Wykrywanie mikroregionalnej hipoksji w korze mózgowej myszy za pomocą obrazowania dwufotonowego endogennej fluorescencji NADH

Podsumowanie

W niniejszej pracy opisujemy metodę bezpośredniej wizualizacji mikroregionalnej hipoksji tkankowej w korze mózgu myszy in vivo. Metoda ta opiera się na jednoczesnym obrazowaniu dwufotonowym nikotynamidowo-adeniny-dinukleotydu (NADH) oraz mikrokrążenia korowego. Metoda ta jest przydatna do wysokorozdzielczej analizy zaopatrzenia tkanki w tlen.

Streszczenie

Zdolność mózgu do funkcjonowania przy wysokim zapotrzebowaniu metabolicznym zależy od ciągłych dostaw tlenu poprzez przepływ krwi oraz dyfuzję tlenu w tkankach. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy zilustrowany protokół eksperymentalny i metodologiczny służący do bezpośredniej wizualizacji mikroregionalnej hipoksji tkankowej oraz wnioskowania o okołonaczyniowych gradientach tlenu w korze mózgu myszy. Metoda ta opiera się na nieliniowej zależności pomiędzy intensywnością endogennej fluorescencji nikotynamidoadeninowej dinukleotydy (NADH) a ciśnieniem parcjalnym tlenu w tkance, w której obserwowana fluorescencja NADH w tkance gwałtownie wzrasta przy poziomach tlenu tkankowego poniżej 10 mmHg.¹Stosujemy dwufotonową ekscytację przy 740 nm, co pozwala na jednoczesną ekscytację wrodzonej fluorescencji NADH w tkance oraz osocza krwi skontrastowanego dekstranem Texas-Red. Zalety tej metody w porównaniu z istniejącymi podejściami obejmują następujące aspekty: wykorzystuje ona wrodzony sygnał tkankowy i może być przeprowadzona przy użyciu standardowego układu dwufotonowego in vivo sprzęt obrazujący; umożliwia on ciągłe monitorowanie całego pola widzenia z rozdzielczością w głąb wynoszącą ~50 μm. Wykazujemy, że obszary tkanki mózgowej położone najdalej od naczyń krwionośnych mózgu odpowiadają podatnym obszarom watershed, które jako pierwsze ulegają hipoksji funkcjonalnej w następstwie spadku podaży tlenu naczyniowego. Metoda ta pozwala na obrazowanie mikroregionalnego natlenienia kory i jest zatem przydatna do badania roli niewystarczającej lub ograniczonej podaży tlenu do tkanek w chorobach naczyniowo-mózgowych oraz udarach.

Protokół

1. Przygotowanie zwierzęcia do obrazowania

Uwaga: W badaniach wykorzystujemy dorosłe myszy C57BL. W zależności od pytania badawczego można zastosować różne szczepy transgeniczne. Operacje mikronaczyniowe oraz pulsoksymetria są łatwiejsze do przeprowadzenia u myszy o białym futrze (np. szczep FVB).

1. Przygotować pole operacyjne na blacie laboratoryjnym. Wszystkie instrumenty chirurgiczne muszą zostać wysterylizowane w autoklawie lub zdezynfekowane 70% etanolem.
2. Wprowadzić sondę rektalną i stale monitorować temperaturę ciała zwierzęcia przez cały czas trwania procedury.
3. Zanestetyzować mysz, stosując początkowo 5% izofluranu. Po 15-30 s, gdy zwierzę przestanie się poruszać, umieścić je na podgrzewaczu (37 °C) i założyć maskę do ciągłego podawania powietrza zawierającego 1,3-1,5% izofluranu. Upewnić się, że zwierzę nie reaguje na bodziec bólowy (np. uszczypnięcie ogona).
4. Użyć żelu do sztucznych łez, aby pokryć oczy myszy i zapobiec ich wysuszeniu pod wpływem powietrza.
5. Za pomocą strzygarki elektrycznej usunąć sierść z głowy i obu ud. Na uda nanieść środek do depilacji (np. Nair) na 2 min, a następnie ostrożnie wytrzeć, aby usunąć pozostałą sierść. Udo to zostanie wykorzystane do oksymetrii.
6. Zdezynfekować skórę głowy, używając 10% roztworu powidonu z jodem oraz 70% etanolu.

