Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Dynamika dopaminy presynaptycznej w przekrojach mózgu w obrębie prążka z wykorzystaniem szybkiej woltamperometrii cyklicznej

21.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3464

⸱

12 stycznia 2012

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Wayne State University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Wykorzystanie szybkoskanującej woltamperometrii cyklicznej do pomiaru elektrycznie wywołanej dynamiki dopaminy presynaptycznej w skrawkach mózgowych prążkowia.

Streszczenie

Szeroko zakrojone badania skupiły się na neuroprzekaźniku dopaminie ze względu na jej znaczenie w mechanizmie działania substancji psychoaktywnych (np. kokainy i amfetaminy), rolę, jaką odgrywa w chorobach psychiatrycznych (np. schizofrenii i zespole nadpobudliwości z deficytem uwagi), oraz jej zaangażowanie w zaburzenia degeneracyjne, takie jak choroba Parkinsona i choroba Huntingtona. W normalnych warunkach fizjologicznych dopamina reguluje aktywność lokomotoryczną, funkcje poznawcze, uczenie się, afekt emocjonalny oraz wydzielanie hormonów neuroendokrynnych. Jedno z największych zagęszczeń neuronów dopaminergicznych znajduje się w prążkowiu, który można podzielić na dwa odrębne regiony neuroanatomiczne znane jako jądro półleżące oraz jądro ogoniaste i skorupa. Celem jest przedstawienie ogólnego protokołu szybkiej skaningowej woltamperometrii cyklicznej (FSCV) w plastrach prążkowia myszy. FSCV jest dobrze zdefiniowaną techniką elektrochemiczną, która umożliwia pomiar uwalniania i wychwytu dopaminy w czasie rzeczywistym w konkretnych regionach mózgu. W FSCV do wykrywania utleniania dopaminy stosuje się węglowe mikroelektrody włókniste (średnica ~ 7 μm). Przewagą analityczną zastosowania FSCV do wykrywania dopaminy jest zwiększona rozdzielczość czasowa wynosząca 100 milisekund oraz rozdzielczość przestrzenna poniżej dziesięciu mikronów, co dostarcza informacji uzupełniających względem mikrodializy in vivo.

Protokół

1. Podstawy eksperymentu

Wytwarzanie elektrod

  • Istnieje wiele metod wytwarzania mikroelektrod z włókna węglowego, ponieważ większość z nich jest produkowana wewnętrznie w laboratoriach. Zazwyczaj o szczegółach wykonania elektrody decyduje technika elektrochemiczna, która będzie stosowana (np. amperometria vs. FSCV). W przypadku FSCV mikroelektrody można wykonać w laboratorium, stosując poniższą procedurę składającą się z trzech kroków. Bardziej szczegółowy opis wytwarzania elektrod z włókna węglowego znajduje się w niedawnym artykule JoVE 1. Należy jednak zauważyć, że opisane poniżej elektrody są cylindrycznymi mikroelektrodami z włókna węglowego, których wykonanie wymaga mniej etapów niż w przypadku mikroelektrod amperometrycznych z włókna węglowego z wyżej wspomnianego protokołu. Ten uproszczony protokół nie wymaga gotowania włókna węglowego w acetonie, polerowania ogniem kapilar szklanych ani stosowania epoksydów do uszczelnienia złączenia szkło-włókno.
  • Za pomocą ssania próżniowego wciągnąć włókno węglowe (średnica 7 μm; Goodfellow Oakdale, PA) do kapilary z borokrztanu z mikrofilamentem (długość 10 cm, o.d. 1,2 mm, i.d. 0,68 mm; A-M systems, Carlsborg, WA).
  • Umieścić kapilarę z gwintem w wyciągaczu elektrod (Narishige, Tokyo, Japan), gdzie kapilara zostaje przeciągnięta w połowie. Ustawienia wyjściowe wyciągacza elektrod różnią się w zależności od laboratorium. Dla odniesienia, nasze ustawienia wyjściowe dla wyciągacza to 90,7 dla magnesu głównego, 23,2 dla submagnesu oraz 53,4 dla grzałki. Ustawienia wyjściowe powinny zostać doprecyzowane empirycznie, aby uzyskać stożek szklany o długości około 4,4 mm, z ciasnym uszczelnieniem wokół włókna węglowego.
  • Pod mikroskopem (Olympus, Tokyo, Japan) przyciąć włókno węglowe (używając ostrza skalpela) wystające z końcówki szklanej, pozostawiając około 50-200 μm włókna węglowego wystającego poza szczelny interfejs.

