Artykuł metodologiczny

Wykrywanie interakcji białkowych w roślinie za pomocą systemu bimolekularnej komplementacji fluorescencji (BiFC) kompatybilnego z bramką

DOI:

10.3791/3473

⸱

16 września 2011

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Western Ontario, 2Southern Crop Protection and Food Research Centre, Agriculture and Agri-Food Canada

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy technikę testowania interakcji białko-białko w roślinach. Żółte białko fluorescencyjne (YFP) jest podzielone na dwa nienakładające się na siebie fragmenty. Każdy fragment jest klonowany w ramce do genu będącego przedmiotem zainteresowania za pośrednictwem systemu Gateway, umożliwiającego ekspresję białek fuzyjnych. Rekonstytucja sygnału YFP następuje tylko wtedy, gdy białka dochodzeniowe oddziałują ze sobą.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy technikę BiFC do testowania interakcji między dwoma białkami in vivo. Osiąga się to poprzez rozszczepienie żółtego białka fluorescencyjnego (YFP) na dwa nienakładające się na siebie fragmenty. Każdy fragment jest klonowany w ramce do interesującego genu. Konstrukty te mogą być następnie przekształcane w Nicotiana benthamiana poprzez transformację za pośrednictwem Agrobacterium, umożliwiając tranzytową ekspresję białek fuzyjnych. Rekonstytucja sygnału YFP następuje tylko wtedy, gdy białka dochodzeniowe oddziałują ze sobą 1-7. Aby przetestować i zwalidować interakcje białko-białko, BiFC można stosować razem z testem drożdżowym dwa hybrydowe (Y2H). Może to wykryć pośrednie interakcje, które można przeoczyć w Y2H. Technologia Gateway to uniwersalna platforma, która umożliwia naukowcom przeniesienie genu zainteresowania (GOI) do jak największej liczby systemów ekspresji i analizy funkcjonalnej8,9. Zarówno orientacja, jak i ramka odczytu mogą być zachowane bez użycia enzymów restrykcyjnych lub ligacji w celu uzyskania klonów gotowych do ekspresji. W rezultacie można wyeliminować wszystkie etapy ponownego sekwencjonowania, aby zapewnić spójne wyniki we wszystkich eksperymentach. Stworzyliśmy serię wektorów BiFC i Y2H kompatybilnych z Gateway, które zapewniają naukowcom łatwe w użyciu narzędzia do wykonywania testów zarówno BiFC, jak i Y2H10. W tym miejscu pokazujemy łatwość wykorzystania naszego systemu BiFC do testowania interakcji białko-białko w roślinach N. benthamiana.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie kultury Agrobacterium

  1. Szczep Agrobacterium GV3101 został wcześniej przekształcony za pomocą wektora BiFC kompatybilnego z Gateway pEarleyGate201-YC i pEarleyGate202-YN, z których każdy zawiera konstrukt fuzyjny GOI.
  2. Zaszczepić 5 ml YEB (5 g ekstraktu z wołowiny L-1, 1 g ekstraktu drożdżowego L-1, 5 g peptonu L-1, 5 g L-1 sacharozy, 2 mMMgSO4, pH 7,2) kultury konstruktów białkowych fuzji BiFC przekształconych agrobacterium z odpowiednim doborem antybiotyków. Hoduj kulturę przez noc w temperaturze 28°C, wstrząsając z prędkością 200 obr./min.
  3. Pobrać 1 ml kultury do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  4. Komórki osadu w ilości 1 000 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej odrzucić supernatant.
  5. Przepłukać osad, dodając 1 ml pożywki infiltracyjnej (5 g L-1 D-glukozy, 50 mM MES (Sigma), 2 mM Na3PO4, 0,1 mM acetosyringonu) 11. Zawiesić osad przez pipetowanie, ponownie rozdrabniać komórki peletu o wadze 1 000 g przez 10 minut.
  6. Powtórz krok prania jeszcze dwa razy.
  7. Zawiesić osad w 0,5 ml pożywki infiltracyjnej.
  8. Zmierzyć absorbancję przy 600 nm i dostosować końcową średnicę zewnętrzną600 do 1,0 do 1,2.
  9. Porcję równej ilości zawiesiny agrobacterium z każdego konstruktu umieścić w nowej probówce o pojemności 1,5 ml, wirować przez 10 sekund. Do pojedynczej infiltracji wystarczy 100 μl każdego konstruktu.
  10. Mieszanina agrobacterium jest teraz gotowa do infiltracji.

2. Infiltracja

  1. Rośliny N. benthamiana są uprawiane w temperaturze 21°C, z 16-godzinnymi cyklami światła i 8-godzinnymi cyklami ciemności. Do infiltracji należy użyć roślin w wieku od pięciu do sześciu tygodni.
  2. Usuń rośliny z pomieszczenia wzrostowego i umieść je w białym świetle na 1 godzinę przed infiltracją, pozwalając aparatom szparkowym na pełne otwarcie.
  3. Pobrać mieszaninę z zawiesiną agrobacterium w strzykawce tuberkulinowej o pojemności 1 ml bez igły.
  4. Przyłożyć końcówkę strzykawki do spodniej strony liścia i delikatnie wcisnąć tłok, jednocześnie bezpośrednio podpierając górną stronę listka jednym palcem. Ciecz będzie dyfundować przez liść, wypełniając mezofilowe przestrzenie powietrzne.
  5. Oznacz infiltrowany obszar markerem w celu przyszłej identyfikacji.
  6. Podczas infiltracji różnymi konstruktami upewnij się, że zmieniłeś rękawice lub wyczyść je 70% etanolem między infiltracjami. Jeśli to możliwe, pozostaw jedną przestrzeń w nerwach między różnymi próbkami, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.
  7. Umieść rośliny w komorze wzrostowej w normalnych warunkach wzrostu.