2. Przygotowanie otwartego okna czaszkowego

1. Rozpocznij od wykonania nożyczkami nacięcia skóry głowy 5 mm kudalnie od czaszki, przesuwając się o jeden centymetr. Odsuń skórę na boki, aby odsłonić czaszkę.
2. Aby usunąć błony z powierzchni czaszki, nanieś na nią 10% roztwór chlorku żelaza. Wytrzyj nadmiar roztworu i zdrap błony pęsetą nr 5 pod kątem 45°. Ważne jest, aby starannie przygotować miejsce zabiegu, aby zapewnić bezpieczne przymocowanie płytki głownej do czaszki (kroki od 4 do 6).
3. Używając mikroskopu sekcyjnego, zidentyfikuj obszar zainteresowania. Należy unikać szwów czaszkowych, ponieważ czaszka może nieprzewidywalnie pękać wzdłuż tych linii.
4. Nanieś cienką warstwę kleju błyskawicznego (np. Locktite 454) wokół krawędzi okna płytki głownej (rycina 1). Ustaw płytkę głowną w taki sposób, aby obszar zainteresowania był widoczny w oknie. Wywier lekki nacisk na płytkę główną. Nanieś niewielką ilość cementu dentystycznego, aby szybko spolimeryzować klej. Przytrzymaj przez 10 sekund podczas polimeryzacji kleju.
5. Nanieś niewielką ilość kleju błyskawicznego na krawędzie okna, aby uszczelnić połączenie płytki głównej z czaszką. Przykręć płytkę główną do uchwytu zwierzęcia pod mikroskopem sekcyjnym.
6. Używając wiertarki Microtorque II ustawionej na 6000 rpm i wiertła IRF 005, usuń cały nadmiar kleju z czaszki i z płytki głównej. Każdy pozostały klej na płytce głównej powinien zostać usunięty, w przeciwnym razie będzie utrudniać mocowanie pokrywy szklanej.
7. Ustaw wiertarkę na 1000 rpm i rozpocznij wiercenie w czaszce, wykonując okrąg wewnątrz okna płytki głownej o średnicy ~5 mm. Stosuj lekkie, zamiatające ruchy, jak przy rysowaniu bardzo miękkim ołówkiem. Przerywaj wiercenie co 20-30 sekund, aby usunąć pył kostny za pomocą sprężonego powietrza.
   Uwaga: Kształt otworu w płytce głównej umożliwia dodatkowy dostęp dla wiertła (dla operatora lewo- lub praworęcznego), co ułatwia wykonanie okrągłego okna czaszkowego. Dodatkowo, dwa otwory o nieregularnym kształcie zapewniają wymaganą przestrzeń do wprowadzenia elektrody Clarka lub elektrody szklanej do tkanki mózgowej pod oknem czaszkowym w celu przeprowadzenia dodatkowych pomiarów polarygraficznych lub elektrofizjologicznych.
8. W miarę postępów wiercenia wokół nienaruszonej czaszki w centrum tworzy się wgłębienie. Należy uważać, aby nie przebićciejśniałej czaszki, lecz uformować to wgłębienie o równomiernej grubości. Zachowaj szczególną ostrożność w pobliżu dużych naczyń krwionośnych – nie powinny one zostać uszkodzone, a jeśli to możliwe, nawet nie powinny być dotykane.
9. Używając jednego ramienia pęsety nr 3, podważ („odskocz”) kość w centrum okna. Nanieś kroplę sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF) na okno.
10. Delikatnie wytrzyj aCSF rogiem miękkiej chusteczki higienicznej (np. Kimwipe). Zazwyczaj opona twarda jest uszkodzona w jednym lub kilku miejscach wokół krawędzi okna. Rozpocznij od jednego z tych miejsc, delikatnie podnieś, a następnie usuń oponę twardą z powierzchni mózgu, używając pęsety nr 5 pod kątem 45°. Wybierając miejsce rozpoczęcia usuwania opony twardej, unikaj obszarów przylegających do dużych naczyń krwionośnych. W przypadku wystąpienia krwawienia nanieś kroplę aCSF i odczekaj 2-3 min, aż niewielkie krwawienie ustanie.
11. Przygotuj 0,07% agarozę niskotopliwą rozpuszczoną w aCSF. Schłodź roztopioną agarozę do temperatury ciała. Wytrzyj nadmiar aCSF z powierzchni mózgu. Wlej agarozę do okna i przykryj ją szkiełkiem przedmiotowym. Delikatnie dociśnij szkło, aby zapewnić kontakt między szkłem a płytką główną, i odczekaj 10-20 s, aż agaroza stwardnieje.
12. Usuń nadmiar agarozy z pokrywy szklanej za pomocą pęsety i miękkiej chusteczki higienicznej.
13. Nanieś niewielką ilość kleju błyskawicznego wokół szkła, aby przykleić je do płytki głównej. Nanieś niewielką ilość cementu dentystycznego, aby utwardzić klej (rycina 1).

