Przygotowanie i prowadzenie elektroforezy białek w żelu z wykorzystaniem wielokrotnego użycia komercyjnych kaset

Podsumowanie

Nasz protokół demonstruje, jak przygotować wiele żeli białkowych jednocześnie poprzez recykling kaset minigel Invitrogen Nupage Novex oraz wykorzystanie niedrogich materiałów zakupionych w sklepie budowlanym. Ta ekonomiczna i usprawniona metoda zawiera sposób przechowywania żeli w temperaturze 4°C przez kilka tygodni. Dzięki ponownemu wykorzystaniu plastikowych kaset do żeli pochodzących z dostępnych komercyjnie zestawów, laboratoria często przeprowadzające elektroforezę białek mogą znacząco obniżyć koszty i pomóc w ochronie środowiska.

Streszczenie

Ocena białek za pomocą analizy elektroforezy w żelach poliakryloamidowych z dodatkiem dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE) jest powszechną techniką stosowaną przez badaczy w dziedzinie biochemii i biologii molekularnej^1-4. W laboratoriach, w których codziennie przeprowadzane są analizy białek, koszt komercyjnie dostępnych żeli poliakryloamidowych (˜$10/żel) może z czasem stać się znaczący. Aby ograniczyć te koszty, niektórzy badacze przygotowują własne żele poliakryloamidowe. Tradycyjne metody odlewania tych żeli zazwyczaj wymagają specjalistycznego sprzętu i szklanych płytek do żeli, które mogą być drogie i uniemożliwiają odlewanie wielu żeli oraz ich przechowywanie do przyszłego użycia. Ponadto manipulowanie szklanymi płytkami podczas ich czyszczenia lub odlewania żelu może doprowadzić do przypadkowego stłuczenia, co stwarza zagrożenie dla bezpieczeństwa i może wykluczać ich stosowanie w zajęciach laboratoryjnych dla studentów. Nasz protokół demonstruje, jak jednocześnie odlewać wiele żeli białkowych poprzez recykling kaset minigel Invitrogen Nupage Novex oraz wykorzystanie niedrogich materiałów zakupionych w sklepie budowlanym. Ta ekonomiczna i usprawniona metoda obejmuje sposób przechowywania żeli w temperaturze 4°C przez kilka tygodni. Dzięki ponownemu wykorzystaniu plastikowych kaset do żeli z komercyjnie dostępnych zestawów, laboratoria często przeprowadzające elektroforezę białek mogą znacząco obniżyć koszty i pomóc środowisku. Dodatkowo plastikowe kasety są niezwykle odporne na stłuczenia, co czyni je idealnymi do użytku w laboratoriach dydaktycznych dla studentów.

Protokół

1. Przygotowanie kaset

1. Oczyścić przednią i tylną płytkę używanej kasety do minigelu Invitrogen Nupage Novex lub innej komercyjnej kasety do minigeli.
2. Przygotować około 1-3 ml plastikowej żywicy epoksydowej i dokładnie wymieszać zgodnie z instrukcjami producenta.
3. Nanieść żywicę epoksydową na wewnętrzną krawędź przedniej płytki, w miejscu, w którym obie płytki będą stykać się po złożeniu kasety.
4. Podczas składania kasety wsunąć kawałek papieru filtracyjnego lub tektury przez dolną szczelinę tylnej płytki, aby zapobiec zapieczętowaniu otworu przez nadmiar żywicy. Usunąć papier filtracyjny natychmiast po złożeniu obu płytek.
5. Zastosować żabki biurowe wzdłuż krawędzi, aby zapewnić szczelne połączenie, i pozostawić kasety na noc do pełnego utwardzenia żywicy.
6. Uszczelnić szczelinę na dole tylnej płytki taśmą izolacyjną.

2. Wlewanie żelu rozdzielczego

1. Do kolby z bocznym wylotem o pojemności 125 ml dodać następujące składniki: 2,25 ml 4X buforu do żelu rozdzielczego Tris-Base pH 8,70, 3,50 ml 30,8% akryloamidu/bisakryloamidu oraz 3,25 ml wody odczynnikowej typu I (IRG-H₂O), aby uzyskać objętość całkowitą 9 ml.
2. Odgazować roztwór przez 10 min, podłączając boczny wylot kolby do aparatury próżniowej i zakładając odwrócony korek na górną część kolby.
3. Przenieść 9 ml odgazowanego roztworu do jednorazowej polipropylenowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, dodać 30 μl 10% persiarczanu amonu (APS) oraz 6 μl N, N, N', N',-tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) i dokładnie wymieszać poprzez delikatne okrężne potrząsanie roztworem, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza.
4. Niezwłocznie wlać roztwór do kasety, pozwalając mu spływać po ściance kasety, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków między płytkami żelu. Wypełnić kasetę do poziomu około 2 cm od górnej krawędzi przedniej (krótszej) płytki.
5. Ostrożnie dodać 0,5 ml 1-butanolu nasyconego 1X buforem do żelu rozdzielczego i pozostawić żel do polimeryzacji na 1 godzinę.

