Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przygotowanie tkanek i immunobarwienie włókien nerwów czuciowych myszy unerwiających skórę i kości kończyn

22.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3485

⸱

26 stycznia 2012

 , 
1Department of Pharmacology, The University of Iowa, 2Department of Anesthesia, Roy J. and Lucille A. Carver College of Medicine, The University of Iowa

W tym artykule

Podsumowanie

Immunocytochemiczna identyfikacja podtypów włókien obwodowych nerwów czuciowych (oraz wykrywanie ekspresji białek w ich obrębie) jest kluczowa dla zrozumienia molekularnych mechanizmów leżących u podstaw czucia obwodowego. W niniejszej pracy opisujemy metody przygotowania próbek tkanek obwodowych i trzewnych, takich jak skóra i kości kończyn, do specyficznego barwienia immunologicznego obwodowych włókien nerwów czuciowych.

Streszczenie

Detekcja i pierwotne przetwarzanie fizycznych, chemicznych i termicznych bodźców sensorycznych przez obwodowe włókna nerwów sensorycznych są kluczowe dla percepcji zmysłowej u zwierząt i ludzi. Włókna te wykazują ekspresję licznych receptorów i białek kanałów jonowych, które wykrywają i inicjują konkretne bodźce sensoryczne. Dostępne są metody charakteryzacji właściwości elektrycznych obwodowych włókien nerwów sensorycznych unerwiających skórę, które mogą być również wykorzystywane do identyfikacji funkcjonalnej ekspresji specyficznych białek kanałów jonowych w tych włóknach. Jednak podobne metody elektrofizjologiczne nie są dostępne (i są również trudne do opracowania) w celu wykrycia funkcjonalnej ekspresji receptorów i białek kanałów jonowych w obwodowych włóknach nerwów sensorycznych unerwiających inne narządy trzewne, w tym tkanki najtrudniejsze, takie jak kość. Co więcej, takie metody elektrofizjologiczne nie mogą być wykorzystywane do określania ekspresji białek niewzbudzalnych w obwodowych włóknach nerwów sensorycznych. W związku z tym immunobarwienie próbek tkanek obwodowych/trzewnych w celu wykrycia włókien nerwów sensorycznych stanowi najlepszy sposób określenia ekspresji specyficznych białek zainteresowania w tych włóknach nerwowych. Do tej pory większość badań nad ekspresją białek w neuronach sensorycznych wykorzystywała procedury immunobarwienia w zwojach sensorycznych, gdzie informacje ograniczają się do ekspresji specyficznych białek w ciele komórki konkretnych typów lub podzbiorów neuronów sensorycznych. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy szczegółowe metody/protokoły przygotowania próbek tkanek obwodowych/trzewnych do immunobarwienia obwodowych włókien nerwów sensorycznych. Szczegółowo opisujemy metody przygotowania biopsji wycinanej (punch biopsy) skóry lub podeszwy stopy oraz skrawków kości (kość udowa) myszy do immunobarwienia obwodowych włókien nerwów sensorycznych. Metody te są nie tylko kluczowe dla jakościowego określenia ekspresji białek w obwodowych neuronach sensorycznych, ale stanowią również ilościową metodę analityczną do określania zmian w poziomach ekspresji białek w konkretnych typach lub podzbiorach włókien sensorycznych, a także do określania zmian morfologicznych i/lub anatomicznych w liczbie i gęstości włókien sensorycznych w różnych stanach patologicznych. Ponadto metody te nie ograniczają się wyłącznie do barwienia włókien nerwów sensorycznych, ale mogą być również stosowane do barwienia dowolnych typów włókien nerwowych w skórze, kościach i innych tkankach trzewnych.

Protokół

1. Perfuzja zwierzęcia

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt przeprowadzone w niniejszym badaniu zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet Opieki i Wykorzystania Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) Uniwersytetu Iowa i są zgodne z wytycznymi NIH dotyczącymi wykorzystania zwierząt w badaniach.