3. Wstrzykiwanie dożylne i monitorowanie natlenienia krwi

Uwaga: Do dożylnego podania Texas red rutynowo wykorzystywaliśmy żyłę udową zamiast żyły ogonowej. Wynika to z faktu, że iniekcje do żyły udowej zapewniają bezpieczne i powtarzalne podanie barwnika w formie bolusa.

1. Obróć zwierzę częściowo na bok, aby odsłonić wewnętrzną stronę lewego uda. Użyj taśmy, aby unieruchomić zwierzę w tej pozycji.
2. Nanieś na skórę środek odkażający, a następnie 100 % etanol.
3. Wykonaj nacięcie wzdłuż przyśrodkowej części uda od kolana do spojenia łonowego. Rozdziel tkanki miękkie poprzez rozwarstwianie tępe za pomocą pęsety #5.
4. Napełnij strzykawkę 1 ml ilością 130 μl Texas Red (2,5 mg/ml). Załóż nową igłę (rozmiar 30) i ostrożnie zagnij ją pod kątem 30°, kierując ścięcie do góry. Napełnij igłę roztworem Texas Red.
5. Pod mikroskopem stereoskopowym wprowadź igłę do żyły udowej i wstrzyknij 100 μl Texas Red. Wyjmij igłę i lekko uciśnij żyłę gazikiem, aby zatamować krwawienie.
6. Zamknij skórę za pomocą szwu 4-0.
7. W celu ciągłego monitorowania SpO₂ we krwi (aby zapewnić odpowiednie utlenowanie krwi) umieść sondę oksymetru na prawym udzie (z którego wcześniej usunięto sierść).

4. Obrazowanie dwufotonowe

Uwaga: Jako źródła wzbudzenia wykorzystujemy system obrazowania wielofotonowego Olympus Fluoview1000 (pionowy) z femtosekundowym laserem Ti:Sa Spectra-Physics MaiTai HP DeepSee. Do obrazowania stosujemy obiektywy imersyjne wodne × 10 NA 0.45 (Zeiss C-Apochromat) lub × 25 NA 1.05 (Olympus XLPlan N). Obrazy rejestrujemy z głębią 12 bitów, w rozdzielczości 512 × 512 pikseli, przy czasie przebywania piksela wynoszącym 2 μs. NADH oraz dekstran Texas-Red są wzbudzane jednocześnie przy 740 nm, a fluorescencję oddziela się od światła wzbudzenia za pomocą kombinacji lustra dichroicznego i filtra blokującego bliską podczerwień (FF665-Di01; FF01-680/SP, Semrock, Rochester, NY, USA). Sygnał jest dzielony na dwa kanały za pomocą lustra dichroicznego (505DCXRU, Chroma, Rockingham, VT, USA) i filtrowany filtrami pasmowymi (NADH-Semrock FF460/80; Texas-Red-dextran-Semrock FF607/36). Moc lasera mierzona za obiektywem wynosiła 10-20 mW dla obrazowania w warstwie I oraz 20-50 mW dla obrazowania w warstwie II.

1. Przenieś mysz przygotowaną chirurgicznie na stolik mikroskopu. Wykonaj zdjęcie początkowe miejsca okna czaszkowego, korzystając z oświetlenia w polu jasnym przy powiększeniu 4x, aby służyło ono jako mapa referencyjna do rejestracji z angiografiami dwufotonowymi o większym powiększeniu.
2. Przybliż obszar zainteresowania, stosując powiększenie × 10. Wybierz obszar zainteresowania w warstwach I lub II kory (do 150 μm poniżej powierzchni opon miękkich). W przypadku potrzeby zastosowania większego powiększenia użyj obiektywu × 25.
3. Rozpocznij rejestrację serii czasowej (Rysunek 2). Zaleca się uśrednianie 3-5 klatek w celu poprawy jakości obrazu.
4. Wywołaj hipoksemię, dodając 50 % N2 do powietrza, którym oddycha zwierzę. Obniży to poziom O2 do 10 %. Potwierdź wystąpienie hipoksemii, monitorując dane z oksymetru.
5. Kontynuuj rejestrację serii czasowej podczas hipoksemii (na przykład przez 30 sekund) oraz po przywróceniu prawidłowego poziomu O2.
6. Zbierz dane do obliczenia rozkładu tlenu poprzez wykrywanie, pomiar i kwantyfikację obszaru niedotlenienia oraz utlenionych cylindrów tkanki wokół naczyń krwionośnych.

