Adnotacja funkcji genów roślin poprzez zintegrowaną genomikę, metabolomikę i informatykę

Podsumowanie

Połączenie genomiki, analizy koekspresji genów oraz identyfikacji związków docelowych poprzez metabolizm umożliwia funkcjonalną adnotację genów.

Streszczenie

Biorąc pod uwagę stale rosnącą liczbę gatunków roślin modelowych, dla których dostępne są kompletne sekwencje genomów, oraz obfitość zasobów biologicznych, takich jak mutanty z nokautem genów, akcesje dzikie i zaawansowane populacje hodowlane, rośnie obciążenie związane z funkcjonalną adnotacją genów. W niniejszym protokole przedstawiono adnotację funkcji genów roślin za pomocą połączonej analizy koekspresji genów, metabolomiki i informatyki (Rycina 1). Podejście to opiera się na teorii wykorzystania genów docelowych o znanej funkcji w celu identyfikacji nieadnotowanych genów, które prawdopodobnie biorą udział w określonym procesie metabolicznym, wraz z identyfikacją związków docelowych za pomocą metabolomiki. Przedstawiono strategie stosowania tych informacji w populacjach generowanych zarówno przez podejścia genetyki w przód (forward genetics), jak i genetyki wstecznej (reverse genetics), mimo że żadna z nich nie jest wolna od trudności. W konsekwencji podejście to może być również wykorzystane do charakterystyki nieznanych pików reprezentujących nowe lub specyficzne metabolity wtórne w ograniczonych tkankach, gatunkach roślin lub przy określonym traktowaniu stresowym, co obecnie stanowi istotne wyzwanie w zrozumieniu metabolizmu roślin.

Protokół

1. Przygotowanie próbek

1. Materiały roślinne są zbierane i natychmiast zamrażane.
2. Zamrożone materiały roślinne są rozdrabniane w młynku mieszalnikowym (lub moździerzu) i przechowywane w probówkach typu Falcon lub probówkach Eppendorf w temperaturze -80 °C.

2. Ekstrakcja do profilowania metabolomitów

1. Odważ odpowiednią ilość zamrożonego materiału roślinnego do probówki Eppendorf o pojemności 2 ml.
2. Dodaj 5 μl buforu do ekstrakcji na każdy miligram świeżej masy zamrożonego materiału roślinnego.
3. Dodaj jedną kulkę metalową (lub gilconia) i homogenizuj zamrożony proszek za pomocą młyna kulowego (Mixer Mill) przez 2 min przy 25 l s^-1.
4. Wiruj przez 10 min przy 12 000 rpm.
5. Przenieś nadosad do wirnikowego filtra NANOSEP.
6. Wiruj przez 2 min przy 4 000 rpm.
7. Przenieś nadosad do nowej probówki Eppendorf i przechowuj w temperaturze -20 °C do momentu użycia.

3. Profilowanie metabolitów metodą LC-MS

1. Przygotuj system HPLC i sprawdź temperaturę termostatu kolumny oraz tacki na próbki.
2. Ustaw warunki pracy MS i sprawdź stan próżni oraz kapilarę grzejną.
3. Wykonaj kalibrację m/z detektora MS.
4. Przenieś 50 μl ekstraktów do szklanej fiolki przeznaczonej do LC-MS.
5. Wstrzyknij 5 μl ekstraktów do systemu LC-MS.

4. Analiza danych

1. Skonfiguruj program Xcalibur lub Metalign ⁴ i wybierz dane do analizy.
2. Przygotuj tabelę wykrytych piki interesujących Cię związków, zgodnie z klasą związków przedstawioną w Tabeli I.
3. Zidentyfikuj piki poprzez współelucję związków wzorcowych.
4. Zaadnotuj wykryte piki, wykorzystując analizę MS², przegląd literatury oraz wyszukiwanie w bazach danych metabolitów (Rysunek 2, ^12,13).

