Pomiar zakażenia $\gamma$HV68 u myszy

Podsumowanie

γ-herpeswirusy (γ-HVs) ustanawiają dożywotnią persistencję w organizmie gospodarza. Zakażenie myszy wirusem γ-HV68 zapewnia genetycznie dostępny model in vivo do charakteryzacji cyklu życiowego i patogenezy γ-HVs. Niniejszy protokół opisuje wykrywanie i oznaczanie ilościowe zakażenia γHV68 w fazie ostrej i latentnej po zakażeniu, z wykorzystaniem metody tworzenia blaszek, metody ognisk zakaźnych oraz analizy qPCR.

Streszczenie

Gammaherpeswirusy (γ-HVs) charakteryzują się zdolnością do wywoływania utajnych infekcji komórek limfoidalnych¹. Wąski zakres gospodarzy ludzkich γ-HVs, takich jak EBV i KSHV, znacznie utrudnił szczegółowe badania patogenetyczne. Mysi gammaherpeswirus 68 (γHV68) wykazuje liczne podobieństwa genetyczne i biologiczne z ludzkimi γ-HVs i jest naturalnym patogenem gryzoni z rodziny muridów². W związku z tym ocena infekcji γHV68 w liniach myszy inbredalnych na różnych etapach infekcji wirusowej stanowi istotny model dla zrozumienia cyklu życiowego wirusa oraz patogenezy podczas infekcji γ-HVs.

Po inokulacji donosowej zakażenie γHV68 prowadzi do ostrej wiremii w płucach, która następnie przechodzi w zakażenie latentne splenocytów i innych komórek, mogące ulegać reaktywacji w ciągu całego życia gospodarza^3,4. W niniejszym protokole opiszemy, jak wykorzystać metodę płytek (plaque assay) do oceny miana wirusa zakaźnego w homogenatach płuc na monowarstwach komórek Vero we wczesnej fazie (5–7 dni) po zakażeniu donosowym (dpi). Podczas gdy ostre zakażenie jest w dużej mierze eliminowane 2–3 tygodnie po infekcji, zakażenie latentne γHV68 ustala się około 14. dpi i jest następnie utrzymywane w śledzionie myszy. Zakażenie latentne zazwyczaj dotyczy bardzo niewielkiej populacji komórek w zakażonych tkankach, w których wirus pozostaje w stanie uśpienia i wycisza większość ekspresji swoich genów. Splenocyty zakażone latentnie spontanicznie reaktywują wirusa po przeszczepieniu do hodowli tkankowej, co można odtworzyć za pomocą testu centrów zakaźnych (IC assay) w celu określenia latentnego ładunku wirusowego. Aby dodatkowo oszacować liczbę kopii genomu wirusowego w tkankach zakażonych ostro i/lub latentnie, stosuje się ilościową reakcję PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) ze względu na jej maksymalną czułość i dokładność. Połączona analiza wyników qPCR i metody płytek i/lub testu IC pozwoli na ujawnienie profilów czasowo-przestrzennych replikacji i zakaźności wirusa in vivo.

Protokół

Poniższy protokół opisuje badanie mian wirusa oraz ładunku genomu wirusowego w litycznym i latentnym cyklu infekcji γHV68 u myszy, co teoretycznie może zostać wykorzystane do oceny infekcji innymi wirusami o podobnym stylu życia jak γHV68.