  1. Dzień przed perfuzją należy przygotować 1 L buforu fosforanowego (0,2 M PB w podwójnie destylowanej wodzie H2O, pH 7,4) i przechowywać go w temperaturze 4°C. Będzie on wykorzystywany do perfuzji oraz procesów post-fiksacji.
  2. W dniu perfuzji należy przygotować 500 ml roztworu utrwalającego 4,0% paraformaldehyd w 0,1 M PB (PFA, pH 7,4), w objętości wystarczającej do perfuzji 2 myszy: w szklanej zlewce należy podgrzać w mikrofalówce 200 ml ddH2O przez 30 s lub do momentu zbliżonego do wrzenia. Do zlewki, przy ciągłym mieszaniu pod wyciągiem, należy dodać 20 g granularnego paraformaldehydu (PFA). Kroplami należy dodać 5 ml 5 N NaOH i mieszać aż do uzyskania przejrzystego roztworu. Po całkowitym rozpuszczeniu PFA roztwór należy schłodzić do temperatury pokojowej (RT). Przy ciągłym mieszaniu należy powoli dodać 250 ml 0,2 M PB. Za pomocą sukcesywnie słabszych roztworów HCl (6 N, następnie 1 N i 0,1 N) należy dostosować pH do 7,4. Ostateczną objętość należy uzupełnić do 500 ml i schłodzić na lodzie. Należy również przygotować 400 ml 0,1 M PB z roztworu stokowego 0,2 M poprzez rozcieńczenie 1:1 w ddH2O i schłodzić na lodzie.
  3. Mysz należy znieczulić poprzez dosytkową iniekcję przedawki środka znieczulającego (pentobarbital sodowy, 80 mg/kg, podany igłą 27G).
  4. Podczas perfuzji do krwiobiegu myszy zostanie podane sekwencyjnie 50 ml 0,1 M PB (rozcieńczony stok 0,2 M PB 1:1 z ddH2O) oraz 150 ml PFA. Należy przygotować pompę perystaltyczną, wypełniając dren PB i mocując na jednym końcu igłę motylkową 231/2G. Drugi koniec drenu należy zanurzyć w zlewce zawierającej 0,1 M PB. Prędkość pompy perystaltycznej należy ustawić na 10 ml/min i przepompować wystarczającą ilość roztworu, aby upewnić się, że w drenie nie ma pęcherzyków powietrza.
  5. Należy odczekać, aż znieczulona mysz przestanie wykazywać jakąkolwiek aktywność odruchową, taką jak odruch na uciśnięcie palców stopy/ogona oraz odruch mrugania. Zwierzę należy położyć na tacku sekcyjnym stroną brzuszzną do góry pod wyciągiem i unieruchomić łapy taśmą. Futro należy spryskać 70% etanolem. Należy wykonać nacięcie skóry wzdłuż linii środkowej, aby odsłonić klatkę piersiową i górną ćwiartkę ściany brzusznej. Następnie należy przeciąć ścianę brzuszną u podstawy klatki piersiowej. Po wykonaniu tego nacięcia widoczne powinny być przepona oraz dolny koniec