5. Przewidywanie ścieżki metabolicznej

1. Opracuj możliwy szlak metaboliczny z wykrytymi związkami. Przewidywanie szlaku na podstawie adnotacji piku powinno opierać się na strukturze chemicznej wykrytych związków poprzez przewidywanie łączących ich funkcji enzymatycznych w szlaku metabolicznym ¹³. Strukturyzacja etapów biosyntezy powinna być przeprowadzona przy dokładnej adnotacji pików. Jednakże określenie szczegółowej struktury chemicznej, na przykład fragmentu cukrowego, nie jest na tym etapie niezbędne, ponieważ przewidywanie fragmentu cukrowego i pozycji przyłączenia jest bardzo trudne do zidentyfikowania za pomocą analizy MS. Rodzaj cukru, taki jak heksozyd czy pentozyd, zostanie zidentyfikowany za pomocą testu enzymatycznego donora cukru w ostatnim kroku projektu. W większości przypadków przewidywanie szlaku powinno być przeprowadzane przy założeniu, że mała cząsteczka jest produktem pośrednim większej cząsteczki, z wyjątkiem niektórych przypadków, takich jak reakcja dehydratacji. Przydatna do przewidywania jest lista mas atomowych, na przykład 16 m/z dla różnicy między grupami -H i -OH (utlenianie), 14 m/z (atom węgla) dla różnicy między -OH a -OMe (metylacja) oraz 162 m/z (MW-H₂O) dla heksozy (glikozylacja). Określenie rodzaju modyfikacji za pomocą analizy korelacji specyficzności tkanek pomaga w przewidywaniu szlaku metabolicznego. Bazy danych ogólnych szlaków metabolicznych, takie jak baza KEGG (http://www.genome.jp/kegg/) i PlantCyc (http://plantcyc.org/), są bardzo skuteczne w przewidywaniu interesującego badacza szlaku metabolicznego.

6. Przygotowanie listy genów z identyfikatorami genów ortologicznych Arabidopsis

1. Pobierz listę identyfikatorów genów z bazy danych genomicznych.
2. Dodaj identyfikator genu Arabidopsis dla genu ortologicznego, w przypadku gdy rośliną docelową nie jest Arabidopsis.
3. Przygotuj listę genów w analizowanym szlaku metabolicznym. Adnotacje danych dotyczących szlaków i rodzin genów Arabidopsis są dostępne na stronie TAIR (http://www.arabidopsis.org/). Jeśli przygotowano listę ortologicznych genów Arabidopsis, można je następnie połączyć.

7. Analiza genów współwyrażanych

1. Przetestuj przygotowaną listę identyfikatorów genów, aby wyszukać najlepszą bazę danych dla analizowanego szlaku, sprawdzając korelację z wykorzystaniem znanych par genów w badanym szlaku (Tabela II). Jeśli baza danych koekspresji lub baza danych ekspresji genów nie jest dostępna dla analizowanej rośliny, należy użyć bazy koekspresji Arabidopsis wraz z listą ortologicznych genów Arabidopsis. W przypadku jęczmienia, ryżu, topoli, pszenicy, lucerny i soi można wykorzystać analizę koekspresji dla tych gatunków roślin (Tabela II).
2. Zbuduj szkielet docelowej sieci koekspresji w oparciu o połączenia znanych genów w badanym szlaku.
3. Do połączeń tej sieci dodaj skorelowane geny kandydujące (r<0.4~0.90, w przybliżeniu wartości współczynnika między połączeniami znanych genów w badanym szlaku), a następnie sprawdź ich adnotacje genowe w przewidywanych rodzinach, aby wyłonić najlepsze geny kandydujące (Rysunek 3). Próg wartości współczynnika powinien być dostosowany do struktury sieci i gęstości skorelowanych genów.
4. Stwórz listę genów, które można zawęzić do tych wyspecjalizowanych w badanym szlaku.
5. Sprawdź ekspresję genów kandydujących w zależności od specyfiki organów oraz odpowiedzi na stres.

8. Integracja wszystkich informacji w celu przewidywania nowych szlaków

1. Do przewidywanego szlaku metabolicznego dodaj dobrze scharakteryzowane geny, które zostały wykorzystane do analizy koekspresji.
2. Zweryfikuj niecharakteryzowane elementy w tym szlaku, na przykład nieopisane etapy enzymatyczne, białka transportowe oraz czynniki transkrypcyjne.
3. Przewiduj najbardziej odpowiednią adnotację genową dla tych brakujących, niecharakteryzowanych etapów.
4. Połącz wyniki profilowania metabolitów oraz geny kandydackie z in silico ekspresji genów na podstawie przewidywanego szlaku.
5. Uporządkuj geny kandydackie w przewidywanym szlaku zgodnie z funkcją genu, na przykład: acetylotransferazę dla metabolitu acylowanego, glikozylotransferazę dla glikozydów, P450 dla związku utlenionego. Analiza drzewa filogenetycznego sekwencji aminokwasowych jest przydatna w przypadku szerokich rodzin genów, takich jak P450 i glikozylotransferazy.
6. Sprawdź spójność specyfiki tkankowej lub odpowiedzi na stres pomiędzy akumulacją metabolitów a poziomem ekspresji genów kandydackich.
7. Sprawdź powiązania z innym metabolizmem w celu dostarczenia substratów oraz genów odpowiedzialnych za odpowiedź na stres.