Przygotowanie roztworów

Należy wcześniej przygotować trzy rodzaje roztworów sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF), wszystkie w wodzie ultrapurej (18 MΩ cm).

  • Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy z sacharozą (sucrose-aCSF) można przygotować co najmniej jeden dzień przed wykonaniem plastrów. Bufor sucrose-aCSF składa się z (w mM): 180 sacharozy, 30 NaCl, 4,5 KCl, 1,0 MgCl2, 26 NaHCO3, 1,2 NaH2PO4 oraz 10 D-glukozy (pH 7,4) i powinien być natleniany mieszaniną 95% O2/5% CO2 przez 15 minut 2. W przypadku wcześniejszego przygotowania, roztwór można przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C do 1 tygodnia.
  • Roztwór aCSF do pomiarów woltamperometrycznych należy przygotować w dniu eksperymentu. Roztwór aCSF składa się z (w mM): 126 NaCl, 2,5 KCl, 2,4 CaCl2, 1,2 MgCl2, 25 NaHCO3, 1,2 NaH2PO4, 11 D-glukozy, 0,4 kwasu askorbinowego (pH 7,4). W trakcie eksperymentu natleniaj roztwór poprzez przesycanie mieszaniną 95% O2/5% CO2 w temperaturze pokojowej.
  • Modyfikowany roztwór aCSF do kalibracji elektrod zawiera (w mM): 2,5 KCl, 126 NaCl, 1,2 NaH2PO4, 2,4 CaCl2, 1,2 MgCl2 oraz 25 NaHCO3 (pH 7,4) i może być przechowywany do jednego tygodnia bez konieczności chłodzenia lub natleniania.

Kalibracja elektrody

  • Żywotność i czułość elektrody określa się odpowiednio poprzez kalibrację wstępną i końcową, wykorzystując przepływową „komorkę T” z 3 portami i uszczelnioną elektrodą odniesienia (Ag/AgCl). Wykonaną mikroelektrodę wprowadza się do przepływowej „komorki T”. Port wlotowy jest połączony z pompą strzykawkową, co umożliwia ciągły przepływ zmodyfikowanego aCSF z prędkością 2 mL/min. Trzeci port „komorki T” jest połączony ze strzykawką wypełnioną 3 μM dopaminy przygotowanej w zmodyfikowanym aCSF.
  • Aby przeprowadzić kalibrację wstępną, należy pozwolić na przepływ roztworu zmodyfikowanego aCSF przez około 3–7 sekund, a następnie ręcznie wstrzyknąć 1–2 mL standardu dopaminy o stężeniu 3 μM. Dla każdej elektrody poddawanej kalibracji wstępnej należy powtórzyć ten proces co najmniej 3 razy i obliczyć średnią z uzyskanych maksymalnych prądów.
  • Bezpośrednio po eksperymencie z woltamperometrii plastrów (patrz sekcja 3), elektrodę poddaje się kalibracji końcowej w ten sam sposób, który opisano powyżej.
  • Współczynnik kalibracji (wykorzystywany później podczas analizy danych) wyznacza się poprzez podzielenie średniego prądu utleniania dopaminy (nA) przez stężenie standardu dopaminy. Na przykład, przy użyciu standardu dopaminy 3 μM, odpowiedź prądową dzieli się przez 3.