1. Amplifikacja γHV68

1. Rozmrozić zamrożoną fiolkę z γHV68 w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.
2. Dodać inokulum wirusa do hodowli komórek NIH3T12 lub 3T3 (~50% konfluencji) w szalkach 10 cm i inkubować zainfekowane komórki w temperaturze 37 °C w 5% CO₂.
3. Oceniać hodowlę pod mikroskopem pod kątem efektu cytopatycznego (CPE) i zebrać pożywkę w momencie, gdy ponad 80% komórek wykazuje CPE, około 4–5 dni po infekcji. Aby zmaksymalizować wydajność wirusa, zainfekowaną hodowlę komórkową można dwukrotnie zamrozić i rozmrozić w celu uwolnienia wszystkich cząstek γHV68 związanych z komórkami.
4. Wirować zebraną pożywkę przy 1000 rpm przez 5 min w temperaturze pokojowej (RT), aby usunąć resztki komórkowe.
5. Ostrożnie przenieść supernatanty do nowych probówek (do wirowania wysokoprędkościowego), nie dotykając osadu komórkowego na dnie.
6. Wirować przy wysokiej prędkości 12 000 rpm (dla Sorvall SA-600) w temperaturze 4 °C przez co najmniej 1,5 h, aby skoncentrować cząstki wirusa.
7. Wylać supernatanty do 10% roztworu wybielacza i ostrożnie resuspendować osad (wirus i pozostałości komórkowe) w 1 ml DMEM bez surowicy. Przenieść resuspendowany osad do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml i dokładnie wymieszać za pomocą wortexa.
8. Wirować przez 2 min z maksymalną prędkością, aby usunąć pozostałe resztki komórkowe, a następnie przenieść supernatant (stok wirusa) do nowej probówki. Jest to końcowy stok wirusa do infekcji. Miano stoku wirusa określa się za pomocą testu plackowego (patrz poniżej).

2. Infekcja donosowa myszy wirusem γHV68

1. Zakaź myszy w wieku ok. 6 tygodni dawką 1 000 ~ 5 000 jednostek tworzących plaki (PFU) γHV68 na mysz.
2. Zanurcz myszy poprzez wstrzyknięcie do jamy otrzewnowej ketaminy/ksylazyny (60 μl/mysz mieszaniny 80 mg/ml ketaminy i 12 mg/ml ksylazyny). Monitoruj głębokość znieczulenia, uciskając palec myszy. Zazwyczaj proces ten trwa ~ 5-10 min. Jeśli myszy nie zostaną w pełni znieczulone, mogą wykrztusić wirusa podczas kichania.
3. Gdy mysz zostanie w pełni znieczulona, za pomocą pipety podaj ~ 30 μl PBS zawierającego γHV68 (po 15 μl do każdego nozdrza), wpuszczając krople powoli, ale jednostajnie. Upewnij się, że mysz rzeczywiście wdycha krople, nie tworząc pęcherzyków powietrza.
4. Pozostaw mysz do wybudzenia na 10-15 min i monitoruj jej stan (np. przytomność, oddychanie itp.) przed powrotem do klatki. Zwierzęta są codziennie sprawdzane pod kątem objawów choroby oraz dostępności pożywienia, wody i stanu ściółki. W przypadku wystąpienia klinicznych objawów choroby, bólu lub stresu, przeprowadzone zostaną rutynowe badania diagnostyczne w celu ustalenia etiologii. Zwierzęta, które stracą ponad 20% masy ciała, zostaną odnotowane pod kątem maksymalnego spadku wagi i poddane eutanazji. Ostateczna decyzja o przeprowadzeniu eutanazji należy do lekarza weterynarii klinicznej i jest podejmowana po konsultacji z głównym badaczem.