3. Wlewanie żelu zagęszczającego

1. Do kolby z bocznym wylotem o pojemności 125 ml dodać: 0,75 ml 4X buforu do żelu zagęszczającego Tris-Base pH 6,80, 0,40 ml 30,8% akryloamidu/bisakryloamidu oraz 1,85 ml IRG-H₂O, tak aby całkowita objętość wyniosła 3 ml.
2. Odgazować roztwór przez 10 min zgodnie z opisem w kroku 2.
3. Podczas odgazowywania roztworu do żelu zagęszczającego, odlać 1-butanol nasycony 1X buforem do żelu rozdzielającego z górnej części żelu rozdzielającego. Przepłukać górną część żelu rozdzielającego raz wodą IRG-H₂O. Odlać wodę i użyć papieru bibułowego lub papieru filtracyjnego Whatman, aby wchłonąć pozostały płyn.
4. Odmierzyć 3 ml odgazowanego roztworu, dodać 9 μl 10% APS oraz 2 μl TEMED i dokładnie wymieszać.
5. Szybko wlać roztwór do kasety, pozwalając mu spływać po ściance kasety, aż osiągnie poziom górnej krawędzi krótszej, przedniej płyty żelowej.
6. Wsunąć czysty grzebień do żelu w górną część kasety żelowej i przymocować go w miejscu za pomocą zacisku biurowego na kasecie. Pozostawić żel zagęszczający do polimeryzacji na okres od 1 godziny do całej nocy.

4. Przechowywanie żelu

1. Po całkowitej polimeryzacji żelu należy zdjąć zaciski biurowe i umieścić kasetę w plastikowej torebce zgrzewalnej lub w plastikowym worku zamykanym strunowo.
2. Do torebki należy wlać 20 ml 1X buforu do żelu zagęszczającego zawierającego 0,1% azotku sodu.
3. Torebkę należy zgrzać termicznie przez 5 sec, upewniając się, że worek nie przecieka.
4. Żel należy przechowywać w temperaturze 4°C.

5. Przygotowanie próbek

1. Do cienkościennej probówki do mikrocentryfugi należy dodać do 6,5 μl próbki białka, 7,5 μl 2x buforu do próbek Novex Tris-Glycine SDS, 1 μl 100 mM ditiotreitolu (DTT) oraz IRG-H₂O (jeśli jest to konieczne), aby uzyskać całkowitą objętość 15 μl.
2. Próbkę należy wymieszać za pomocą wortexa, a następnie krótko odwirować, aby osadzić zawartość na dnie probówki.
3. Próbkę należy denaturować w temperaturze 70°C przez 10 min.

6. Elektroforeza żelu

1. Przygotować aparat do elektroforezy Novex.
2. Do komory wewnętrznej wlać 200 ml buforu do elektroforezy Tris-Glycine zawierającego 500 μl przeciwutleniacza Nupage, a do komory zewnętrznej 300 ml buforu do elektroforezy Tris-Glycine.
3. Za pomocą końcówki pipety do nakładania próbek nanieść zdenaturowane próbki białek (15 μl) do studzienek.
4. Prowadzić elektroforezę przy napięciu 200 V przez 60-70 min.

7. Barwienie żelu

1. Wyjmij kasetę z aparatury do elektroforezy i przełam uszczelnienie epoksydowe, rozdzielając dwie plastikowe płyty do żelu za pomocą noża do żeli lub sztywnej szpachelki. Ostrożnie oddziel żel od płyt, uważając, aby go nie przerwać.
2. Przepłucz żel wodą IRG-H₂O trzy razy, delikatnie wstrząsając.
3. Barw żel przy użyciu barwnika Invitrogen SimplyBlue SafeStain przez 1 godzinę, delikatnie wstrząsając.
4. Odlej roztwór barwiący i odbarw żel wodą IRG-H₂O.

8. Czyszczenie kaset

1. Za pomocą metalnej szpatułki zeskrobać lub odkleić całą żywicę epoksydową z kaset, aby można było ich ponownie użyć.
2. Każdą z plastikowych płytek do żelu umyć roztworem łagodnego detergentu, a następnie dokładnie wypłukać wodą z kranu, a potem wodą destylowaną.

