Pomiar zakażenia $\gamma$HV68 u myszy

Podsumowanie

γ-herpeswirusy (γ-HVs) ustanawiają dożywotnią persistencję w organizmie gospodarza. Zakażenie myszy wirusem γ-HV68 zapewnia genetycznie dostępny model in vivo do charakteryzacji cyklu życiowego i patogenezy γ-HVs. Niniejszy protokół opisuje wykrywanie i oznaczanie ilościowe zakażenia γHV68 w fazie ostrej i latentnej po zakażeniu, z wykorzystaniem metody tworzenia blaszek, metody ognisk zakaźnych oraz analizy qPCR.

Streszczenie

Gammaherpeswirusy (γ-HVs) charakteryzują się zdolnością do wywoływania utajnych infekcji komórek limfoidalnych¹. Wąski zakres gospodarzy ludzkich γ-HVs, takich jak EBV i KSHV, znacznie utrudnił szczegółowe badania patogenetyczne. Mysi gammaherpeswirus 68 (γHV68) wykazuje liczne podobieństwa genetyczne i biologiczne z ludzkimi γ-HVs i jest naturalnym patogenem gryzoni z rodziny muridów². W związku z tym ocena infekcji γHV68 w liniach myszy inbredalnych na różnych etapach infekcji wirusowej stanowi istotny model dla zrozumienia cyklu życiowego wirusa oraz patogenezy podczas infekcji γ-HVs.

Po inokulacji donosowej zakażenie γHV68 prowadzi do ostrej wiremii w płucach, która następnie przechodzi w zakażenie latentne splenocytów i innych komórek, mogące ulegać reaktywacji w ciągu całego życia gospodarza^3,4. W niniejszym protokole opiszemy, jak wykorzystać metodę płytek (plaque assay) do oceny miana wirusa zakaźnego w homogenatach płuc na monowarstwach komórek Vero we wczesnej fazie (5–7 dni) po zakażeniu donosowym (dpi). Podczas gdy ostre zakażenie jest w dużej mierze eliminowane 2–3 tygodnie po infekcji, zakażenie latentne γHV68 ustala się około 14. dpi i jest następnie utrzymywane w śledzionie myszy. Zakażenie latentne zazwyczaj dotyczy bardzo niewielkiej populacji komórek w zakażonych tkankach, w których wirus pozostaje w stanie uśpienia i wycisza większość ekspresji swoich genów. Splenocyty zakażone latentnie spontanicznie reaktywują wirusa po przeszczepieniu do hodowli tkankowej, co można odtworzyć za pomocą testu centrów zakaźnych (IC assay) w celu określenia latentnego ładunku wirusowego. Aby dodatkowo oszacować liczbę kopii genomu wirusowego w tkankach zakażonych ostro i/lub latentnie, stosuje się ilościową reakcję PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) ze względu na jej maksymalną czułość i dokładność. Połączona analiza wyników qPCR i metody płytek i/lub testu IC pozwoli na ujawnienie profilów czasowo-przestrzennych replikacji i zakaźności wirusa in vivo.

Protokół

Poniższy protokół opisuje badanie mian wirusa oraz ładunku genomu wirusowego w litycznym i latentnym cyklu infekcji γHV68 u myszy, co teoretycznie może zostać wykorzystane do oceny infekcji innymi wirusami o podobnym stylu życia jak γHV68.

1. Amplifikacja γHV68

1. Rozmrozić zamrożoną fiolkę z γHV68 w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.
2. Dodać inokulum wirusa do hodowli komórek NIH3T12 lub 3T3 (~50% konfluencji) w szalkach 10 cm i inkubować zainfekowane komórki w temperaturze 37 °C w 5% CO₂.
3. Oceniać hodowlę pod mikroskopem pod kątem efektu cytopatycznego (CPE) i zebrać pożywkę w momencie, gdy ponad 80%....

Dyskusja

γHV68 jest powszechnie wykorzystywany jako model do badania patogenezy ludzkich γ-HV^2,4,5. W niniejszym protokole opisano trzy rutynowo stosowane metody, w tym test plackowy do oznaczania miana wirusa zakaźnego, test IC do oceny latentnego ładunku wirusowego oraz qPCR do oznaczania ładunku genomu wirusowego, w celu oceny ostrej i latentnej infekcji γHV68 po inokulacji donosowej u myszy.

Metoda pęlakowa jest szeroko stosowana do oznaczania miana wirusa w zainfekowanych komórkach lub.......