3. Test plackowy w celu oznaczenia miana wirusa w płucach w fazie ostrej zakażenia

1. Miana zakaźności wirusa określa się na podstawie tworzenia płytek na monowarstwach komórek Vero.
2. Komórki Vero wysiewa się w zagęszczeniu 2,5x10⁴ komórek/dołek w płytkach 12-dołkowych w dniu poprzedzającym test płytek. Komórki powinny być równomiernie rozłożone, a ich gęstość w dniu testu powinna wynosić 30 - 40%.
3. Przygotować medium nakładkowe z 0,5% (w/v) metylocelulozy (MC) (Tabela 1).
4. Myszom zakażonym γHV68 przeprowadzić eutanazję 5-7 dni po zakażeniu donosowym w celu oznaczenia mian wirusa w fazie ostrej w płucach. Do eutanazji należy podać domięśniowo Ketaminę HCl (80-100 mg/kg SC, IM, IP), a następnie dożylnie przedawkować Na pentobarbital (30-50 mg/kg IP). Metoda ta jest zatwierdzona przez American Veterinary Medical Association.
5. Pobrać płuca i przepłukać je dwukrotnie 1 x PBS, aby usunąć komórki krwi. Jedną stronę płuc zebrać w 1 ml lodowatego, kompletnego medium DMEM i przechowywać w lodzie. Drugą stronę płuc szybko zamrozić i przechowywać w temperaturze -80°C w celu zbadania ładunku viralnego DNA w płucach za pomocą qPCR (patrz poniżej).
6. Użyć homogenizatora tkankowego do homogenizacji tkanek płuc z maksymalną prędkością przez 1 s, a następnie przeprowadzić trzy cykle zamrażania i rozmrażania. Homogenizator należy przemywać 70% etanolem na każdym etapie przy zmianie próbki.
7. Zcentryfugować zhomogenizowaną tkankę przy 3 000 rpm przez 10 min w temperaturze 4 °C. Zebrać nadsącz i przenieść do nowych probówek do testu płytek.
8. Przygotować rozcieńczenia seryjne (zazwyczaj od 10° do 10^-8) próbek homogenatu płuc w 1,5 ml probówkach do mikrocentryfugi za pomocą DMEM i mieszania w wortexie. Napełnić odpowiednią liczbę probówek 540 μl DMEM i dodać 60 μl homogenatu do pierwszej probówki. Przenieść 60 μl z pierwszej probówki do kolejnej i tak dalej.
9. Odssać medium z przygotowanych monowarstw Vero w płytkach 12-dołkowych i nanieść 200 μl/dołek seryjnie rozcieńczonego homogenatu zawierającego zakaźne wirusy w kolejności odwrotnej (od 10^-8 do 10°). Użyć dwóch dołków dla każdego miareczkowania (w duplikacie).
10. Inkubować komórki Vero z inokulatem wirusa przez 1 h w temperaturze 37 °C. Delikatnie obracać płytkami co 15 minut, aby równomiernie rozłożyć wirusa na monowarstwie.
11. Usunąć inokulaty i zastąpić je 2 ml/dołek medium nakładkowego (Tabela 1). Inkubować płytki przez jeden tydzień w temperaturze 37 °C.
12. Usunąć medium nakładkowe (nie musi być całkowicie) i zastąpić je medium do utrwalania/barwienia w teście płytek (Tabela 1), a następnie inkubować przez co najmniej 1 h w RT.
13. Po wyschnięciu płytek policzyć liczbę dobrze odizolowanych płytek dla każdego rozcieńczenia. Aby zminimalizować błąd, zlicza się tylko dołki zawierające od 10 do 100 płytek.
14. Obliczyć miano wirusa, korzystając z następującego wzoru: miano (pfu/ml) = [(liczba płytek/dołek] / [objętość inokulatu/dołek]) x czynnik rozcieńczenia.