2. Przygotowanie skrawków

  1. Wlej 10 mL sacharozowego aCSF do małego zlewka i umieść go w wiaderku z lodem. Dodatkowo umieść klej błyskawiczny (Loctite 404) w zasięgu ręki w wiaderku z lodem.
  2. Przygotuj żyletkę oraz niezbędne narzędzia do sekcji, takie jak pęseta, szpatułka i nożyczki, przecierając je wacikiem nasączonym alkoholem.
  3. Uśmierć mysz poprzez uduszenie CO2 w małej komorze gazowej, a następnie natychmiast przeprowadź dekapitację za pomocą ostrych nożyczek. Szybko wyjmij cały mózg. Umieść mózg w zlewku z lodowatym sacharozowym aCSF na około 10 minut.
  4. W międzyczasie przygotuj wibrotom do krojenia. Najpierw wsyp kruszony lód do kąpieli z preparatem. Ustaw komorę na preparat i dokręć ją, aby mocno trzymała się na miejscu. Wypełnij luki wokół komory dodatkowym lodem, upewniając się, że lód nie dostał się do wnętrza komory. Umieść oczyszczoną żyletkę w uchwycie noża w wibrotomie i napełnij komorę lodowatym sacharozowym aCSF.
  5. Aby przygotować powierzchnię roboczą do obróbki mózgu, wlej nieco zimnego sacharozowego aCSF na ręcznik papierowy ułożony na odwróconej czarence Petriego. Za pomocą pęsety przenieś mózg na przygotowaną czarenkę Petriego. W przypadku przekrojów wieńcowych odetnij móżdżek wzdłuż osi przyśrodkowej-bocznej żyletką i go usuń. Pozwoli to na uzyskanie płaskiej podstawy, którą można przymocować do stolika wibrotomu.
  6. Nałóż kroplę kleju Loctite (umieszczonego w wiaderku z lodem w kroku 1) na stolik do preparatów. Natychmiast przymocuj płaski koniec przygotowanego mózgu do stolika, utrzymując go w pozycji jak najbardziej pionowej. Umieść stolik w komorze na preparat i dokręć śrubę, upewniając się, że mózg jest całkowicie zanurzony w sacharozowym aCSF w komorze.
  7. Za pomocą elementów sterujących na przednim panelu wibrotomu ustaw stolik tak, aby żyletka znajdowała się na wysokości górnej części mózgu. Optymalne parametry wibrotomu uzyskuje się, ustawiając niską częstotliwość i prędkość. Preferowane są niskie prędkości, aby zminimalizować siłę nacisku ostrza, która przy wyższych prędkościach może prowadzić do zmiażdżenia tkanki mózgowej. Grubość skrawarków ustawiono na 400 μm.
  8. Pierwsze kilka skrawków nie będzie zawierać prążkowania. Powtarzaj krojenie, aż uzyskasz skrawki zawierające prążkowie. Po dotarciu do obszaru prążkowia (potwierdzonego przez punkty orientacyjne anatomiczne), użyj pędzla, aby podnieść skrawka i przenieść go do zlewka z natlenionym aCSF w temperaturze pokojowej. Zazwyczaj można uzyskać od 3 do 4 skrawków zawierających kompleks prążkowia, obejmujących jądro ogoniaste, skorupę oraz jądro półleżące.
  9. Pozostaw skrawki do aklimatyzacji w natlenionym aCSF w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę przed wykorzystaniem w eksperymentach.

3. Pomiary woltamperometryczne z przekrojów

Podczas inkubacji skrawków można przygotować komorę do rejestracji z przekrojów.