mostka. Należy ostrożnie przeciąć od lewej do prawej krawędź przepony oraz wzdłuż całej długości mostka, uważając, aby nie uszkodzić płuc. Nieznaczne krwawienie z mostka na tym etapie jest normalne i nie zakłóci perfuzji. Po wykonaniu nacięcia wzdłuż mostka i przecięciu przepony powinno być możliwe uniesienie każdej połowy klatki piersiowej w górę i na zewnątrz, tak aby odsłonić serce. W razie potrzeby należy odsunąć płuca. Obie połowy klatki piersiowej można utrzymać w tej pozycji za pomocą kleszczyków hemostatycznych. Igłę motylkową (231/2G) podłączoną do pompy perystaltycznej należy wprowadzić na 3-4 mm do lewej komory, równolegle do długiej osi zwierzęcia. Takie umiejscowienie minimalizuje ryzyko wysunięcia się igły. Należy wykonać małe nacięcie w prawym przedsionku, aby umożliwić odpływ krwi z serca.
  6. Perfuzję należy rozpocząć od 0,1 M PB z przepływem 10 ml/min przez 4-5 min. Jeśli w tym momencie z prawego przedsionka nadal wydostaje się znaczna ilość krwi, czynność należy kontynuować aż do uzyskania przeźroczystego przepływu.
  7. Należy zatrzymać przepływ PB i przełączyć wlot pompy perystaltycznej na roztwór 4% PFA. Prędkość przepływu należy zmniejszyć do 5 ml/min i kontynuować pompowanie roztworu PFA przez 20-25 min. Wraz z przedostawaniem się PFA do krwiobiegu mięśnie wpadają w skurcz i po kilku minutach zwierzę powinno zostać dosłownie „utrwalone” w pozycji. Sztywność tę można sprawdzić, delikatnie naciskając na tylne łapy, uważając, aby nie poruszyć zwierzęcia i nie wysunąć kaniuli. Prawidłowa perfuzja zapobiegnie zgięciu kończyny w odpowiedzi na nacisk. Po zakończeniu perfuzji PFA można odłączyć kaniulę i kleszczyki hemostatyczne, a następnie przygotować zwłoki do sekcji tkanek. Metoda sekcji zależy od konkretnej tkanki.
  8. Należy przygotować 4% PFA / 5% (v/v) kwas pikrynowy (PA; tylko do pobrania i post-fiksacji wycinków podeszwy), dodając nasycony roztwór kwasu pikrynowego do 4% PFA. Dodatek PA znacząco poprawia wykrywalność antygenów w obwodowych tkankach neuronalnych1
  9. Należy przygotować roztwór do dekalcyfikacji i krioprotekcji tkanek kostnych/chrzestnych – 10% EDTA w 0,1 M PB z dodatkiem 0,07% glicerolu i 15% sacharozy. Roztwory oparte na EDTA dekalcyfikują tkanki, zachowując jednocześnie epitopy2.
  10. Należy przygotować roztwór krioprotekcyjny – 30% sacharozy w 0,1 M PB.