4. Analiza ognisk zakaźnych w celu określenia ładunku wirusa w splenocytach zakażonych latentnie

1. Ładunek latentny wirusa określa się za pomocą testu ognisk zakaźnych (IC) na monowarstwie komórek Vero. Dzień przed wykonaniem testu IC należy wysiać komórki Vero na płytki 6-dołkowe (1 - 2,5 x 10⁵ komórek/dołek. Zazwyczaj używamy 11 dołków na próbkę śledziony: 10 dołków przeznaczonych jest do zawiesiny splenocytów w rozcieńczeniach seryjnych, a jeden dołek do badania spontanicznej reaktywacji wirusa po cyklach zamrażania i rozmrażania.
2. Uśmierć zakażane myszy po ustanowieniu okresu latencji (12–14 dni po zakażeniu). Pobierz śledziony myszy i połącz je w 1 ml schłodzonego DMEM.
3. Mechaniczna dysocjacja śledziony mysiej. Świeżo wyizolowane śledziony mysie przenieść na płytkę o średnicy 10 cm i dodać 10 ml odpowiedniego pożywki, np. DMEM z 2% FBS. Namoczyć dwie szkiełka przedmiotowe do mikroskopu z matowym końcem w lodowatej pożywce. Umieścić śledzionę na matowej części jednego szkiełka i naciąć torebkę krawędzią matowego końca drugiego szkiełka. Mechanicznie dysocjować śledzionę pomiędzy dwoma szkiełkami, aż wszystkie czerwone grudki zostaną rozdrobnione (należy również usunąć cząsteczki tłuszczu, jeśli są obecne).
4. Opłucz preparaty pożywką DMEM, aby odzyskać pozostałe komórki z obu szkiełek.
5. Ostrożnie przenieś całą zawiesinę tkankową przez sitko do komórek (40 μm (siatkę nylonową) do 50 ml stożkowej probówki z nakrętką. Przemyć szalkę 10 cm zawierającą homogenaty śledziony 10 ml PBS i przenieść zawartość, filtrując ją.
6. Wirować zawiesiny pojedynczych komórek przez 10 min przy 375 x g, a następnie odlać nadsącz. Delikatnie uderzyć w probówki, aby rozbić istniejące skupiska komórek. Dodać 5 ml buforu ACK (Tabela 1) w celu lizy erytrocytów. Inkubować przez 5 min i ponownie wirować przy 375 x g.
7. Odlej supernatant i ponownie zawiesić osady, dokładnie, lecz ostrożnie, w buforze PBS z 2% FBS. Przechowywać komórki w 4 °CZa pomocą pipety usuń zanieczyszczenia, jeśli takie występują. Policz żywe komórki, korzystając z automatycznego licznika komórek (Bio-Rad).
8. Odwiruj splenocyty resuspenderowane w PBS przy 375 x g przez 4 min. Odlej supernatant i resuspenderuj komórki w 4 ml kompletnej pożywki DMEM (2 x 1 ml zostanie wykorzystanych do testu IC oryginalnej zawiesiny; 0,6 ml do seryjnych rozcieńczeń pięciokrotnych w teście IC; 0,4 ml do przygotowania wirusowego DNA i qPCR, a zawiesina o objętości 1 ml zostanie wykorzystana do oceny spontanicznej reaktywacji latentnego wirusa po trzech cyklach zamrażania i rozmrażania).
9. Przygotuj seryjne rozcieńczenia pięciokrotne (tj. 1/5, 1/25, 1/125, 1/250) zawiesiny splenocytów w dwóch powtórzeniach. Wypełnij wcześniej probówki stożkowe o pojemności 15 ml ilością 2,4 ml DMEM, a następnie wykonaj rozcieńczenia. 600 μl przenieść zawiesinę splenocytów do pierwszej probówki i dokładnie wymieszać. Przenieść 600 μl z poprzedniej probówki do następnej itd. Nie mieszać w wirówce (vortex)!
10. Odssać medium z przygotowanej monowarstwy komórek Vero w płytce 6-dołkowej. Nanieść 1 ml seryjnie rozcieńczonych splenocytów na komórki Vero, wykonując każdą rozcieńczenie w dubletach (wykorzystanych zostanie 10 dołków dla rozcieńczeń 0, 1/5, 1/25, 1/125, 1/250).
11. Inkubować płytki przez 8–12 h w temperaturze 37 °C oraz 5% CO2₂Nie przekraczać 24 godz. Odessać zawiesinę wysianych splenocytów i do każdej studzienki nanieść 4 ml pożywki nakładkowej (Tabela 1). Inkubować przez kolejne 6 dni.
12. Wyznacz poziomy centrów infekcyjnych śledziony poprzez barwienie płytek 0,2% (w/w) fioletem krystalicznym, zgodnie z procedurą testu plackowego.

5. Ilościowe oznaczenie genomu wirusa

1. Wyizoluj całkowite DNA genomowe z tkanek zainfekowanych γHV68, takich jak próbki płuc i śledziony w tym doświadczeniu. Użyj zestawu DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen), postępując zgodnie z protokołem producenta.
2. Oznacz stężenie DNA w każdej próbce, aby zapewnić użycie tej samej ilości DNA w analizie qPCR. Zaprojektuj startery specyficzne dla wirusa (do analizy qPCR preferowany jest amplikon o długości ~200 bp). W tej analizie zastosowano startery specyficzne dla γHV68 ORF56 (starter forward: 5′- GTAACTCGAGACTGAAACCTCGCAGAGGTCC - 3′; starter reverse: 5′-CCGAAGCTTGCACGGTGCAATGTGTCACAG-3′) oraz startery do β-aktyny (starter forward: 5′-cacccacactgtggcccatcat-3′ starter reverse: 5′-gtgaggatcttcatgaggtagtc-3′) jako kontrolę reakcji qPCR.
3. Wymieszaj próbkę DNA (optymalnie 100 - 500 ng) i odpowiednie startery z 2 x SYBR master mix (Bio-Rad iQ SYBR Green Supermix). Użyj systemu Bio-Rad Real-Time PCR System do ilościowego oznaczenia ładunku wirusa w zainfekowanych tkankach. Przeprowadź PCR w następujących warunkach: 95 °C przez 15 min oraz 45 cykli: 95°C przez 30 min, 60°C przez 30 min i 72°C przez 30 min, a następnie przeprowadź analizę krzywych topnienia dla amplikonów wirusowych i aktyny.
4. W celu przygotowania krzywej wzorcowej do ilościowego oznaczenia genomów wirusowych, wykonaj rozcieńczenia seryjne znanych ilości DNA bacmid γHV68 w DNA genomowym wyizolowanym z niezinfekowanych komórek. Przeprowadź qPCR równolegle z DNA pozyskanym z zainfekowanych tkanek, używając tych samych zestawów starterów specyficznych dla wirusa.
5. Przedstaw ładunek genomu wirusa w tkankach jako liczbę kopii DNA wirusa na jednostkę (np. 100 ng lub 500 ng) DNA genomowego po normalizacji do aktyny.

6. Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 1 przedstawia ogólny schemat eksperymentów służących do pomiaru infekcji γHV68 u myszy in vivo. Reprezentatywne wyniki mian wirusa w płucach podczas ostrej infekcji γHV68, wyznaczone za pomocą metody plackowej, przedstawiono na Rysunku 2A. Zmutowany szczep γHV68 zawierający niefunkcjonalne wirusowe białko Bcl-2 (vBcl-2) replikował się na poziomach porównywalnych do szczepu dzikiego γHV68 w płucach po 7 dniach infekcji donosowej myszy BALB/c (6–7 myszy na grupę). Nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic w mianach wirusa w płucach między obiema grupami. Dane te wskazują, że vBcl-2 nie jest kluczowym czynnikiem dla ostrej infekcji γHV68 u myszy. Jednak do 28. dnia po infekcji miano zmutowanego wirusa vBcl-2 w śledzionach spadło 6- do 10-krotnie w porównaniu z WT, co zmierzono za pomocą testu centrów infekcyjnych (Rysunek 2B), sugerując, że zmutowany wirus γHV68 vBcl-2 wykazuje defekt w utrzymywaniu latencji śledzionowej po infekcji. Zgodnie z obniżonymi mianami centrów infekcyjnych, ładunek genomu wirusowego zmutowanego wirusa vBcl-2 był znacznie zredukowany w porównaniu do wirusów WT w 28. dniu w powtórzonych eksperymentach, co pokazano na Rysunku 2C. Ścisła korelacja między ładunkami genomu wirusowego a częstotliwością reaktywacji zmutowanego wirusa latent-HV68vBcl-2 ex vivo w fazie latencji infekcji podkreśla defekt latencji w przypadku infekcji tym zmutowanym wirusem.

Rysunek 1. Schemat pomiaru zakażenia γHV68 u myszy za pomocą metody tworzenia plamzek, oznaczania centrów infekcyjnych oraz analizy qPCR.

Rysunek 2. Lityczna i latentna infekcja wirusów γHV68 typu WT i mutantów in vivo. Ostrą replikację (A) wirusów γHV68 typu WT i mutantów vBcl-2 w płucach myszy BALB/c w 7. dniu po infekcji (dpi) określono za pomocą testu plackowego. (B i C) Liczbę infekcyjnych centrów w śledzionie (B) oraz ładunek genomu wirusowego (C) w śledzionach zainfekowanych myszy zmierzono w 28. dniu po infekcji odpowiednio za pomocą testu centrów infekcyjnych oraz qPCR. Czerwone linie oznaczają średnie z indicated values. n.s., brak istotności statystycznej.

Dyskusja

γHV68 jest powszechnie wykorzystywany jako model do badania patogenezy ludzkich γ-HV^2,4,5. W niniejszym protokole opisano trzy rutynowo stosowane metody, w tym test plackowy do oznaczania miana wirusa zakaźnego, test IC do oceny latentnego ładunku wirusowego oraz qPCR do oznaczania ładunku genomu wirusowego, w celu oceny ostrej i latentnej infekcji γHV68 po inokulacji donosowej u myszy.

Metoda pęlakowa jest szeroko stosowana do oznaczania miana wirusa w zainfekowanych komórkach lub...