  1. Przenieś rurkę połączoną z zanurzeniową komorą rejestracyjną (Custom Scientific, Denver, CO) do natlenionego, pokojowego aCSF. Ustaw pompę perfuzyjną (Watson Marlow Limited, Falmouth, England) na szybkość przepływu 1 mL/min. Ustaw sterownik temperatury na 32 °C. Po wypełnieniu aCSF specjalnie zbudowanego uchwytu do skrawków (zmodyfikowana platforma z dyskiem siatkowym), przygotuj go do przyjęcia skrawka, usuwając pęcherzyki powietrza za pomocą strzykawki z igłą (igła spinalna BD).
  2. Uruchom kąpiel dla skrawków, wytwarzając podciśnienie w rurce odpływowej (prowadzącej do szklanej butelki na odpady ciekłe) za pomocą strzykawki, aby rozpocząć przepływ. Umieść chusteczkę Kimwipe na krawędzi uchwytu do skrawków, aby służyła jako knot do kontrolowania przelewania buforu.
  3. Po 1 godzinie inkubacji przenieś skrawki do uchwytu w komorze rejestracyjnej, która jest stale perfundowana pokojowym aCSF natlenionym mieszanką 95% O2/5% CO2.
  4. Zanurz elektrodę referencyjną Ag/AgCl w uchwycie do skrawków (przymocowaną taśmą do pokrywy komory ze skrawkami) i podłącz elektrodę do wzmacniacza wejściowego za pomocą klipsa typu „alligator”.
    • Elektrodę referencyjną Ag/AgCl można wykonać samodzielnie poprzez anodowanie (+1 V) srebrnego drutu o średnicy 250 μm (A-M Systems, Carlsborg, WA) w 1 M HCl przez 5 minut, aby osadzić cienką warstwę AgCl na powierzchni drutu srebrnego.
  5. Opuść wolframową elektrodę stymulującą (Plastics One, Roanoke, VA) do powierzchni skrawka mózgu z obszaru prążkowia. Elektroda stymulująca styka się ze skrawkiem, spoczywając na jego wierzchu, ale nie powinna go przebijać. W naszym układzie eksperymentalnym stymulacja jest generowana przez stymulator Neurolog.
  6. Włókno węglowe mikroelektrody roboczej jest wypełniane od tyłu roztworem 150 mM KCl za pomocą igły spinalnej BD. Następnie wprowadza się przewód doprowadzający (Squires Electronics, Cornelius, OR), który jest podłączony do wzmacniacza wejściowego potencjostatu ChemClamp o niskim poziomie szumów (Dagan Corporations, Minneapolis, MN) za pomocą klipsa typu „alligator”. Elektrodę roboczą umieszcza się w odległości około 100 - 200 μm od bipolarnych elektrod stymulujących, na głębokości około 75 μm w skrawku.
  7. Stymulacje elektryczne, przy użyciu pojedynczych impulsów (monofazowych, 350 μA, 60 Hz i szerokość impulsu 4 ms) lub impulsów wielokrotnych (np. 5 impulsów, 350 μA, 20 Hz i szerokość 4 ms), są dostarczane przez elektrodę stymulującą w celu wywołania uwalniania neurotransmiterów 3.
  8. W celu pomiaru elektrycznie wywołanej dopaminy za pomocą FSCV, do elektrody przykłada się przebieg trójkątny. Typowe parametry detekcji dopaminy: potencjał mikroelektrody z włókna węglowego utrzymuje się na poziomie -0,4 V względem elektrody referencyjnej Ag/AgCl, zwiększa się do górnej granicy +1,2 V, a następnie obniża z powrotem do -0,4 V przy szybkości skanowania 400 V/s.
  9. Skrawki są stymulowane elektrycznie co 5 minut, a pomiary woltamperometryczne wynikającego z tego wypływu dopaminy są wykonywane przez 15 sekund.
  10. Po uzyskaniu co najmniej trzech stabilnych pomiarów elektrycznie stymulowanego uwalniania dopaminy (różnica między wysokościami pików < 10%), aCSF zawierający interesujący czynnik farmakologiczny jest perfundowany przez skrawki z szybkością przepływu 1 mL/min przez 30 minut w celu uzyskania maksymalnego efektu. Pomiary elektrycznie stymulowanej dopaminy są wykonywane co 5 minut podczas perfuzji farmakologicznej.

4. Analiza danych

Uzyskane z preparatu odkrawka przebiegi prądu w funkcji czasu można dopasować metodą regresji nieliniowej do zestawu równań opartych na modelu Michaelisa-Mentena, zgodnie z opisem Wightmana i współpracowników, przy użyciu oprogramowania napisanego w LabVIEW (National Instruments, Austin, TX) 4-6. W tym oprogramowaniu przebiegi prądu w funkcji czasu można dopasować poprzez zmianę dwóch parametrów: Vmax (nM/s; odpowiadającego szybkości wychwytu przez transporter dopaminy, co obrazuje faza opadająca przebiegu) oraz stężenia dopaminy na impuls (nM; odpowiadającego maksymalnej wysokości piku). Wartość Km, odzwierciedlająca powinowactwo dopaminy do transportera dopaminy, jest ustawiona na 160 nM i nie ulega zmianie. Przed dopasowaniem wymagany jest współczynnik pokalibracyjny elektrody wyznaczony po zakończeniu eksperymentu. Oprogramowanie LabView zawiera parametr współczynnika determinacji (R2) służący do oceny jakości dopasowania (stosowane są wartości R2 > 0,8).