5. Przetwarzanie danych

1. Wyznacz promień cylindra tkankowego Krogha R. Można to zrobić ręcznie (Rycina 3), mierząc odległość między centrum naczynia krwionośnego a granicą, przy której wykrywana jest wysoka fluorescencja NADH.
2. Alternatywnie można zastosować opisane wcześniej¹ w materiale uzupełniającym i podsumowane w sekcji dyskusji niniejszego protokołu, obliczeniowe, niezależne od badacza, półautomatyczne wyznaczanie promienia cylindra tkankowego R oraz promienia centralnego naczynia krwionośnego r.
3. Wyznacz obszar hipoksji za pomocą oprogramowania do analizy obrazów z otwartym dostępem, np. ImageJ. W tym celu wykorzystaj sygnał NADH, określ próg wyznaczający obszar o wysokiej intensywności NADH, a następnie zmierz powierzchnię tkanki o podwyższonej fluorescencji NADH.

6. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 2 przedstawia wideo z obrazowaniem NADH/angiografią podczas przejściowej hypoksemii (w wersji PDF tego rysunku wykorzystano wybrane klatki obrazu). Stężenie tlenu w powietrzu wdechowym obniżono z 21 % do 10 % na okres 3 min. Ten poziom eksperymentalnie wywołanej hypoksemii jest wystarczający do wywołania ciężkiej hipoksji w korze mózgowej. Hipoksja doprowadziła do wzrostu fluorescencji NADH, początkowo w obszarach znajdujących się najdalej od dopływu krwi tętniczej. Należy zwrócić uwagę na wyraźne granice tkanek NADH, które reprezentują obserwowalne granice dyfuzji tlenu z mikrokrążenia korowego. Obraz na Rysunku 3 pokazuje geometrię granic dyfuzji tlenu otaczających naczynia mózgowe. Na podstawie tych granic możliwe jest wyznaczenie średnic cylindrów Krogha, zgodnie z wcześniejszym opisem ¹.

Rycina 1. (A) Mysz z przygotowanym oknem czaszkowym do obrazowania. (B) Wymiary płytki głowowej.

Rycina 2. Endogenna zielona fluorescencja NADH zwizualizowana za pomocą obrazowania dwufotonowego przez okno czaszkowe, około 50 μm poniżej powierzchni opony miękkiej. Naczynia krwionośne zwizualizowano za pomocą dekstranu Texas Red. Zawartość tlenu w wdychanym powietrzu została zmniejszona do 10% na 3 min, a następnie przywrócona do 21%. Pasek skali: 50μm.

Rycina 3. Geometria granic fluorescencji NADH. Żółty obrys wskazuje granicę hipoksji funkcjonalnej; niebieskie okręgi przedstawiają rzutowane cylindry utlenowane (Krogha). Niebieskie linie wskazują promienie cylindrów; liczby określają promienie w mikrometrach.

