Artykuł metodologiczny

Wykrywanie mikroregionalnego niedotlenienia w korze mózgowej myszy za pomocą dwufotonowego obrazowania endogennej fluorescencji NADH

DOI:

10.3791/3466

⸱

21 lutego 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester Medical Center, 2Center for Neural Development and Disease, University of Rochester Medical Center, 3Deptartment of Neurology, Center for Neural Development and Disease, University of Rochester Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy metodę bezpośredniej wizualizacji mikroregionalnego niedotlenienia tkanek w korze myszy in vivo. Opiera się na równoczesnym obrazowaniu dwufotonowym dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NADH) i mikrokrążenia korowego. Ta metoda jest przydatna do analizy zaopatrzenia tkanek w tlen w wysokiej rozdzielczości.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność mózgu do funkcjonowania przy wysokim poziomie zapotrzebowania metabolicznego zależy od ciągłego dostarczania tlenu poprzez przepływ krwi i dyfuzję tlenu w tkankach. Tutaj przedstawiamy wizualizowany protokół eksperymentalny i metodologiczny do bezpośredniej wizualizacji mikroregionalnego niedotlenienia tkanek i wnioskowania o okołonaczyniowych gradientach tlenu w korze myszy. Opiera się na nieliniowej zależności między intensywnością endogennej fluorescencji dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NADH) a ciśnieniem parcjalnym tlenu w tkance, gdzie obserwowana fluorescencja NADH w tkance gwałtownie wzrasta przy poziomie tlenu w tkankach poniżej 10 mmHg1. Stosujemy wzbudzenie dwufotonowe przy długości fali 740 nm, które pozwala na jednoczesne wzbudzenie wewnętrznej fluorescencji tkanek NADH i osocza krwi skontrastowanego z dekstranem Texas-Red. Zalety tej metody w porównaniu z istniejącymi podejściami obejmują: wykorzystuje ona wewnętrzny sygnał tkankowy i może być wykonywana przy użyciu standardowego dwufotonowego sprzętu do obrazowania in vivo; Pozwala na ciągły monitoring w całym polu widzenia z rozdzielczością głębokości ~50 μm. Pokazujemy, że obszary tkanki mózgowej najbardziej oddalone od naczyń krwionośnych mózgu odpowiadają wrażliwym obszarom zlewni, które jako pierwsze stają się funkcjonalnie niedotlenione po spadku dopływu tlenu do naczyń krwionośnych. Metoda ta pozwala na zobrazowanie mikroregionalnego utlenowania kory mózgowej i dlatego jest przydatna do badania roli niewystarczającego lub ograniczonego dopływu tlenu do tkanek w chorobach nerwowo-naczyniowych i udarze mózgu.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie zwierzęcia do obrazowania

Uwaga: Używamy dorosłych myszy c57BL. W zależności od pytania badawczego można stosować różne szczepy transgeniczne. Operacje mikronaczyniowe i pulsoksymetria są ułatwione u myszy z białym futrem (np. szczep FVB).

  1. Przygotuj miejsce operacji na stole. Wszystkie narzędzia chirurgiczne muszą być sterylizowane w autoklawie lub dezynfekowane 70% etanolem.
  2. Włóż sondę doodbytniczą i stale mierz temperaturę ciała zwierzęcia przez cały czas trwania zabiegu
  3. Znieczulić mysz za pomocą początkowo 5% izofluranu. W ciągu 15-30 s, gdy zwierzę się nie rusza, połóż je na poduszce grzewczej (37 °C) i nałóż maskę na twarz do ciągłego dostarczania powietrza zawierającego 1,3-1,5% izofluranu). Upewnij się, że zwierzę nie reaguje na bodziec bólowy (np. szczypanie ogona).
  4. Użyj sztucznego żelu łzowego, aby zakryć oczy myszy, aby zapobiec ekspozycji na suche powietrze.
  5. Za pomocą elektrycznej maszynki do golenia usuń włosy z głowy i obu ud. Nałóż depilator (np. Nair) na udo na 2 minuty, a następnie dokładnie przetrzyj, aby usunąć pozostałe włosy. To udo będzie używane do oksymetrii.
  6. Zdezynfekuj skórę głowy za pomocą 10% roztworu jodu powidonu i 70% etanolu.