9. Eksperymenty służące identyfikacji genów z wykorzystaniem zasobów biologicznych

1. Sprawdź dostępność zasobów biologicznych w celu ułatwienia przeprowadzenia eksperymentu służącego identyfikacji genów kandydackich.
2. Przeprowadź eksperyment w celu identyfikacji funkcji genów, wykorzystując zasoby biologiczne, takie jak biblioteka mutantów KO oraz biblioteka pełnowymiarowych cDNA. W przypadku najlepszych genów kandydackich wynikających z przewidywań należy przeprowadzić eksperymenty służące identyfikacji funkcjonalnej genów, obejmujące przygotowanie roślin z nadekspresją i mutantów z nokautem, testy enzymatyczne oraz analizy wiązania promotora. Analizy białek rekombinowanych w celu charakterystyki właściwości białka oraz przygotowanie roślin z nadekspresją najlepiej przeprowadzić po potwierdzeniu profilu metabolitów przy użyciu mutanta KO, ponieważ przygotowanie białka rekombinowanego oraz klonowanie genu do transformacji zajmuje znacznie więcej czasu.

10. Reprezentatywne wyniki

Procedura zintegrowanej analizy opisana w niniejszym protokole oferuje wiele możliwości, w zależności od określonego celu eksperymentalnego oraz wyboru kombinacji biologicznych i analitycznych. Dobór procedur i projekt eksperymentu powinny zostać przeprowadzone odpowiednio na podstawie docelowego szlaku, związków oraz gatunku rośliny. Strategia integracji opisana w tym protokole koncentruje się na adnotacji funkcji genów roślin oraz odkrywaniu nowych funkcji genów przy efektywnym wykorzystaniu kilku zasobów bio- i danych. Oczekiwany rezultat ma zapewnić jednoznaczna i rozstrzygającą predykcję. Fakt ten wskazuje, że jeśli profile kombinacji nie dostarczą wystarczających dowodów, eksperyment nie powinien być rozpoczynany. Z tego powodu w każdym przypadku dodatkowe eksperymenty wstępne, takie jak ukierunkowane profilowanie ekspresji genów za pomocą RT-PCR, mogą wesprzeć predykcję funkcji genu. Dokładność i poprawność predykcji korelują dodatnio z różnicą jakościową oraz liczbą wariantów kombinacji. Ponadto dobre kandydatury i wiarygodne wyniki mogą wynikać jedynie z dokładnej predykcji szlaków. Adnotacja szczytowa powinna być przeprowadzona poprzez kombinację kilku podejść, na przykład przegląd literatury, referencyjny ekstrakt roślinny, analiza MSⁿ, specyficzność narządowa oraz analiza mutantów ¹³.

Rysunek 1. Przegląd przebiegu eksperymentu adnotacji genów z wykorzystaniem podejścia kombinowanego. W niektórych przypadkach projekty rozpoczynają się od odkrycia nowego piku, który jest wykrywany w szczególnych warunkach lub tkankach, oraz chęci zrozumienia jego roli w metabolizmie. W innych przypadkach celem projektu jest identyfikacja genu lub odkrycie kluczowych czynników regulacyjnych, takich jak czynniki transkrypcyjne. Projektowanie eksperymentu powinno opierać się na zestawie danych wykazującym wyraźne różnice w poziomach metabolitów w analizowanej ścieżce, z wykorzystaniem szerokiego zakresu próbek tkanek z różnych organów, roślin o zróżnicowanym wzroście lub roślin poddanych warunkom stresowym, oraz poddaniu materiału profilowaniu metabolitów. Rośliny mutanty i transgeniczne, a także materiał hodowlany zawierający QTL, stanowią również odpowiedni materiał genetyczny do tych badań. Przewidywanie nowych ścieżek powinno być przeprowadzane ostrożnie, z dokładną adnotacją piku i podejściem kombinowanym z różnymi typami metabolotypów, takimi jak specyfika organów i reakcje na stres, zgodnie z danymi dotyczącymi ekspresji genów w analizowanej ścieżce. W ostatnim kroku należy przeprowadzić profilowanie metabolitów i transkryptów, co w połączeniu z analizą in silico zasobów internetowych oraz charakterystyką ekspresji genów via ekspresji heterologicznej in vitro, doprowadzi ostatecznie do potwierdzenia kandydata genowego oraz wyjaśnienia jego funkcji i pozycji w ścieżce metabolicznej. Skróty: QTL, Quantitative Trait Loci.

Rycina 2. Schemat kombinowanego podejścia do adnotacji piku. Procedura identyfikacji i adnotacji piku za pomocą związku wzorcowego, porównanie typu dzikiego i mutantów z nokautem, wielowymiarowa spektrometria mas piku docelowego w odniesieniu do widm masowych czystych związków z baz danych ¹². Skróty: DB, baza danych; KO, nokaut; 1-D, jednowymiarowy; 2-D, dwuwymiarowy; NMR, magnetyczny rezonans jądrowy; IR, podczerwień; MSⁿ, wielokrotna spektrometria mas.