2. Disekcja/usuwanie tkanki, postfiksacja i krojenie

  1. Biopsja podeszwowa
    Umieścić perfundowane zwierzę stroną brzuszną do dołu na macie do cięcia lub innej stabilnej powierzchni. Trzymając stopę stroną podeszwową do góry, mocno docisnąć narzędzie do biopsji punch (średnica 3 mm; Harris micro-punch, Ted Pella Inc.) do środka stopy. Obracać narzędzie do biopsji w przód i w tył o 180 stopni, aby upewnić się, że narzędzie przecięło całą tylną łapę. Delikatnie wyjąć narzędzie z nogi i wyrzucić tkankę do sterylnej probówki 2 ml z zakrętką, zawierającej 1 ml roztworu 4% PFA / 5% PA.
  2. Kości kończyn (np. kość udowa)
    Wyciąć nacięcie boczne wzdłuż grzbietu zwierzęcia na poziomie miednicy, prowadząc je w dół wzdłuż obu tylnych kończyn. Przeciąć miednicę i otaczające mięśnie, aby oddzielić kość udową od miednicy, pozostawiając nienaruszoną proksymalną głowę kości udowej. Przeciąć kość piszczelową/strzałkową, pozostawiając nienaruszoną głowę dystalną i usuwając otaczające mięśnie oraz okostną z trzonu kości. Umieścić kość udową w probówce 2 ml zawierającej 1 ml roztworu 4% PFA / 5% PA.
  3. Utrwalić dodatkowo próbki tkanek w roztworze 4% PFA / 5% PA, delikatnie mieszając na wytrząsacie przez 16-18 h w temperaturze 4°C.
  4. Dekalcyfikować tkankę w następujący sposób: W przypadku biopsji podeszwowej (aby zdekalcyfikować małe kości stopy) umieścić wycinek tkanki w sterylnej probówce 2 ml z zakrętką, zawierającej 1,5 ml 10% roztworu EDTA w 0,1 M PB z 0,07% glicerolem i 15% sacharozą. Umieścić probówkę na wytrząsacie przy lekkim mieszaniu przez 16-18 h w temperaturze 4°C. W przypadku kości kończyn umieścić tkankę w sterylnej probówce 2 ml z zakrętką, zawierającej 1,5 ml 10% roztworu EDTA w 0,1 M PB z 0,07% glicerolem i 15% sacharozą. Umieścić probówkę na wytrząsacie przy lekkim mieszaniu przez 6-7 dni w temperaturze 4°C. Roztwór do dekalcyfikacji należy wymieniać co 24 godziny, a utratę sztywności tkanki monitorować za pomocą pęsety.
  5. Przenieść tkankę do sterylnej probówki 2 ml z zakrętką z 1,5 ml roztworu krioprotekcyjnego (30% sacharozy w 0,1 M PB) i umieścić probówkę na wytrząsacie przy lekkim mieszaniu przez 16-18 h w temperaturze 4°C.
  6. Przygotować tkankę do cięcia: nanieść odpowiednią objętość związku OCT (optimal cutting temperature; Sakura Finetek USA Inc.) na blok montażowy do krioztatu i pozwolić mu zamarznąć w komorze krioztatu (zazwyczaj utrzymywanej w temperaturze -20°C). Można również rozpylić na OCT aerozol kriogeniczny (Cyto-freeze, Control Co. USA), aby przyspieszyć proces mrożenia. Umieścić próbkę tkanki na tej warstwie OCT i przykryć dodatkową cienką warstwą OCT. Delikatnie spryskać warstwę OCT aerozolem kriogenicznym, aż stwardnieje, a tkanka wewnątrz zamarznie. Umieścić próbkę na głowicy tnącej w komorze krioztatu i pozwolić blokowi z próbką tkanki wyrównać temperaturę do temperatury cięcia – przez co najmniej 1 godzinę. Próba wykonywania skrawków, gdy związek do zatapiania jest wciąż zbyt zimny, prowadzi do powstawania kruchych przekrojów i uszkodzenia tkanki.
  7. Gdy tkanka osiągnie optymalną temperaturę cięcia, rozpocząć krojenie próbki, przygotowując skrawki o grubości 40 μm.
  8. W przypadku biopsji podeszwowej zebrać krioskrawki do 12-dołkowych płytek do hodowli tkanek zawierających 0,1 M PB z 10 mM azotkiem sodu. Upewnić się, że skrawki pozostają zanurzone w tym roztworze w temperaturze 4°C. Skrawki mogą być w ten sposób przechowywane przez okres do 4-6 miesięcy do celów immunobarwienia. Alternatywnie, swobodnie pływające skrawki można przechowywać bezterminowo w roztworze krioprotekcyjnym w temperaturze -20°C (500 ml 0,1 M PBS, pH 7,2, 30 g sacharozy, 10 g PVP40, 300 ml glikolu etylenowego; dopełnić objętość końcową do 1 L wodą destylowaną)3. W przypadku kości kończyn zbierać krioskrawki bezpośrednio na szkiełka uprzednio powlekane żelatyną (lub szkiełka Superfrost Plus, Fisher Scientific) i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu przez 1 h przed przechowywaniem w temperaturze -20°C. Przekroje kości na szkiełkach przechowywane w ten sposób mogą być użyte do immunobarwienia w ciągu 2-3 miesięcy.

