecular pathogenesis to clinical treatment. Lancet Neurol. 10, 83-98 (2011).
- Zoghbi, H. Y., Orr, H. T. Glutamine repeats and neurodegeneration. Annu. Rev. Neurosci. 23, 217-247 (2000).
- Meriin, A. B. Endocytosis machinery is involved in aggregation of proteins with expanded polyglutamine domains. FASEB J. 21, 1915-1925 (2007).
- Giorgini, F., Guidetti, P., Nguyen, Q., Bennett, C. S., Muchowski, P. J. A genomic screen in yeast implicates kynurenine 3-monooxygenase as a therapeutic target for Huntington disease. Nat. Genet. 37, 526-5231 (2005).
- Duennwald, M. L., Lindquist, S. Impaired ERAD and ER stress are early and specific events in polyglutamine toxicity. Genes Dev. 22, 3308-3319 (2008).
- Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11045-1150 (2006).
- Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11051-116 (2006).
- Meriin, A. B. Huntington toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1. J. Cell. Biol. 157, 997-1004 (2002).
- Murakami, C., Kaeberlein, M. Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells. J. Vis. Exp. (27), e1156-e1156 (2009).
- Gitler, A. D. Beer and bread to brains and beyond: can yeast cells teach us about neurodegenerative disease. Neurosignals. 16, 52-62 (2008).
- Giorgini, F., Muchowski, P. J. Screening for genetic modifiers of amyloid toxicity in yeast. Methods Enzymol. 412, 201-222 (2006).
- Ehrnhoefer, D. E. Green tea (-)-epigallocatechin-gallate modulates early events in huntingtin misfolding and reduces toxicity in Huntington's disease models. Hum. Mol. Genet. 15, 2743-2751 (2006).
- Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104. J. Biol. Chem. 280, 23869-2375 (2005).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