2. Przygotowanie otwartego okna czaszki czaszki

  1. Zaczynając 5 mm ogonowo do czaszki, wykonaj nacięcie w skórze głowy nożyczkami i przesuń się o jeden centymetr. Przesuń skórę na boki, aby odsłonić czaszkę.
  2. Aby usunąć błony na górze czaszki, nałóż 10% roztwór chlorku żelaza na górną część czaszki. Zetrzyj nadmiar roztworu i zeskrob błony pęsetą #5 pod kątem 45°. Ważne jest, aby starannie przygotować miejsce, aby upewnić się, że płyta głowy może być bezpiecznie przymocowana do czaszki (kroki od #4 do 6).
  3. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego zidentyfikuj obszar zainteresowania. Należy pamiętać, że należy unikać szwów czaszkowych, ponieważ czaszka może pęknąć w nieprzewidywalny sposób wzdłuż tych linii.
  4. Nałożyć cienką warstwę szybkiego kleju (np. Locktite 454) wokół krawędzi okienka płyty czołowej (rysunek 1). Ustaw płytę górną w taki sposób, aby obszar zainteresowania był odsłonięty w oknie. Lekko dociśnij płytę główną. Nałóż niewielką ilość cementu dentystycznego, aby szybko spolimeryzować klej. Przytrzymaj przez 10 sekund, aż klej polimeryzuje.
  5. Nałóż niewielką ilość szybkiego kleju na krawędzie okna, aby uszczelnić płytę głowy i czaszkę. Przykręć płytę głowicy do uchwytu na zwierzę pod lunetą preparacyjną.
  6. Używając zestawu wierteł Microtorque II o prędkości 6000 obr./min i wiertła IRF 005, usuń cały nadmiar kleju z czaszki i płyty głowicy. Pozostały klej na płycie głowicy należy usunąć, ponieważ w przeciwnym razie będzie on przeszkadzał w mocowaniu szklanej pokrywy.
  7. Ustaw wiertło na 1000 obr./min i rozpocznij wiercenie czaszki, wykonując okrąg wewnątrz okienka płyty głowicy o średnicy ~5 mm. Wykonuj lekkie, zamaszyste ruchy, tak jakbyś rysował bardzo miękkim ołówkiem. Przerywaj wiercenie co 20-30 sekund, aby usunąć pył kostny za pomocą sprężonego powietrza.
    Uwaga: Kształt otworu w płycie głowicy umożliwia dodatkowy dostęp dla wiertła (dla chirurga lewo- i praworęcznego), co ułatwia stworzenie okrągłego okna czaszki. Ponadto dwa otwory o nietypowych kształtach zapewniają wymaganą przestrzeń do wprowadzenia elektrody Clarka lub elektrody szklanej do tkanki mózgowej pod oknem czaszki w celu wykonania dodatkowych pomiarów polarograficznych lub elektrofizjologicznych.
  8. W miarę postępu wiercenia wokół nienaruszonej czaszki pośrodku tworzy się nora. Uważaj, aby nie przebić się przez przerzedzoną czaszkę, ale aby ta nora miała równą grubość. Zachowaj szczególną ostrożność wokół dużych naczyń krwionośnych - nie powinny być naruszone i, jeśli to możliwe, nawet nie powinny być dotykane.
  9. Użyj jednej "nogi" pęsety #3 aby podnieść ("strzepnąć") kość znajdującą się w środku okna. Nałóż kroplę sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF) na okno.
  10. Delikatnie przetrzyj płyn CSF za pomocą rogu miękkiej bibułki (np. Kimwipe). Zwykle opona twarda jest uszkodzona w jednym lub kilku miejscach wokół krawędzi okna. Zaczynając od jednego z tych miejsc, delikatnie podnieś, a następnie usuń oponę twardą z powierzchni mózgu, używając pęsety pod kątem 45° #5. Wybierając miejsce, w którym należy rozpocząć usuwanie opony twardej, unikaj obszarów przylegających do dużych naczyń krwionośnych. Jeśli wystąpi krwawienie, nałóż kroplę płynu mózgowo-rdzeniowego i odczekaj 2-3 minuty, aż niewielkie krwawienie ustanie.
  11. Przygotować 0,07% niskotopliwej agarozy rozpuszczonej w CSF) Doprowadź stopioną agarozę do temperatury ciała. Zetrzyj nadmiar płynu mózgowo-rdzeniowego z powierzchni mózgu. Wlej agarozę do okna i przykryj szklanym szkiełkiem. Delikatnie dociśnij szklankę, aby zetknęła się ze szklanką a płytą główną, i odczekaj 10-20 sekund, aż agaroza stwardnieje.
  12. Usuń nadmiar agarozy ze szklanej pokrywy za pomocą pęsety i miękkiej bibuły.
  13. Nałóż niewielką ilość szybkiego kleju na szkło, aby przykleić szkło do płyty głównej. Nałóż niewielką ilość cementu dentystycznego, aby zestalić klej (rysunek 1).