5. Reprezentatywne wyniki

Metoda FSCV została wykorzystana do badania uwalniania i wychwytu dopaminy pod wpływem pojedynczego impulsu stymulacji elektrycznej w jądrze ogoniastym i skorupie (CPu), rdzeniu jądra półleżącego (NAc core) oraz otoczce jądra półleżącego (NAc shell) u myszy. Reprezentatywne wyniki przedstawione na Rysunku 1A obrazują zależności prądu (lub stężenia) od czasu. Czerwona strzałka wskazuje moment zastosowania stymulacji elektrycznej do skrawka, po której następuje odpowiadający wzrost natężenia prądu przypisywany zmianom stężenia dopaminy na węglowej mikroelektrodzie. Dominującym procesem podczas stymulacji elektrycznej jest uwalnianie dopaminy, jednak inne procesy, takie jak wychwyt i dyfuzja, również wpływają na całkowitą wysokość zaobserwowanego piku. Faza opadająca piku jest przypisywana głównie powrotnemu wychwytowi neurotransmittera przez jego transporter po zaprzestaniu stymulacji neuronalnej 7. Niemniej jednak spadek piku nie ogranicza się tylko do wychwytu, ponieważ dyfuzja i metabolizm również przyczyniają się do zmniejszenia prądu. Postuluje się, że ze względu na skalę czasową pomiarów elektrochemicznych rzędu sekund, FSCV jest zbyt szybką metodą, aby mierzyć wkład metabolizmu 7. W tych przebiegach prądu w czasie oś y została przeliczona na stężenie (μM) przy użyciu czynnika kalibracyjnego wyznaczonego po eksperymencie. Wstawka na Rysunku 1A przedstawia odpowiednie woltamperogramy cykliczne po odjęciu tła dla przebiegów prądu w czasie. Przy wykreśleniu zmierzonego prądu (oś y) względem potencjału przyłożonego do elektrody (oś x), dopamina zostaje zidentyfikowana chemicznie dzięki zaobserwowanemu pikowi utleniania przy +0,6 V oraz odpowiadającemu mu pikowi redukcji dopaminy-orto-chinonu przy -0,2 V względem elektrody odniesienia Ag/AgCl. Trzecia reprezentacja danych wykorzystuje trójwymiarowy wykres pseudo-kolorowy (Rysunek 1B), łączący informacje z przebiegów prądu w czasie oraz woltamperogramu cyklicznego w jeden wykres. Na reprezentatywnym wykresie pseudo-kolorowym czas w sekundach naniesiono na oś x, przyłożone napięcie do węglowej mikroelektrody roboczej na oś y, a prąd przedstawiono za pomocą fałszywych kolorów wzdłuż osi z. Dzięki niewielkiemu rozmiarowi mikroelektrod z włókien węglowych (~ 7 μm średnicy), dynamika uwalniania dopaminy stymulowanej elektrycznie może być wykrywana w oddzielnych regionach anatomicznych prążkowia (CPu kontra NAc core kontra NAc shell; Rysunek 2).

Zaletą stosowania przekrojów koronalnych prążkowia jest wyeliminowanie wpływu ciał komórek dopaminergicznych, co umożliwia badanie presynaptycznej dynamiki dopaminy. Presynaptyczna kontrola uwalniania i wychwytu dopaminy nie ogranicza się ściśle do funkcji autoreceptorów lub transporterów dopaminy, co wykazano w innych badaniach 16, 17. Heteroreceptory innych układów neurotransmisyjnych również modulują dynamikę dopaminy 18, 19. Reprezentatywne zapisy zależności natężenia prądu od czasu przedstawione na Rysunku 3A pokazują, że po traktowaniu przekrojów 1 μM quinpirole (agonistą receptorów D2/D3) przez 30 minut obserwuje się spadek wywołanego elektrycznie uwalniania dopaminy. Z kolei w przypadku perfuzji przekroju substratem dla transportera dopaminy, takim jak metamfetamina, przez 30 minut, nie stwierdzono różnic w uwalnianiu dopaminy (Rysunek 3B). Przesunięcie szczytu zaniku w prawo jest zazwyczaj wiązane ze zmianami kinetyki transportera dopaminy (Km) 3. Wreszcie, Rysunek 3C przedstawia reprezentatywny zapis natężenia prądu w funkcji czasu po kąpieli przekroju w roztworze czynnika neurotroficznego pochodzenia mózgowego (BDNF) o stężeniu 100 ng/mL, który według hipotez wpływa na dynamikę uwalniania dopaminy 20, 21. Z tego reprezentatywnego zapisu wynika, że BDNF ma zdolność zwiększania wywołanego elektrycznie uwalniania dopaminy. Podsumowując, te zabiegi farmakologiczne podkreślają użyteczność FSCV w badaniu dynamiki dopaminy w prążkowiu.

