Opracowaliśmy technikę testowania oddziaływań białko-białko w roślinach. Żółte białko fluorescencyjne (YFP) zostaje rozdzielone na dwa niezachodzące na siebie fragmenty. Każdy fragment jest klonowany w jednej ramce odczytu z genem zainteresowania za pomocą systemu Gateway, co umożliwia ekspresję białek fuzyjnych. Rekonstytucja sygnału YFP następuje tylko wtedy, gdy badane białka oddziałują ze sobą.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykrywanie oddziaływań białkowych w roślinach z wykorzystaniem systemu bimolekularnej komplementacji fluorescencji (BiFC) kompatybilnego z systemem Gateway
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Opracowaliśmy technikę BiFC służącą do badania oddziaływań między dwoma białkami in vivo. Jest to realizowane poprzez rozdzielenie żółtego białka fluorescencyjnego (YFP) na dwa niezachodzące na siebie fragmenty. Każdy fragment jest klonowany w tej samej ramce odczytu co gen zainteresowania. Konstrukcje te mogą być następnie współtransformowane do Nicotiana benthamiana za pośrednictwem transformacji zapośredniczonej przez Agrobacterium, co umożliwia przejściową ekspresję białek fuzyjnych. Rekonstytucja sygnału YFP następuje tylko wtedy, gdy badane białka wchodzą w interakcję1-7. W celu przetestowania i walidacji oddziaływań białko-białko, BiFC można stosować w połączeniu z testem dwuhybrydowym drożdżowym (Y2H). Pozwala to na wykrycie pośrednich interakcji, które mogą zostać pominięte w Y2H. Technologia Gateway jest uniwersalną platformą, która umożliwia badaczom przenoszenie genu zainteresowania (GOI) do jak największej liczby systemów ekspresyjnych i analiz funkcjonalnych8,9. Zarówno orientacja, jak i ramka odczytu mogą zostać zachowane bez użycia enzymów restrykcyjnych lub ligacji w celu stworzenia klonów gotowych do ekspresji. Dzięki temu można wyeliminować wszystkie etapy ponownego sekwencjonowania, aby zapewnić spójne wyniki w trakcie eksperymentów. Stworzyliśmy serię wektorów BiFC i Y2H kompatybilnych z systemem Gateway, które dostarczają badaczom łatwych w użyciu narzędzi do przeprowadzania testów BiFC i Y2H10. W niniejszej pracy demonstrujemy łatwość zastosowania naszego systemu BiFC do badania oddziaływań białko-białko w roślinach N. benthamiana.
Protokół
1. Przygotowanie hodowli Agrobacterium
- Szczep Agrobacterium GV3101 uprzednio transformowany wektorami BiFC pEarleyGate201-YC i pEarleyGate202-YN kompatybilnymi z systemem Gateway, z których każdy zawiera konstrukt fuzyjny GOI.
- Zaszczepić 5 ml kultury YEB (5g L-1 ekstraktu wołowego, 1g L-1 ekstraktu drożdżowego, 5g L-1 peptonu, 5g L-1 sacharozy, 2mM MgSO4, pH 7.2) z transformowanymi agrobacterium konstruktami białek fuzyjnych BiFC z odpowiednim antybiotykiem selekcyjnym. Inkubować kulturę przez noc w 28°C przy wytrząsaniu z prędkością 200 rpm.
- Przenieść 1 ml kultury do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
- Zwirować komórki z prędkością 1 000g przez 10 min w temperaturze pokojowej, a następnie odlać nadsącz.
- Przemyć osad, dodając 1 ml pożywki do infiltracji (5 g L-1 D-glukozy, 50 mM MES (Sigma), 2 mM Na3PO4, 0.1 mM acetosyringonu) 11. Resuspendować osad poprzez pipetowanie, a następnie ponownie zwirować komórki z prędkością 1 000g przez 10 min.
- Powtórzyć etap przemywania jeszcze dwa razy.
- Resuspendować osad w 0,5 ml pożywki do infiltracji.
- Zmierzyć absorbancję przy 600 nm i dostosować końcową wartość OD600 do poziomu 1,0–1,2.
- Odmiarkować równą ilość zawiesiny agrobacterium każdego konstruktu do nowej probówki 1,5 ml i mieszać na wortexie przez 10 s. Do pojedynczej infiltracji wystarczy 100 μL każdego konstruktu.
- Mieszanina agrobacterium jest teraz gotowa do infiltracji.
2. Infiltracja
- N. benthamiana hoduje się w temperaturze 21°C, przy 16-godzinnym cyklu światła i 8-godzinnym cyklu ciemności. Do infiltracji należy używać roślin w wieku od pięciu do sześciu tygodni.
- Przenieś rośliny z pomieszczenia hodowlanego i umieść je pod białym światłem na 1 h przed infiltracją, aby szparki mogły się całkowicie otworzyć.
- Pobierz resuspensowaną mieszaninę agrobacterium do 1-ml strzykawki tuberkulinowej z cienką końcówką, bez igły.
- Przyłóż końcówkę strzykawki do spodniej strony liścia i delikatnie naciśnij tłok, podtrzymując jednocześnie górną stronę liścia jednym palcem. Płyn będzie dyfundował przez liść, wypełniając przestrzenie powietrzne mezofilu.
- Oznacz miejsce infiltracji markerem w celu późniejszej identyfikacji.