3. Monitorowanie iniekcji dożylnych i natlenienia krwi

Uwaga: Rutynowo używaliśmy żyły udowej do dożylnego podawania czerwieni teksańskiej, a nie żyły ogonowej. Dzieje się tak, ponieważ iniekcje do żyły udowej zapewniają bezpieczne i powtarzalne wstrzyknięcia barwnika w bolusie.

  1. Odwróć zwierzę częściowo, aby odsłonić wewnętrzną stronę lewego uda. Użyj taśmy, aby zabezpieczyć zwierzę w tej pozycji.
  2. Nałóż peeling antyseptyczny, a następnie 100% etanol na skórę.
  3. Wykonaj nacięcie wzdłuż przyśrodkowej części uda od kolana do spojenia łonowego. Oddziel tkanki miękkie przez wycięcie za pomocą pęsety #5.
  4. Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml 130 μl Texas Red (2,5 mg/ml). Zamocuj nową igłę (rozstaw 30) i zegnij ją ostrożnie pod kątem 30°, utrzymując skos do góry. Napełnij igłę roztworem Texas Red.
  5. Pod mikroskopem preparacyjnym wprowadzić igłę do żyły udowej i wstrzyknąć 100 μl Texas Red. Wyjąć igłę i lekko przycisnąć żyłę gazą, aby zatamować krwawienie.
  6. Zamknij skórę za pomocą szwu 4-0.
  7. W celu ciągłego monitorowania SpO2 krwi (w celu zapewnienia odpowiedniego natlenienia krwi) należy umieścić sondę pulsoksymetru na prawym udzie (z którego wcześniej usunięto włosy).

4. Obrazowanie dwufotonowe

Uwaga: Używamy systemu obrazowania wielofotonowego Olympus Fluoview1000 (pionowego) z laserem femtosekundowym Ti:Sa firmy Spectra-Physics MaiTai HP DeepSee jako źródłem wzbudzenia. Do obrazowania używamy obiektywów × 10 NA 0,45 (Zeiss C-Apochromat) lub × 25 NA 1,05 (Olympus XLPlan N). Wykonujemy zdjęcia z 12-bitową głębią w rozdzielczości 512 × 512 pikseli z czasem przebywania pikseli 2 μs. NADH i Texas-Red-dextran są jednocześnie wzbudzane przy długości fali 740 nm, a fluorescencja jest oddzielana od światła wzbudzającego za pomocą kombinacji dichroicznego lustra i filtra blokującego bliską podczerwień (FF665-Di01; FF01-680/SP, Semrock, Rochester, NY, USA) podzielony na dwa kanały za pomocą lustra dichroicznego (505DCXRU, Chroma, Rockingham, VT, USA) i filtrowanego pasmowo (NADH-Semrock FF460/80Texas-Red-dextran-Semrock FF607/36). Moc lasera mierzona za obiektywem wynosiła 10-20 mW dla obrazowania w warstwie I i 20-50 mW dla obrazowania w warstwie II.