Głównym ograniczeniem wykorzystania skrawków mózgu do badania presynaptycznej dynamiki dopaminy za pomocą FSCV jest utrata obwodów neuronalnych nienaruszonego mózgu. W przypadku FSCV na skrawkach niemożliwe jest badanie wpływu neuroprzekaźników z innych obszarów mózgu, co utrudnia zrozumienie wpływu tych systemów na funkcjonalność badanego regionu (np. prążkowia) lub ocenę poziomów dopaminy w warunkach braku stymulacji. Jednakże ostatnie postępy techniczne w FSCV umożliwiły pomiary przejściowe dopaminy (ze stymulacją elektryczną i bez niej) u szczurów w swobodnym ruchu w odpowiedzi na manipulację farmakologiczną, samopodawanie leków lub nowość 22 - 24. Podsumowując, FSCV na skrawkach dostarcza cennych informacji na temat presynaptycznej dynamiki dopaminy, a połączenie wyników FSCV na skrawkach z komplementarnymi technikami neurochemicznymi, takimi jak mikrodializa, elektrofizjologia i/lub FSCV u zwierząt w swobodnym ruchu, oferuje bardziej kompleksowy wgląd w funkcjonowanie neuroprzekaźników w mózgu.

Analiza jądra ogoniastego i putamen z wykresami woltametrycznymi: woltamogram z wykresem prądu w funkcji potencjału.
Rysunek 1. Elektrycznie wywołane uwalnianie dopaminy mierzone za pomocą FSCV po stymulacji pojedynczym impulsem w skrawkach grzbietnej części CPu myszy C57Bl/6J. (A) Zależność stężenia od czasu, w której uwalnianie dopaminy zostało wywołane pojedynczym impulsem (czerwona strzałka). Pojedyncza gwiazdka oznacza czynniki przyczyniające się do wzrostu stężenia, którym jest przede wszystkim uwalnianie dopaminy, choć wpływ ma również wychwyt i dyfuzja. Podwójna gwiazdka oznacza powrót sygnału szczytowego do linii bazowej, głównie ze względu na wychwyt, ale również z powodu dyfuzji. Wstawka przedstawia odpowiadające im cykliczne woltamogramy. (B) Reprezentatywne wykresy kolorystyczne z grzbietnej części CPu przedstawiają czas (oś x), przyłożony potencjał do mikroelektrody z włókna węglowego względem elektrody odniesienia Ag/AgCl (oś y) oraz natężenie prądu w pseudokolorach.

Analiza elektrochemiczna; wykresy woltamperometryczne; jądro/skorupa NAc; potencjał vs. Ag/AgCl; dane prądowe.
Rycina 2. Uwalnianie dopaminy wywołane pojedynczym impulsem stymulacji elektrycznej (oznaczonym czerwoną strzałką) w jądrze i skorupie NAc u myszy C57Bl/6J. (A i C) Krzywe zależności stężenia od czasu oraz odpowiadające im woltamperogramy cykliczne (wstawka) z jądra i skorupy NAc. (B i D) Zgodnie z wcześniejszym opisem, reprezentatywne wykresy kolorystyczne z jądra i skorupy NAc.

Wykres uwalniania neurotransmiterów; efekty kwinpirolu, metamfetaminy i BDNF; porównanie z poziomem bazowym.
Rycina 3. Reprezentatywne zapisy po 30-minutowej inkubacji skrawka z agentem farmakologicznym; we wszystkich przypadkach do wywołania uwalniania dopaminy w CPu zastosowano pojedynczy impuls. (A) Zastosowanie agonisty receptorów dopaminergicznych D2, kwinpirolu (linia czerwona) w porównaniu z okresem przed podaniem preparatu (linia czarna). (B) Perfusja metamfetaminą (linia fioletowa) w porównaniu z okresem przed podaniem preparatu (linia czarna). (C) Wpływ czynnika neurotroficznego pochodzenia mózgowego na dynamikę dopaminy (linia niebieska) w porównaniu z okresem przed podaniem preparatu (linia czarna).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół demonstruje, jak przygotować i wykorzystać koronalne skrawki mózgu myszy do eksperymentów FSCV. Chociaż metoda ta jest specyficzna dla pozyskiwania i pomiaru dynamiki dopaminy, inne neuroprzekaźniki, takie jak adenozyna, nadtlenek wodoru, norepinefryna i serotonina, były monitorowane in vivo lub in vitro za pomocą FSCV 3, 8 - 11. FSCV można wykorzystać do monitorowania niektórych z tych innych neurochemikaliów poprzez proste modyfikacje kształtu fali przykładanej ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Podziękowania