3. Immunobarwienie przekrojów tkankowych w celu wykazania włókien nerwów czuciowych

3.1. Przekroje wycinane z podeszwy stopy - barwienie przekrojów metodą wypłukiwania

  1. Za pomocą żyletki odciąć 6-7 mm z końca końcówki do mikropipety o pojemności 1 ml. Przygotować wnętrze końcówki, aspirując kilkukrotnie 1% płodową surowicę bydlęcą (FBS) w 0,1 M PB (zapobiega to przywieraniu przekrojów tkanek do ścianek końcówki). Przenieść przekroje z wycinków podeszwowych przeznaczone do barwienia na 24-dołkową płytkę do hodowli tkanek. Zazwyczaj w jednym dołku powinno znajdować się 8-10 przekrojów, aby zapewnić uzyskanie kilku wysokiej jakości preparatów z jednego barwienia immunofluorescencyjnego.
  2. Przemyć przekroje z wycinków podeszwowych 500 μl 0,1 M PB na dołek przez 5 min, intensywnie mieszając na wytrząsarce w RT.
  3. Wylać roztwór piorący i inkubować przekroje z wycinków podeszwowych w roztworze blokującym, składającym się z 10% surowicy koziej i 0,3% Triton X-100 w 0,1 M PB (500 μl roztworu blokującego na dołek), delikatnie mieszając na wytrząsarce przez 1 h w 4°C.
  4. Wylać roztwór blokujący i inkubować przekroje tkanek w przeciwciałach pierwotnych rozcieńczonych w 250 μl roztworu blokującego przez 18-24 h, delikatnie mieszając na wytrząsarce w 4°C. W zależności od wymagań doświadczalnych badacza, na tym samym przekroju można przeprowadzić pojedyncze znakowanie immunologiczne (z jednym przeciwciałem pierwotnym przeciwko konkretnemu białku lub markerowi włókien nerwowych) lub podwójne znakowanie immunologiczne (z dwoma przeciwciałami pierwotnymi przeciwko dwóm białkom lub markerom włókien nerwowych). Podczas podwójnego znakowania immunologicznego ważne jest sprawdzenie, czy dwa użyte przeciwciała pierwotne zostały wytworzone u różnych gatunków gospodarzy (np. jedno u myszy, a drugie u królika) lub alternatywnie, można zastosować oczyszczone przeciwciała monoklonalne o różnych izotypach immunoglobulin G (IgG) (np. jedno IgG1 i jedno IgG2a). Zaleca się uszczelnienie płytki Parafilmem podczas inkubacji nocnej, aby uniknąć nadmiernego odparowania. W celu zabarwienia obwodowych włókien nerwowych czuciowych można zastosować kilka specyficznych przeciwciał. Przeciwciała przeciwko białku neurofilamentowi 200 (NF200; Sigma) znakują włókna o dużej średnicy, natomiast peptyd związany z genem kalcytoniny (CGRP; Sigma) i przejściowy receptor potencjowy wanilloidowy 1 (TRPV1, Neuromics) znakują peptidergiczne, obwodowe włókna czuciowe o małej średnicy. Wszystkie obwodowe włókna nerwowe można również zabarwić przeciwciałami przeciwko β3-tubulinie. W skórze kolagen IV (Abcam) jest używany do wyznaczenia błony podstawnej oddzielającej naskórek od skóry właściwej. Co do zasady, przeciwciała muszą być 5-10 razy bardziej skoncentrowane niż w przypadku immunofluorescencji na hodowlach komórkowych, zazwyczaj przy roboczym stężeniu 5-10 μg/ml.
  5. Przemyć przekroje tkanek 500 μl roztworu blokującego (z Triton X-100) na dołek przez 5 min, intensywnie mieszając na wytrząsarce w RT. Powtórzyć czynność jeszcze 3 razy.
  6. Wylać roztwór piorący i inkubować przekroje tkanek w odpowiednich przeciwciałach wtórnych sprzężonych z fluorochromem (zazwyczaj rozcieńczonych 1:1000 w roztworze blokującym, 500 μl), delikatnie mieszając na wytrząsarce w 4°C. Płytka musi być owinięta folią aluminiową, aby uniknąć fotowybielania fluorochromów.
  7. Przemyć przekroje tkanek 500 μl roztworu blokującego na dołek przez 10 min, intensywnie mieszając na wytrząsarce w RT. Następnie przemyć 500 μl 0,1 M PB, intensywnie mieszając przez 10 min w RT. Na koniec przemyć 500 μl 0,05 M PB, intensywnie mieszając przez 10 min w RT.
  8. Za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml z końcówką potraktowaną FBS (odciętą o 6-7 mm z końca) aspirować przekroje z płytki do hodowli tkanek i przenieść je na szkiełka mikroskopowe SuperFrost Plus. Ułożyć przekroje i wchłonąć nadmiar buforu piorącego za pomocą cienkiego pędzla. Unikać długotrwałej ekspozycji na światło. Inkubować szkiełka w RT, aby pozwolić przekrojom wyschnąć na szkiełku (5-30 min).
  9. Nanieść kilka kropli medium montażowego (ProLongGold, Vectashield lub podobnego) i powoli nałożyć szkiełko nakrywką na przekroje. Pozostawić szkiełka w ciemności przez 5 min, a następnie zabezpieczyć krawędzie szkiełka nakrywki przezroczystym lakierem do paznokci. Pozostawić do wyschnięcia na powietrzu przez 15-20 min. Szkiełka mogą być teraz wizualizowane lub przechowywane w -20°C przez kilka lat bez znaczącej utraty fluorescencji.