  1. Przenieś chirurgicznie przygotowaną mysz do etapu mikroskopu. Wykonaj wstępne zdjęcie miejsca okna czaszki przy użyciu jasnego oświetlenia pola przy 4-krotnym powiększeniu, aby wykorzystać je jako mapę referencyjną do rejestracji z angiografiami dwufotonowymi o większym powiększeniu.
  2. Powiększ obszar zainteresowania za pomocą powiększenia × 10. Wybierz obszar zainteresowania w warstwach korowych I lub II (do 150 μm poniżej powierzchni kory). Jeśli pożądane jest większe powiększenie, użyj obiektywu × 25
  3. Rozpocznij nagrywanie szeregów czasowych (Rysunek 2). Zalecamy użycie średnio 3-5 klatek, aby zwiększyć jakość obrazu.
  4. Wywołać hipoksemię, dodając 50 % N2 do powietrza, którym oddycha zwierzę. W ten sposób poziom O2 wzrośnie do 10%. Sprawdź hipoksemię, monitorując dane z pulsoksymetru.
  5. Kontynuuj nagrywanie szeregów czasowych przez hipoksemię (na przykład przez 30 sekund) i po przywróceniu normalnego poziomu O2.
  6. Zbierz dane do obliczenia rozkładu tlenu, wykrywając, mierząc i określając ilościowo obszar niedotlenienia i natlenionych cylindrów tkankowych wokół naczyń krwionośnych.

5. Przetwarzanie danych

  1. Określ promień cylindra tkanki Krogh R. Można to zrobić ręcznie (ryc. 3), mierząc odległość między środkiem naczynia krwionośnego a granicą, przy której wykrywana jest wysoka fluorescencja NADH.
  2. Alternatywnie, można skorzystać z niezależnego od badacza obliczeniowego, półautomatycznego oznaczania promienia cylindra tkankowego R i centralnego naczynia krwionośnego r, które zostało opisane wcześniej1 w formie uzupełniającej i podsumowane w sekcji dyskusji niniejszego protokołu.
  3. Określ obszar niedotlenienia za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania do analizy obrazu, np. ImageJ. Aby to zrobić, użyj sygnału NADH, zdefiniuj próg, który wyznacza obszar o wysokim natężeniu NADH, a następnie zmierz obszar o podwyższonej fluorescencji tkanek NADH.

6. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 2 pokazuje film z obrazami NADH/angiografii podczas przejściowej hipoksemii (dla wersji PDF tego rysunku użyto wybranych zdjęć). Stężenie tlenu we wdychanym tlenie obniżono z 21 % do 10 % na okres 3 minut. Ten poziom eksperymentalnie wywołanej hipoksemii jest wystarczający do wywołania ciężkiego niedotlenienia w korze mózgowej. Niedotlenienie doprowadziło do wzrostu fluorescencji NADH, początkowo w obszarach najbardziej oddalonych od dopływu krwi tętniczej. Zwróć uwagę na ostre granice tkanek NADH, które reprezentują obserwowalne granice tkankowe dyfuzji tlenu z mikrokrążenia korowego. Rysunek na rysunku 3 przedstawia geometrię granic dyfuzji tlenu otaczających naczynia mózgowe. Z tych granic można wywnioskować średnice cylindrów Krogh, jak opisano wcześniej 1.

figure-protocol-1
Rysunek 1. (A) Mysz z okienkiem czaszkowym przygotowanym do obrazowania. (B) Wymiary płyty czołowej.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Endogenna zielona fluorescencja NADH uwidoczniona za pomocą obrazowania dwufotonowego przez okno czaszki, około 50 μm poniżej powierzchni czaszki. Naczynia krwionośne są uwidocznione za pomocą dekstranu Texas Red. Tlen we wdychanym powietrzu został zredukowany do 10% na 3 min, a następnie przywrócony na 21%. Podziałka: 50μm.