9. Reprezentatywne wyniki

Ponieważ żywica epoksydowa tworzy wodoszczelną uszczelkę (Rysunek 1), kasety nie będą przeciekać podczas wlewania do nich roztworu akryloamidu. Dodatkowo kasety żelowe można łatwo otworzyć, aby wyjąć żel do barwienia, a żywicę epoksydową można odkleić z kaset, co umożliwia ich dalsze ponowne wykorzystanie. Jak pokazano na Rysunku 2, żel wykazuje wyraźną separację markerów białek i prążków próbek, odpowiednią do rutynowej elektroforezy białek.

Rycina 1. Nakładanie żywicy epoksydowej w celu uszczelnienia kaset minizelu. Cienka warstwa żywicy epoksydowej jest nakładana na krawędź jednej z kaset przed montażem. Aby wyróżnić żywicę epoksydową, na tym obrazie została ona sztucznie zabarwiona na czerwono.

Rysunek 2. Rozdział białek na żelu SDS-Tris-glicyna przygotowanym z użyciem wielokrotnego wykorzystania kaset do minigelu. Elektroforezę SDS-PAGE przeprowadzono zgodnie z powyższym opisem. Po elektroforezie żel wyjęto z kasety do minigelu, zabarwiono barwnikiem SimplyBlue SafeStain zgodnie z instrukcjami producenta i sfotografowano przy użyciu białego światła przechodzącego. Ścieżka M zawiera wstępnie zabarwione standardy białkowe SeeBlue Plus2. Masy cząsteczkowe białek w ścieżce M są wskazane po prawej stronie żelu w kilodaltonach (kDa). Pozostałe ścieżki przedstawiają białka z oczyszczonego lizatu bakterii eksponujących białko z tagiem glutation-S-transferazy (GST). Przedstawione białka to te, które zostały wypłukane z kuleczek glutationowych przed elucją białka z tagiem GST.

Dyskusja

Elektroforeza białek w żelu jest niezbędną metodą w większości laboratoriów biologii molekularnej. Dostępne w handlu minigele zapewniają wysoki poziom wygody, lecz mogą być kosztowne. W niniejszym materiale pokazujemy, jak ponownie wykorzystać kasety do minigeli popularnej marki komercyjnej. Metoda ta zachowuje wygodę korzystania z gotowych żeli, ale przy niewielkim ułamku kosztów zakupu gotowych minigeli. Kluczowym krokiem w tej procedurze jest nałożenie odpowiedniej ilości żywicy epoksydowej w celu całkowitego uszczeln...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kaseta do minigelu Invitrogen Nupage Novex (1,0 mm)	Invitrogen	NC2010	Dostępne w wersjach z 2, 5, 10, 12, 15 i 24 dołkami
Żywica epoksydowa	Loctite	108771
Taśma izolacyjna	Scotch Co.
kolba z bocznym wylotem 125 ml	Pyrex	5360
4X bufor do żelu rozdzielczego Tris-Base			1,5 M Tris-base pH 8,7
akrylamid	Fisher Scientific	01065-500
Bis-akryloamid	MP Biomedicals	800173
30,8% roztwór akrylamidu			30:0,8 akrylamid: bis-akrylamid w IRG-H2O
10% APS	Fisher Scientific	BP179-25	0,1 g nadtlenosiarczanu amonu w 1 ml IRG-H2O, przygotowany bezpośrednio przed użyciem
TEMED	Acros Organics	138450500
1-butanol nasycony 1X buforem do żelu rozdzielczego			5:2 1-butanol do buforu żelu rozdzielającego 1X
4X bufor do żelu zagęszczającego Tris-Base			1,5 M Tris-base pH 6,8
Grzebień do żelu	Invitrogen	NC3015	15 dołków, grubość 1,0 mm
Zgrzewarka impulsowa	Sprzęt do ogrzewania elektrycznego TEW
Woreczek z możliwością zgrzewania termicznego	Kapak/Scotchpak		1 o pojemności 1 pinta (6,5" x 8")
Bufor do przechowywania żeli			Bufor żelu zagęszczającego 1X z 0,1% azotkiem sodu
bufor do próbek Novex SDS Tris-Glicyna (2X)	Invitrogen	LC2676
DTT	Fisher Scientific	BP172-5
10X bufor do elektroforezy Tris-gllicyna	Invitrogen	LC2675	1 l roztworu stokowego 10X: 29,0 g Tris-Base, 144,0 g glicyny, 10,0 g SDS
XCell SureLock Mini-komórka	Invitrogen	EI0001
Nóż do żelu	Invitrogen	EI9010
SimplyBlue Safe Stain	Invitrogen	LC6065