Finansowanie zapewnione przez National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (NIAAA; AA-016967 oraz AA016967-01S1; TAM), fundusze startowe Wayne State University oraz program grantów badawczych Wayne State University Research Grant Program. Treść opracowania jest wyłączną odpowiedzialnością autorów i nie reprezentuje oficjalnych poglądów NIAAA ani National Institutes of Health.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chlorek potasuFisher Scientific7447407
Chlorek soduEMD Millipore7647145
Chlorek magnezuFisher Scientific7791186
Chlorek wapniaFisher Scientific10035048
Bikarbonat soduEMD Millipore144558
Fosforan sodu, dwutlenekEMD Millipore7558794
D-glukozaFisher Scientific50997
Kwas askorbinowyFisher Scientific50817
SacharozaFisher Scientific57501
Włókno węgloweGoodfellow
Kapilara szklanaA-M Systems602000
Drut srebrnyA-M Systems787000
Elektroda stymulacyjna wolframowaPlastics One
Drut platynowy
Drut ołowianySquires Electronics, Cornelius, OR
Klej chwilowy Loctite 404Hankal Corp.
Ostrze brzytwyWorld Precision Instruments, Inc.
Igła kręgowa BDBD BiosciencesREF 405234
Ostrze chirurgiczneFeather Safety Razor Co, Ltd.
Oprogramowanie THESA Inc., Chelmsford, MA
Komora do nagrywania zanurzeniowegoCustom Scientific
Izolator stymulacji Neorologfigure-materials-1 Digitimer Ltd.NL800A
Automatyczny regulator temperaturyWarner Instruments
Mikroskop (SZX7)Olympus Corporation
MikroskopFisher Scientific
System do sekcjonowania Vibratome 3000St. Louis, MO.
Pompa perfuzyjnaWatson-Marlow Pumps GroupH110708
Wciągarka mikropipetNarishige International
Potencjostat ChemClampDagan Corporations