figure-protocol-3
Rysunek 3. Geometria granic fluorescencji NADH. Żółty kontur pokazuje granicę niedotlenienia funkcjonalnego; niebieskie kółka pokazują rzutowane butle natlenione (Krogh). Niebieskie linie pokazują promienie cylindrów; Liczby pokazują promienie w mikrometrach.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Informacje o dyfuzji tlenu o wysokiej rozdzielczości przestrzennej są ważne dla zrozumienia, w jaki sposób przepływ krwi w mózgu jest regulowany w celu dostarczania tlenu do komórek mózgowych i zaspokajania zapotrzebowania metabolicznego. Tradycyjne polarograficzne pomiary tlenu przy użyciu szklanych elektrod typu Clarka są wysoce inwazyjne i charakteryzują się niską rozdzielczością przestrzenną2-3 oraz znaczącym (drugim zakresem) czasem reakcji. Do tej pory jedyną nieinwazyjną metodą pomiaru pO2 w tkance mózgowej jest wygaszanie fosforescencyjne, gdzie szybkość zaniku wzbudzonej sondy jest proporcjonalna do stężenia tlenu4. Ta metoda zapewnia dokładne stężenia tlenu, ale wymaga opatentowanego barwnika i technicznie zaawansowanego systemu obrazowania żywotności fosforescencji. W tym miejscu demonstrujemy proste, prostsze podejście, które można przeprowadzić na standardowym systemie obrazowania dwufotonowego z dwoma kanałami fluescencji. Nasze podejście wykorzystuje wewnętrzny sygnał tkankowy5 i wymaga jedynie kontrastowej wizualizacji mikrokrążenia korowego. Ze względu na nieliniowy, zasadniczo binarny wzrost fluorescencji NADH przy funkcjonalnie ograniczających stężeniach tlenu1, zwiększoną wewnętrzną fluorescencję NADH obserwuje się tylko w obszarach o znaczącym, metabolicznie ograniczającym niedotlenieniu. Ważną implikacją jest to, że granice tkankowe dyfuzji tlenu z mikronaczyń korowych są bezpośrednio obserwowane przez cylindrycznie ukształtowane zmiany intensywności endogennej fluorescencji NADH. Nazywamy te struktury cylindrami Krogha, ponieważ koncepcja struktur o cylindrycznym kształcie, które definiują natlenioną objętość tkanki otaczającej naczynie krwionośne, została wprowadzona przez Augusta Krogha i została ostatnio eksperymentalnie zaobserwowana przy użyciu dwufotonowego obrazowania NADH1. Obrazy cylindrów Krogh można zbierać w 3D, wykonując z-stos ramek obrazu. Są one szczególnie widoczne w pobliżu tętniczek penetrujących i są zgodne z zubożonymi w naczynia włosowate cylindrami tkanki okołotętniczej1,4.

Aby zapewnić obiektywne określenie promienia cylindra tkankowego Krogha R (patrz sekcja 5.2), zmierzyliśmy ich wartości intensywności pikseli promieniowych w dobrze zdefiniowanym segmencie między środkiem cylindra a zewnętrzną granicą za pomocą funkcji Matlab "improfile". Zewnętrzna granica segmentu powinna być tak dobrana, aby wystawała z marginesem bezpieczeństwa poza widoczną granicę. Aby poprawić stosunek sygnału do szumu, uśredniliśmy wszystkie linie promieniowe potrzebne do pokrycia widocznego segmentu cylindra w krokach co 1°. Uzyskany w ten sposób średni profil intensywności promieniowej w obrębie segmentu wykazywał gwałtowny wzrost, który odpowiadał widocznej granicy tkankowej R. Dopasowujemy funkcję sigmoidalną (np. funkcję Boltzmanna) do uśrednionego profilu natężenia promieniowego i używamy jej punktu przegięcia (znanego również jako x0) jako definicji R. Odpowiednia mikroangiografia dwufotonowa (Texas-red) ujawniła przekrój poprzeczny pojedynczego centralnego naczynia krwionośnego w środku cylindra. Średnicę centralnego naczynia krwionośnego można bezpośrednio zastosować do określenia r.