- Podczas infiltracji różnymi konstruktami należy pamiętać o zmianie rękawiczek lub ich oczyszczeniu 70% etanolem pomiędzy kolejnymi zabiegami. Jeśli to możliwe, pozostaw jedną przestrzeń między nerwami głównymi między różnymi próbkami, aby zapobiec zanieczyszczeniom krzyżowym.
- Umieść rośliny w komorze wzrostowej w normalnych warunkach hodowli.
3. Obserwacja sygnału zrekonstytuowanego YFP
- Wyciąć fragment tkanki liścia o wymiarach 5mm x 5mm z obszaru zinfiltrowanego
- Umieścić próbkę w wodzie na szklanym szkiełku przedmiotowym, przykryć szkiełkiem nakrywnym i zbadać interakcje przy użyciu mikroskopu konfokalnego lub fluorescencyjnego.
- Ekspresję należy monitorować co 24 godziny od momentu infiltracji przez okres do 5 dni, ponieważ nadekspresja lub transport wewnątrzkomórkowy mogą sprawić, że fluorescencyjne białka fuzyjne będą widoczne w kilku różnych lokalizacjach w czasie.
4. Reprezentatywne wyniki:
Przykład oddziaływania białko-białko zbadanego za pomocą testu BiFC przedstawiono na Ryc. 1. AtTHP1 i AtSAC3A są uważane za komponenty homologu kompleksu TREX-2 drożdży u Arabidopsis. Mogą one oddziaływać z nukleoporyną AtNUP1 i ułatwiać eksport mRNA10. AtTHP1 i AtSAC3A sklonowano do wektora pEarlyGate201-YC, natomiast AtNUP1 sklonowano do pEarlyGate202-YN. Następnie konstrukty przekształcono do szczepu GV3101. Trzy konstrukty sparowano w 3 możliwych kombinacjach (AtTHP1+AtNUP1; AtTHP1+AtSAC3A; AtNUP1+AtSAC3A) w celu infiltracji. Sygnał zrekonstytuowanego białka YFP obserwowano pod LCSM 48 godzin po infiltracji. Sygnały zaobserwowano w komórkach epidermy, gdzie lokalizowały się one na obwodzie jądra lub w plazmie jądrowej, co jest zgodne z subkomórkową lokalizacją tych białek. Kontrole negatywne nie wykazały żadnego sygnału YFP.
Rysunek 1. Arabidopsis Składniki kompleksu eksportu mRNA TREX-2 oddziałują ze sobą. Liście N. benthamiana, współtransformowane konstruktami GOI połączonymi z pEarleyGate201-YC oraz pEarleyGate202-YN (zgodnie z oznaczeniem), obrazowano 48-72 h po infiltracji przy użyciu konfokalnego mikroskopu Leica TCS SP2. Obrazy przedstawiają nałożone na siebie obrazy konfokalne YFP i jasnego pola komórek epidermalnych liści N. benthamiana
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Analiza BiFC jest potężnym narzędziem do badania oddziaływań białkowych. W przeciwieństwie do tradycyjnej analizy Y2H, BiFC nie tylko pozwala na wizualizację oddziaływań białko-białko, ale dostarcza również więcej informacji na temat kompleksu białkowego, takich jak lokalizacja subkomórkowa. Możliwe jest także wykrycie oddziaływań pośrednich, o ile dwa białka kandydujące mogą zostać zbliżone do siebie przez trzeciego partnera. Jak każda technologia, BiFC ma swoje ograniczenia. Ze względu na wymóg obecności tlenu cząstecz...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Vi Nguyen za zapoznanie się z manuskryptem oraz ogólną pomoc laboratoryjną.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Acetosyringon | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Hydrat MES | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| Strzykawka tuberkulinowa 1 mL ze ściętą końcówką | BD Biosciences | 309602 |
Bibliografia
- Ohad, N., Yalovsky, S. Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants. Methods in molecular biology. 655, 347-358 (2010).
- Fang, Y., Spector, D. L. BiFC imaging assay for plant protein-protein interactions. Cold Spring Harbor protocols. 2, (2010).
- Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells. Methods in molecular biology. 479, 189-202 (2009).
- Hiatt, S. M. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans. Methods. 45, 185-191 (2008).
- Barnard, E. Development and implementation of split-GFP-based bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays in yeast. Biochemical Society Transactions. 36, 479-482 (2008).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nature. 1, 1278-1286 (2006).
- Hu, C. D., Grinberg, A. V., Kerppola, T. K. Visualization of protein interactions in living cells using bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis. Current protocols in cell biology. 21, 3-3 (2006).
- Earley, K. W. Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics. The Plant journal : for cell and molecular biology. 45, 616-629 (2006).
- Karimi, M., Inze, D., Depicker, A. GATEWAY vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends in Plant Science. 7, 193-195 (2002).
- Lu, Q. Arabidopsis homolog of the yeast TREX-2 mRNA export complex: components and anchoring nucleoporin. The Plant journal : for cell and molecular biology. 61, 259-270 (2010).
- Sparkes, I. A. transient expression of fluorescent fusion proteins in tobacco plants and generation of stably transformed plants. Nature protocols. 1, 2019-2025 (2006).
- Rackham, O., Brown, C. M. Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs. The EMBO journal. 23, 3346-3355 (2004).
- Demidov, V. V. Fast complementation of split fluorescent protein triggered by DNA hybridization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2052-2056 (2006).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nature. 3, 1693-1702 (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