Dyskusja

Informacje o dyfuzji tlenu o wysokiej rozdzielczości przestrzennej są istotne dla zrozumienia, w jaki sposób regulowany jest przepływ krwi w mózgu, aby dostarczyć tlen do komórek mózgowych i zaspokoić zapotrzebowanie metaboliczne. Tradycyjne pomiary polarygraficzne tlenu z wykorzystaniem szklanych elektrod typu Clarka są wysoce inwazyjne, charakteryzują się niską rozdzielczością przestrzenną^2-3 oraz znacznym czasem odpowiedzi (rzędu sekund). Do tej pory jedyną nieinwazyjną metodą pomiaru pO₂ w tkance mózgowej było wygaszanie fosforescencji, w którym szybkość zaniku wzbudzonej sondy jest proporcjonalna do stężenia tlenu⁴. Metoda ta zapewnia dokładne wartości stężeń tlenu, ale wymaga zastosowania zastrzeżonego barwnika oraz technicznie zaawansowanego systemu obrazowania czasu życia fosforescencji. W niniejszej pracy prezentujemy prostsze, bezpośrednie podejście, które można zrealizować na standardowym systemie obrazowania dwufotonowego z dwoma kanałami fluorescencji. Nasze podejście wykorzystuje wewnętrzny sygnał tkankowy⁵ i wymaga jedynie kontrastowej wizualizacji mikrokrążenia korowego. Ze względu na nieliniowy, w zasadzie binarny wzrost fluorescencji NADH przy funkcjonalnie ograniczonych stężeniach tlenu¹, zwiększona wewnętrzna fluorescencja NADH jest obserwowana wyłącznie w obszarach z istotną, metabolicznie ograniczającą hipoksją. Ważną konsekwencją jest to, że granice tkankowe dyfuzji tlenu z korowych mikronaczyń są bezpośrednio obserwowalne jako cylindryczne zmiany intensywności endogennej fluorescencji NADH. Struktury te nazywamy cylindrami Krogha, ponieważ koncepcja cylindrycznych struktur definiujących utlenowaną objętość tkanki otaczającej naczynie krwionośne została wprowadzona przez Augusta Krogha i była niedawno obserwowana eksperymentalnie przy użyciu dwufotonowego obrazowania NADH¹. Obrazy cylindrów Krogha można gromadzić w 3D, wykonując stos obrazów wzdłuż osi z (z-stack). Są one szczególnie wyraźne w sąsiedztwie naczyń doprowadzających (arteriol) penetrujących i pokrywają się z pozarteriolarne cylindrami tkanki pozbawionej kapilar^1,4.

Aby zapewnić obiektywne wyznaczenie promienia cylindra tkankowego Krogha R (patrz sekcja 5.2), zmierzyliśmy radialne wartości intensywności pikseli w obrębie ściśle określonego segmentu między centrum cylindra a jego zewnętrzną granicą, wykorzystując funkcję „improfile” w programie Matlab. Zewnętrzną granicę segmentu należy dobrać tak, aby wykraczała poza widoczną granicę z odpowiednim marginesem bezpieczeństwa. W celu poprawy stosunku sygnału do szumu uśredniliśmy wartości wszystkich linii radialnych niezbędnych do pokrycia widocznego segmentu cylindra w odstępach 1°. Wynikowy średni profil intensywności radialnej w obrębie segmentu wykazał gwałtowny wzrost, który odpowiadał widocznej granicy tkanki R. Następnie do uśrednionego radialnego profilu intensywności dopasowaliśmy funkcję sigmoidalną (np. funkcję Boltzmanna), a jej punkt przegięcia (znany również jako x₀) przyjęliśmy jako definicję R. Odpowiadająca temu mikroangiografia dwufotonowa (Texas-red) ujawniła przekrój pojedynczego, centralnego naczynia krwionośnego w centrum cylindra. Średnicę centralnego naczynia krwionośnego można bezpośrednio wykorzystać do wyznaczenia r.

Obrazowanie NADH metodą dwufotonową zapewnia taką samą rozdzielczość przestrzenną, jak jednoczesne obrazowanie mikroangiografii korowej w wysokiej rozdzielczości. Ważną cechą dla ilościowego zastosowania tej metody jest fakt, że p₅₀ wzrostu fluorescencji NADH wynosi 3,4 ± 0,6 mm Hg ¹, a intensywność fluorescencji NADH jako funkcja mikroregionalnego pO₂ tkanki może być opisana matematycznie za pomocą funkcji sigmoidalnej. Wykazujemy, że technika ta pozwala zidentyfikować obszary mózgu najbardziej podatne na hipoksję (poprzez obniżenie zawartości tlenu w powietrzu do 10 %). Wykazujemy również, że dyfuzja tlenu przebiega zgodnie z prostym geometrycznym wzorcem okołonaczyniowym.