Dwufotonowe obrazowanie NADH zapewnia taką samą rozdzielczość przestrzenną, jak równoczesne obrazowanie mikroangiografii korowej o wysokiej rozdzielczości. Ważną cechą dla ilościowego zastosowania tej metody jest to, że zmierzono p50 wzrostu fluorescencji NADH na 3,4 ± 0,6 mm Hg 1 i że intensywność fluorescencji NADH w funkcji mikroregionalnej tkanki pO2 można matematycznie opisać za pomocą funkcji sigmoidalnej. . Pokazujemy, że technika ta pozwala zidentyfikować obszary mózgu, które są najbardziej podatne na niedotlenienie (poprzez zmniejszenie zawartości tlenu w powietrzu do 10%). Pokazujemy również, że dyfuzja tlenu przebiega zgodnie z prostym geometrycznym wzorem okołonaczyniowym.

Jednym z kluczowych etapów tej metody jest jakość przygotowania okna czaszkowego. Operacja powinna spowodować minimalne uszkodzenia, aby nie zakłócić przepływu krwi do odsłoniętego obszaru. Istnieje obawa, że w preparacie upośledzonym chirurgicznie kora pod oknem może być na początku niedotleniona, co uniemożliwia jakiekolwiek znaczące eksperymenty. Dobrze przygotowane okno czaszki powinno mieć nienaruszone główne i mniejsze naczynia krwionośne z wyraźnym przepływem krwi we wszystkich typach naczyń i bez znacznego krwawienia wzdłuż krawędzi. W warunkach normoksycznych (PaO2 80-100 mmHg, Sp O2 97-99%) miąższ mózgu powinien wykazywać jednolitą, jednorodną fluorescencję NADH bez widocznych, jasnych plam tkankowych o podwyższonej fluorescencji NADH.

Podstawowym fizycznym ograniczeniem naszego podejścia jest ograniczona głębokość penetracji. Niebiesko-zielona fluorescencja NADH w mózgu jest szybko tłumiona przez absorpcję hemoglobiny i rozpraszanie tkanek na tych długościach fal. Nawet przy dużej aperturze numerycznej (np. 1,05) obiektywy zanurzenia w wodzie, dwufotonowe obrazowanie NADH jest obecnie ograniczone do warstw korowych I i II. To ograniczenie jest naukowo istotne, ponieważ metabolizm energetyczny w istocie białej lub w jej pobliżu będzie prawdopodobnie różnił się od metabolizmu istoty szarej. Jednak badanie głębokich struktur korowych, takich jak warstwy IV-VI lub struktur podkorowych, takich jak drogi istoty białej lub prążkowie, wymagałoby użycia specjalistycznych mikrosoczewek, jak opisano w korze myszy in vivo6.

Pomiar granic dyfuzji tlenu oparty na NADH może być szczególnie przydatny w połączeniu z innymi pomiarami, takimi jak analiza funkcjonalnego przekrwienia i wykrywanie natężenia strumienia kapilarnego7. Na przykład technikę tę można dostosować do wizualizacji niedotlenienia w modelach udaru mózgu i choroby Alzheimera (AD). Prosta geometria dyfuzji tlenu pozwala przewidzieć gradient tlenu w łóżkach mikronaczyniowych w warunkach, w których gęstość naczyń włosowatych jest zmniejszona8 (np. AD9) i zbadać, czy obszary tkanki mózgowej o zmniejszonej gęstości naczyń włosowatych są narażone na zwiększone ryzyko uszkodzenia hipoksji z powodu mikroudarów. Możliwość obrazowania mikroregionalnego pozwala również na zbadanie geometrii i wielkości mikropociągnięć tkanek oraz określenie objętości tkanki, w której dochodzi do niedotlenienia, a także związku między niedotlenieniem tkanek a późniejszą śmiercią neuronów lub przebudową naczyń włosowatych10.