3. Obserwacja odtworzonego sygnału YFP

  1. Wyciąć segment tkanki liścia o wymiarach 5 mm x 5 mm w obrębie strefy naciekanej
  2. Zamontuj próbkę w wodzie na szklanym szkiełku mikroskopowym, przykryj próbkę szkiełkiem nakrywkowym i zbadaj oddziaływania za pomocą mikroskopu konfokalnego lub fluorescencyjnego.
  3. Ekspresję należy monitorować co 24 godziny od momentu infiltracji do 5 dni później, ponieważ nadmierna ekspresja/transport może spowodować, że fluorescencyjne białka fuzyjne będą wykazywać kilka różnych lokalizacji w czasie.

4. Reprezentatywne wyniki:

Przykład interakcji białko-białko testowanej za pomocą testu BiFC pokazano na rysunku 1. Uważa się, że AtTHP1 i AtSAC3A są składnikami homologu Arabidopsis kompleksu TREX-2 drożdży. Mogą wchodzić w interakcje z nuclearporyną AtNUP1 i ułatwiać eksport mRNA10. AtTHP1 i AtSAC3A zostały sklonowane do pEarlyGate201-YC, podczas gdy AtNUP1 zostały sklonowane do pEarlyGate202-YN. Konstrukty zostały następnie przekształcone w GV3101. Trzy konstrukty zostały sparowane z 3 możliwymi kombinacjami (AtTHP1+AtNUP1; AtTHP1+AtSAC3A; AtNUP1+AtSAC3A) w celu infiltracji. Zrekonstruowany sygnał YFP został zaobserwowany w LCSM 48 godzin po infiltracji. Sygnały obserwowano w komórkach naskórka i lokalizowano na obrzeżach jądra lub plazmie jądrowej, co jest zgodne z subkomórkową lokalizacją tych białek. Kontrole ujemne nie wykazały żadnego sygnału YFP.

figure-protocol-1
Rysunek 1. Arabidopsis Składniki kompleksu eksportującego mRNA TREX-2 oddziałują ze sobą. Liście N. benthamiana, przekształcone z konstruktami GOI połączonymi z pEarleyGate201-YC i pEarleyGate202-YN (jak wskazano), zostały zobrazowane 48-72 godziny po infiltracji przy użyciu mikroskopu konfkolowego Leica TCS SP2. Obrazy są pokazane jako połączone konfokalne obrazy YFP i jasne obrazy komórek liścia N. benthamiana naskórka

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test BiFC jest potężnym narzędziem do badania interakcji białek. W przeciwieństwie do tradycyjnego testu Y2H, BiFC nie tylko umożliwia wizualizację interakcji białko-białko, ale także dostarcza więcej informacji o kompleksie białkowym, takich jak lokalizacja subkomórkowa. Możliwe jest również wykrycie oddziaływań pośrednich, o ile dwa białka kandydujące mogą być wystarczająco blisko siebie przez trzeciego partnera. Jak każda technologia, BiFC ma swoje ograniczenia. Ze względu na zapotrzebowanie na tlen cząsteczkowy do t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Vi Nguyen za przeczytanie manuskryptu i ogólną pomoc laboratoryjną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AcetosyringoneSigma-AldrichD134406
MES hydrateSigma-AldrichM2933
1 ml strzykawka tuberkulinowa z końcówką ślizgowąBD Biosciences309602

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ohad, N., Yalovsky, S. Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants. Methods in molecular biology. 655, 347-358 (2010).
  2. Fang, Y., Spector, D. L. BiFC imaging assay for plant protein-protein interactions. Cold Spring Harbor protocols. 2, (2010).
  3. Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells. Methods in molecular biology. 479, 189-202 (2009).
  4. Hiatt, S. M. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans. Methods. 45, 185-191 (2008).
  5. Barnard, E. Development and implementation of split-GFP-based bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays in yeast. Biochemical Society Transactions. 36, 479-482 (2008).
  6. Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nature. 1, 1278-1286 (2006).
  7. Hu, C. D., Grinberg, A. V., Kerppola, T. K. Visualization of protein interactions in living cells using bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis. Current protocols in cell biology. 21, 3-3 (2006).
  8. Earley, K. W. Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics. The Plant journal : for cell and molecular biology. 45, 616-629 (2006).
  9. Karimi, M., Inze, D., Depicker, A. GATEWAY vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends in Plant Science. 7, 193-195 (2002).
  10. Lu, Q. Arabidopsis homolog of the yeast TREX-2 mRNA export complex: components and anchoring nucleoporin. The Plant journal : for cell and molecular biology. 61, 259-270 (2010).
  11. Sparkes, I. A. transient expression of fluorescent fusion proteins in tobacco plants and generation of stably transformed plants. Nature protocols. 1, 2019-2025 (2006).
  12. Rackham, O., Brown, C. M. Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs. The EMBO journal. 23, 3346-3355 (2004).
  13. Demidov, V. V. Fast complementation of split fluorescent protein triggered by DNA hybridization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2052-2056 (2006).
  14. Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nature. 3, 1693-1702 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Protein InteractionBimolecular Fluorescence ComplementationGateway CompatibleAgrobacterium Mediated TransformationNicotiana BenthamianaYeast Two HybridConfocal MicroscopyCo ImmunoprecipitationFluorescent Protein ReconstructionPlant Expression System

Powiązane artykuły