3.2. Przekroje kości kończyn - barwienie na szkiełku

  1. Pozostawić preparaty do osiągnięcia temperatury pokojowej (RT) po przechowywaniu w -20°C. Za pomocą hydrofobowego pisaka do tworzenia barier (Super Pap Liquid Blocking Pen, Ted Pella Inc.) obrysować na szkiełku obszar zawierający przekroje kostne, które mają zostać zabarwione, nakładając obfitą warstwę roztworu. Pozostawić do wyschnięcia na powietrzu przez 10-15 min.
  2. Przemyć przekroje kostne 250 μl 0,1 M PB na każde szkiełko przez 5 min i powtórzyć tę czynność jeszcze 2 razy.
  3. Odlać roztwór piorący i inkubować przekroje kostne w roztworze blokującym, składającym się z 10% surowicy koziej i 0,3% Triton X-100 w 0,1 M PB (250 μl roztworu blokującego na szkiełko) przez 1 h w 4°C.
  4. Odlać roztwór blokujący i inkubować przekroje kostne z przeciwciałem pierwszorzędowym (lub kombinacją przeciwciał pierwszorzędowych w przypadku podwójnego znakowania immunologicznego, zgodnie z opisem w punkcie 3.1.4) rozcieńczonym w 250 μl roztworu blokującego przez 18-24 h w 4°C. Należy pamiętać, że szkiełka muszą być umieszczone w wilgotnej komorze z zamkniętą pokrywą, aby zapobiec wysychaniu roztworu przeciwciał pierwszorzędowych. W celu zabarwienia obwodowych włókien nerwów sensorycznych można zastosować wspomniany zestaw przeciwciał (patrz sekcja 3.1.4) przy podobnych stężeniach roboczych.
  5. Przemyć przekroje tkankowe 250 μl roztworu blokującego (z Triton X-100) na każde szkiełko przez 15 min w RT i powtórzyć tę czynność jeszcze 3 razy.
  6. Odlać roztwór piorący i inkubować przekroje kostne z odpowiednimi przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z fluorochromem (zazwyczaj rozcieńczonymi 1:1000 w roztworze blokującym, 250 μl) w 4°C. Komora do barwienia musi być owinięta folią aluminiową, aby zapobiec fotowyblakaniu fluorochromów. Dla wygody zaleca się stosowanie ciemnych komór do barwienia (np. Slide incubation tray/box, RPI Corp.).
  7. Przemyć przekroje kostne 250 μl roztworu blokującego na każde szkiełko przez 15 min w RT. Następnie przemyć 500 μl 0,1 M PB przez 15 min w RT. Na koniec przemyć 500 μl 0,05 M PB przez 15 min w RT. Krótko zanurzyć w ddH2O w celu opłukania szkiełek, a następnie pozostawić w RT do wyschnięcia przekrojów kostnych na powietrzu (5-30 min). Unikać długotrwałej ekspozycji na światło.
  8. Nanieść kilka kropel medium montażowego (ProLongGold lub podobnego) i powoli nałożyć szklaną lamellkę na przekroje. Pozostawić szkiełka w ciemności na 5 min, a następnie zabezpieczyć krawędzie lamellki przezroczystym lakierem do paznokci. Pozostawić do wyschnięcia przez 15-20 min. Szkiełka można przechowywać w -20°C przez kilka lat bez utraty fluorescencji.