Wreszcie, ponieważ wzrost endogennej fluorescencji NADH jest bezpośrednią konsekwencją ostrej dysfunkcji mitochondriów, metoda ta stwarza możliwość wykorzystania obrazowania NADH jako specyficznego reportera metabolizmu energii neuronalnej11 i wskaźnika zastępczego dysfunkcji mitochondriów.

Podsumowując, dwufotonowe obrazowanie endogennej fluorescencji NADH jest prostym, niewymagającym narzędziem, które można wykorzystać do zrozumienia dostarczania i zużycia tlenu w mózgu zarówno w stanach normalnych, jak i patologicznych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy dr Maiken Nedergaard (University of Rochester Medical Center) za projekt płyty czołowej. Praca została wsparta nagrodami NIH dla S.D (R01DA026325 i P30AI078498 oraz grantami fundacji dla KK (program obrazowania mózgu i immunoobrazowania fundacji DANA, American Heart Association 0635595T i ALS Association [#1112)]).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Poduszki grzewczeBeyond Bodi Heat
Maść okulistyczna (sztuczne łzy)Pfizer Pharma GmbH
Powidon-jod 10% roztwórBetadine Puredue Pharma Chlorek żelaza
10% roztwór
CementStoelting Co.51456

Cyjanoakrylowy 454

Loctite
aCSFHarvard Apparatus597316
Zestaw rękojeści Microtorque IIPearson AssessmentsR14-0002
IRF 007 WiertłaFine Science Tools19008-07
Kleszcze #5Narzędzia do nauki11295
Kleszcze #5/45Narzędzia do nauki11251-35
#0 Szkiełko nakrywkowe szklaneMikroskopia elektronowa Nauki63750-01
Rurka fotopowielaczaHamamatsu Corp.HC125-02
Ti: Szafirowy laser Mai-TaiNewport Corp.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kasischke, K. A. Two-photon NADH imaging exposes boundaries of oxygen diffusion in cortical vascular supply regions. J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 31, 68-81 (2011).
  2. Ndubuizu, O., LaManna, J. C. Brain tissue oxygen concentration measurements. Antioxid. Redox. Signal. 9, 1207-1219 (2007).
  3. Sharan, M., Vovenko, E. P., Vadapalli, A., Popel, A. S., Pittman, R. N. Experimental and theoretical studies of oxygen gradients in rat pial microvessels. J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 28, 1597-1604 (2008).
  4. Sakadzic, S. Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue. Nat. Methods. 7, 755-759 (2010).
  5. Vishwasrao, H. D., Heikal, A. A., Kasischke, K. A., Webb, W. W. Conformational dependence of intracellular NADH on metabolic state revealed by associated fluorescence anisotropy. J. Biol. Chem. 280, 25119-25126 (2005).
  6. Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 15741-15746 (1998).
  7. Brown, W. R., Thore, C. R. Review: cerebral microvascular pathology in ageing and neurodegeneration. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 37, 56-74 (2011).
  8. de la Torre, J. C. Impaired brain microcirculation may trigger Alzheimer's disease. Neurosci. Biobehav. Rev. 18, 397-401 (1994).
  9. Brown, C. E., Boyd, J. D., Murphy, T. H. Longitudinal in vivo imaging reveals balanced and branch-specific remodeling of mature cortical pyramidal dendritic arbors after stroke. J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 30, 783-791 (2010).
  10. Wilson, D. F., Erecinska, M., Drown, C., Silver, I. A. The oxygen dependence of cellular energy metabolism. Arch. Biochem. Biophys. 195, 485-493 (1979).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Two photon ImagingNADH FluorescenceMouse CortexTissue HypoxiaCranial WindowBlood Vessel LabelingOxygen GradientsCerebral Blood FlowHypoxemia InductionFluorescence Microscopy

Powiązane artykuły