Bibliografia

  1. Pike, C. M., Grabner, C. P., Harkins, A. B. Fabrication of Amperometric Electrodes. J. Vis. Exp. (27), e1040-e1040 (2009).
  2. Lack, A. K., Diaz, M. R., Chappell, A., DuBois, D. W., McCool, B. A. Chronic ethanol and withdrawal differentially modulate pre- and postsynaptic function at glutamatergic synapses in rat basolateral amygdala. J. Neuropyhysiol. 98, 3185-3196 (2007).
  3. John, C. E., Jones, S. R. Voltammetric characterization of the effect of monoamine uptake inhibitors and release on dopamine and serotonin uptake in mouse caudate-putamen and substantia nigra slices. Neuropharmacology. 52, 1596-1605 (2007).
  4. Wightman, R. M., Amatore, C., Engstrom, R. C., Hale, P. D., Kistensen, E. W., Kuhr, W. G., May, L. J. Real-time characterization of dopamine overflow and uptake in the rat striatum. Neuroscience. 25, 513-523 (1988).
  5. Wightman, R. M., Zimmerman, J. B. Control of dopamine extracellular concentration in rat striatum by impulse flow and uptake. Brain. Res. Brain. Res. Rev. 15, 135-144 (1990).
  6. Jones, S. R., Garris, P. A., Kilts, C. D., Wightman, R. M. Comparison of dopamine uptake in the basolateral amygdaloid nucleus, caudate-putamen, and nucleus accumbens of the rat. J. Neurochem. 64, 2581-2589 (1995).
  7. Michael, D. J., Wightman, R. M. Electrochemical monitoring of biogenic amine neurotransmission in real time. J. Pharm. Biomed. Anal. 19, 33-46 (1999).
  8. Pajski, M. L., Venton, B. J. Adenosine release evoked by short electrical stimulations in striatal brain slices is primarily activity dependent. A.C.S. Chem. Neurosci. 1, 775-787 (2010).
  9. Sanford, A. L., Morton, S. W., Whitehouse, K. L., Oara, H. M., Lugo-Morales, L. Z., Roberts, J. G., Sombers, L. A. Voltammetric detection of hydrogen peroxide at carbon fiber microelectrodes. Anal. Chem. 82, 5205-5210 (2010).
  10. Park, J., Kile, B. M., Wightman, R. M. In vivo voltammetric monitoring of norepinephrine release in the rat ventral bed nucleus of the stria terminalis and anteroventral thalamic nucleus. Eur. J. Neurosci. 30, 2121-2133 (2009).
  11. Hashemi, P., Dankoski, E. C., Petrovic, J., Keithley, R. B., Wightman, R. M. Voltammetric detection of 5-hydroxytryptamine release in the rat brain. Anal. Chem. 81, 9462-9471 (2009).
  12. Borue, X., Cooper, S., Hirsh, J., Condron, B., Venton, B. J. Quantitative evaluation of serotonin release and clearnece in drosophila. J. Neuroscience. Methods. 179, 300-308 (2009).
  13. Vickrey, T. L., Condron, B., Venton, B. J. Detection of endogenous dopamine changes in drosophila melanogaster using fast-scan cyclic voltammetry. Anal. Chem. 81, 9306-9313 (2009).
  14. Makos, M. A., Han, K. A., Heien, M. L., Ewing, A. G. Using in vivo electrochemistry to study the physiological effects of cocaine and other stimulants on the drosophila melanogaster dopamine transporter. A.C.S. Chem Neurosci. 1, 74-83 (2009).
  15. Budygin, E. A., John, C. E., Mateo, Y., Daunais, J. B., Friedman, D. P., Grant, K. A., Jones, S. R. Chronic ethanol exposure alters presynaptic dopamine function in striatum of monkeys: a preliminary study. Synapse. 50, 266-268 (2003).
  16. Jones, S. R., Gainetdinov, R. R., Jaber, M., Giros, B., Wightman, R. M., Caron, M. G. Profound neuronal plasticity in response to inactivation of the dopamine transporter. PNAS. 95, 4029-4034 (1998).
  17. Kennedy, R. T., Jones, S. R., Wightman, R. M. Dynamic observation of dopamine autoreceptor effects in rat striatal slices. J. Neurochem. 59, 449-445 (1992).
  18. Rice, M. E., Cragg, S. J. Nicotine amplifies reward-related dopamine signals in striatum. Nat. Neurosci. 7, 583-584 (2004).
  19. Zhang, L., Doyon, W. M., Clark, J. J., Phillips, P. E., Dani, J. A. Controls of tonic and phasic dopamine transmission in the dorsal and ventral. 76, 396-404 (2009).
  20. Paredes, D., Grnaholm, A. C., Bickford, P. C. Effects of NGF and BDNF on baseline glutamate and dopamine release in the hippocampal formation of the adult rat. Brain. Res. 11141, 56-64 (2007).
  21. Goggi, J., Puller, I. A., Carney, S. L., Bradford, H. F. Signalling pathways involved in the short-term potentiation of dopamine release by BDNF. Brain. Res. 968, 156-161 (2003).
  22. Cheer, J. F., Wassum, K. M., Heien, M. L., Phillips, P. E., Wightman, R. M. Cannabinoids enhance subsecond doapmine relese in the nucleus accumbens of awake rats. J. Neurosci. 24, 4393-4400 (2004).
  23. Phillips, P. E., Stuber, G. D., Heien, M. L., Wightman, R. M., Carelli, R. M. Subsecond dopamine release promotes cocaine seeking. Nature. 422, 614-618 (2003).
  24. Robinson, D. L., Heien, M. L., Wightman, R. M. Frequency of dopamine concentration transients increases in dorsal and ventral striatum of male rats duing introduction of conspecifics. J. Neurosci. 22, 10477-10486 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikroeletrody z w kna w glowegouwalnianie i wychwyt dopaminykrojenie koronalne m zgu myszyaplikacja rodk w farmakologicznychprotok stymulacji elektrycznejnatleniony sztuczny p yn m zgowo rdzeniowyj dro p le cepr kowie
Dynamika dopaminy presynaptycznej w przekrojach mózgu w obrębie prążka z wykorzystaniem szybkiej woltamperometrii cyklicznej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.