4. Reprezentatywne wyniki

4.1. Przekroje wycinane z podeszwy

Przekroje tkanek pobrane wycinkami z podeszwy stopy można wizualizować pod mikroskopem epifluorescencyjnym lub konfokalnym z obiektywem 10X, 40X lub 63X.

Mikroskopia fluorescencyjna tkanek; ekspresja białek czerwono-zielonych; analiza struktury komórkowej; podkreślenie strzałkami.
Rysunek 1. A-D przedstawiają barwienie przeciwciałem przeciwko Kolagenowi IV (zielony) w błonach podstawawnych, na styku naskórka i skóry właściwej oraz w chrząstce i mięśniach. Liczne włókna CGRP-dodatnie (A-B, czerwone) i NF200-dodatnie (C-D, czerwone) są rozmieszczone w całej skórze myszy w regionie podeszewym (strzałki). β3-tubulina jest markerem panneuronalnym (E, czerwony), natomiast barwienie TRPV1 (F; czerwone) ogranicza się głównie do włókien o małej średnicy, które są jednocześnie CGRP-dodatnie (zielony; groty strzałek). A i C to obrazy epifluorescencyjne wykonane przy użyciu obiektywu 10X (pasek skali - 500 μm); B, D, E i F to kompozyty obrazów konfokalnych wygenerowane ze stosu z 11 obrazów (z-stack) wykonanych w odstępach 2 μm przy użyciu obiektywu 60X (pasek skali - 50 μm).

4.2. Przekroje kości kończyn

Przekroje tkanki kostnej kończyn można również wizualizować pod mikroskopem epifluorescencyjnym lub pod mikroskopem konfokalnym z obiektywem 10X, 40X lub 63X.

Obrazy mikroskopowe przedstawiające struktury białkowe; znakowanie fluorescencyjne uwidacznia składniki komórkowe.
Rysunek 2. przedstawia barwienie immunocytochemiczne z użyciem przeciwciał anty-CGRP (A-B, czerwień; strzałki), anty-NF200 (C-D, czerwień; strzałki), anty-β3-tubulinę (E; czerwień) oraz anty-TRPV1 (F; czerwień) współbarwione z przeciwciałem anty-CGRP (zieleń; strzałki). Obrazy te pokazują podtypy włókien nerwowych czuciowych rozmieszczone w całej macierzy kostnej w obszarze gąbczastym głowy kości udowej myszy. A i C to obrazy epifluorescencyjne wykonane z obiektywem 10X (pasek skali - 500 μm); B, D, E i F to kompozyty obrazów konfokalnych wygenerowane ze stosu z-stack składającego się z 11 obrazów wykonanych w odstępach 2 μm przy użyciu obiektywu 60X (pasek skali - 50 μm).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszym materiale szczegółowo opisano metody przygotowania przekrojów skóry i tkanki kostnej myszy do immunobarwienia oraz detekcji obwodowych włókien nerwów czuciowych. Przekroje wykonane z biopsji wycinanych z podeszwy stopy zawierają zarówno skórę gładką, jak i owłosioną, co oznacza, że protokół może być stosowany dla każdego typu skóry. Techniki te mogą być również wykorzystane do barwienia innych typów komórek w tych tkankach (np. leukocytów, śródbłonka naczyniowego, mięśni gładkich i innych). Metody te stanowi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy dr. Yuriyowi M. Usachevowi za pomoc w wstępnej standaryzacji mikroskopii konfokalnej i obrazowania immunostainingowych biopsji wycinanych z podeszwy łapy myszy oraz dr Donnie L. Hammond za ciągłą pomoc i konstruktywną krytykę w ramach niniejszej pracy. Praca ta została sfinansowana z grantów NINDS/NIH (NS069898) oraz z grantu Idea Development Grant przyznanego przez Department of Defense Prostate Cancer Research Program (DoD-PCRP-101096) dla D.P.M.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
mikro-wykrojnik Harris 3 mmMateriałTed Pella, Inc.15094
Pompa perfuzyjnaMateriałyVWR international23609-170
ParaformaldehydOdczynnikFisher ScientificT353
Kwas pikrynowyOdczynnikSigma-Aldrich239801
Kompound do zatapiania OCTOdczynnikTissue-Tek4583
kriogeniczny spray aerozolowy Cyto-FreezeMateriałyFirma Kontrolna3118
Surowica koziaOdczynnikSigma-AldrichG9023
Kuweta i pokrywka do inkubacji podczas immunobarwienia (duża)MateriałyResearch Products International Corp.248270 (taca) 248270-A (pokrywa)
pisak do tworzenia bariery hydrofobowej ImmEdgeMateriałyVector LaboratoriesH-4000
Wielbłąd’szczoteczki do włosów (grubość nr 1)MateriałyTed Pella, Inc.11859
Pro‐Medium montażowe Long GoldOdczynnikInvitrogenP36930