Kluczowym etapem tej metody jest jakość przygotowania okna czaszkowego. Operacja powinna spowodować minimalne uszkodzenia, aby nie zakłócić przepływu krwi w odsłoniętym obszarze. Istnieje obawa, że w przypadku przygotowania obciążonego chirurgicznie, kora pod oknem może być początkowo niedotleniona, co uniemożliwi przeprowadzenie jakichkolwiek znaczących eksperymentów. Prawidłowo przygotowane okno czaszkowe powinno charakteryzować się nienaruszonymi dużymi i małymi naczyniami krwionośnymi z wyraźnym przepływem krwi we wszystkich typach naczyń oraz brakiem istotnych krwawień wzdłuż krawędzi. W warunkach normoksji (PaO2 80-100 mmHg, Sp O2 97-99%) miąższ mózgu powinien wykazywać jednorodną fluorescencję NADH bez widocznych, jasnych obszarów tkanki o podwyższonej fluorescencji NADH.

Fundamentalnym ograniczeniem fizycznym naszego podejścia jest ograniczona głębokość penetracji. Niebiesko-zielona fluorescencja NADH w mózgu jest szybko tłumiona przez absorpcję hemoglobiny i rozpraszanie tkankowe przy tych długościach fal. Nawet przy zastosowaniu obiektywów imersyjnych w wodzie o wysokiej aperturze numerycznej (np. 1,05), obrazowanie NADH metodą dwufotonową jest obecnie ograniczone do warstw I i II kory. Ograniczenie to jest istotne naukowo, ponieważ metabolizm energetyczny w istocie białej lub w jej sąsiedztwie prawdopodobnie różni się od metabolizmu w istocie szarej. Jednak badanie głębokich struktur korowych, takich jak warstwy IV-VI, lub struktur podkorowych, takich jak drogi istoty białej czy prążkowie, wymagałoby zastosowania specjalistycznych mikrosoczewek, zgodnie z opisem dla kory mysiej in vivo⁶.

Pomiar granic dyfuzji tlenu oparty na NADH może być szczególnie użyteczny w połączeniu z innymi pomiarami, takimi jak analizy hiperemii funkcjonalnej oraz detekcja szybkości przepływu w naczyniach włosowatych⁷. Na przykład technikę tę można dostosować do wizualizacji hipoksji w modelach udaru oraz choroby Alzheimera (AD). Prosta geometria dyfuzji tlenu pozwala na przewidzenie gradientu tlenowego w łożyskach mikronaczyniowych w sytuacjach, gdy gęstość naczyń włosowatych jest zmniejszona⁸ (np. w AD⁹), oraz na zbadanie, czy obszary tkanki mózgowej o zmniejszonej gęstości naczyń włosowatych są bardziej narażone na uszkodzenia hipoksyczne wynikające z mikroudarów. Możliwość obrazowania w skali mikroregionalnej pozwala również na zbadanie geometrii i wielkości mikroudarów tkankowych oraz określenie objętości tkanki, w której występuje hipoksja, a także zależności między hipoksją tkankową a późniejszą śmiercią neuronów lub przebudową naczyń włosowatych¹⁰.

Wreszcie, ponieważ wzrosty fluorescencji endogennego NADH są bezpośrednim następstwem ostrej dysfunkcji mitochondriów, metoda ta stwarza możliwość wykorzystania obrazowania NADH jako specyficznego wskaźnika metabolicznego energetycznego neuronów¹¹ oraz miernika dysfunkcji mitochondriów.

Podsumowując, obrazowanie dwufotonowe endogennej fluorescencji NADH jest prostym i niedemandującym narzędziem, które może być wykorzystane do zrozumienia dostarczania i zużycia tlenu w mózgu zarówno w stanach prawidłowych, jak i patologicznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Podkładki grzejne	Poza ciepłem organizmu
Maść oftalmiczna (sztuczne łzy)	Pfizer Pharma GmbH
10% roztwór powidonu z jodem	Betadine Puredue Pharma
10% roztwór chlorku żelaza(III)
Cement	Stoelting Co.	51456
Cyjanoakrylan 454	Loctite
aCSF	Harvard Apparatus	597316
Zestaw końcówek Microtorque II	Testy Pearsona	R14-0002
Wiertła IRF 007	Fine Science Tools	19008-07
Pinceta nr 5	Fine Science Tools	11295
Pinceta #5/45	Fine Science Tools	11251-35
szkiełko nakrywkowe nr 0	Nauki o mikroskopii elektronowej	63750-01
Pomnożnik fotonowy	Hamamatsu Corp.	HC125-02
Laser ti:szafirowy Mai-Tai	Newport Corp.