Bibliografia

  1. Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. Fixative Composition Alters Distributions of Immunoreactivity for Glutaminase and Two Markers of Nociceptive Neurons, Nav 1.8 and TRPV1, in the Rat Dorsal Root Ganglion. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58, 329-344 (2010).
  2. Neves, J. D. S., Omar, N. F., Narvaes, E. A. O., Gomes, J. R., Novaes, P. D. Influence of different decalcifying agents on EGF and EGFR immunostaining. Acta Histochemica. 113, 484-488 (2011).
  3. Watson, R. E., Wiegand, S. J., Clough, R. W., Hoffman, G. E. Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology. Peptides. 7, 155-159 (1986).
  4. Yen, L. D., Bennett, G. J., Ribeiro-da-Silva, A. Sympathetic sprouting and changes in nociceptive sensory innervation in the glabrous skin of the rat hind paw following partial peripheral nerve injury. The Journal of Comparative Neurology. 495, 679-690 (2006).
  5. Boyette-Davis, J., Xin, W., Zhang, H., Dougherty, P. M. Intraepidermal nerve fiber loss corresponds to the development of Taxol-induced hyperalgesia and can be prevented by treatment with minocycline. Pain. 152, 308-313 (2011).
  6. Bloom, A. P. Breast Cancer-Induced Bone Remodeling, Skeletal Pain, and Sprouting of Sensory Nerve Fibers. The Journal of Pain. 12, 698-711 (2011).
  7. Constantin, C. E. Endogenous Tumor Necrosis Factor α (TNFα) Requires TNF Receptor Type 2 to Generate Heat Hyperalgesia in a Mouse Cancer Model. J. Neurosci. 28, 5072-5081 (2008).
  8. Jankowski, M. P. Sensitization of Cutaneous Nociceptors after Nerve Transection and Regeneration: Possible Role of Target-Derived Neurotrophic Factor Signaling. The Journal of Neuroscience. 29, 1636-1647 (2009).
  9. Jimenez-Andrade, J. M. Pathological Sprouting of Adult Nociceptors in Chronic Prostate Cancer-Induced Bone Pain. J. Neurosci. 30, 14649-14656 (2010).
  10. Persson, A. -K. Sodium-calcium exchanger and multiple sodium channel isoforms in intra-epidermal nerve terminals. Molecular Pain. 6, 84-84 (2010).
  11. Ohshima, M., Miyake, M., Takeda, M., Kamijima, M., Sakamoto, T. Staphylococcal Enterotoxin B Causes Proliferation of Sensory C-Fibers and Subsequent Enhancement of Neurogenic Inflammation in Rat Skin. Journal of Infectious Diseases. 203, 862-869 (2011).
  12. Johnson, M. S., Ryals, J. M., Wright, D. E. Early loss of peptidergic intraepidermal nerve fibers in an STZ-induced mouse model of insensate diabetic neuropathy. Pain. 140, 35-47 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obwodowe w kna nerw w czuciowychprocedura immunostaininguprzekroje sk ry myszyprzekroje tkanki kostnejkrojenie w kriosztaciemikroskopia immunofluorescencyjnainkubacja przeciwciaproces dekalcyfikacjibiopsja punch plantarnej
Przygotowanie tkanek i immunobarwienie włókien nerwów czuciowych myszy unerwiających skórę i kości kończyn
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.