Rycina 3. Przykład analizy sieci koregulacji szlaku antrocyjanów. Analizy koekspresji przeprowadzono przy użyciu PRIMe (http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index) w oparciu o zestaw danych ATTEDII w wersji 3 ^8,2 przy użyciu programu Pajek (http://vlado.fmf.uni-lj.si/pub/networks/pajek/). Do tworzenia połączeń w sieci wykorzystano korelacje dodatnie (r<0,5). Czerwone węzły: dwanaście genów enzymatycznych szlaku antrocyjanów (At5g13930, CHS, TT4, syntaza chalkonu; At3g55120, CHI, TT5, izomeraza chalkonu; At3g51240, F3H, TT6, flawanonowa 3-hydroksylaza; At5g07990, F3'H, TT7, flawonoidowa 3'-hydroksylaza; At5g17050, Fd3GT, UGT78D2, flawonoidowa 3-O-glukozylotransferaza; At5g17220, AtGSTF12, TT19; At5g42800, DFR, TT3, reduktaza dihydroflawonolu; At4g22880, ANS/LDOX, TT18, syntetaza antrocyjanidyn; At4g14090, A5GT, antrocyjanowa 5-O-glukozylotransferaza; At5g54060, A3G2"XT, domniemana antrocyjanowa 3-O-glukozydowa 2"-O-ksylozylotransferaza; At3g29590, A5GMaT, antrocyjanowa 5-O-glukozydowa 6'''-O-malonylotransferaza; At1g03940, A3GCouT, antrocyjanowa 3-O-glukozydowa 6"-O-p-kumaroylotransferaza) oraz dwa czynniki transkrypcyjne odpowiedzialne za produkcję antrocyjanów (At1g56650, PAP1; At1g66390, PAP2) zostały użyte do wyszukiwania genów kandydackich. Geny kandydackie zidentyfikowano poprzez wyszukiwanie „przecięcia zbiorów” przy wartości progowej współczynnika r>0,50, zapytując o przecięcie zbiorów wszystkich analizowanych genów (czternaście genów biosyntezy antrocyjanów). Sieć koekspresji, obejmująca skorelowane geny kandydackie (68 genów) oraz geny zapytania (14 genów), została zrekonstruowana poprzez wyszukiwanie „połączeń zbiorów” przy r>0,50 z wykorzystaniem bazy danych PRIMe. Pliki wyjściowe sformatowane jako pliki '.net' z bazy danych PRIMe oraz sieci zostały wykreślone przy użyciu oprogramowania Pajek. Niebieskie węzły oznaczają geny kandydackie, które wykazały korelację z genami antrocyjanów.

gatunek	Główny metabolit wtórny
Arabidopsis thaliana	Glukozynolan, flawonol, antocyjan, pochodna sinapoilowa
Populus trichocarpa	Flawonol, antocyjan, pochodna salicylanu
Vitis vinifera	Flawonol, antocyjan, tanina, stilben
Solanum lycopersicum	Flawonol, antocyjan, glikoalkaloid, związki pochodne chlorogenianu,
Nicotiana tabacum	Flawonol, antocyjan, nikotynamid, związki pochodne chlorogenianu, cukier acylowany
Oryza sativa	Glikoflawona, antocyjan, pochodne steroli
Zea may	Glikoflawona, antocyjan, benzoksazinon, pochodne steroli
Medicago truncatula	Izoflawona, antocyjan, saponina,
Lotus japonica	Izoflawona, flawonol, antocyjan, saponina,

Tabela I. Główne metabolity wtórne u modelowych gatunków roślin.

Baza danych koekspresji	Adres
Międzygatunkowe bazy roślinne
COP	http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/
PlaNet	http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/
Gatunki roślin
ATEED-II	http://atted.jp/
BAR	http://142.150.214.117/welcome.htm
COP	http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop
GeneCAT	http://genecat.mpg.de/
Arabidopsis
ACT	http://www.arabidopsis.leeds.ac.uk/act/coexpanalyser
AthCoR@CSB.DB	http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/dbcor/ath.html
CressExpress	http://cressexpress.org/
PRIMe	http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index
Oryza sativa
RiceArrayNet	http://arraynet.mju.ac.kr/arraynet/
Baza danych Rice Array	http://www.ricearray.org/coexpression/coexpression.shtml

Tabela II. Dostępna baza danych ekspresji genów do analizy koekspresji in silico.

Dyskusja

Biorąc pod uwagę, że technologie transkryptomiczne i metabolomiczne są stosowane od kilku lat, proces integracji danych w celu adnotacji genów wspomaganej metabolomiką zazwyczaj rozpoczyna się od identyfikacji nowego piku reprezentującego nieznany metabolit. Fakt ten prowadzi do następnego etapu, którym jest ocena wariancji ilościowej pików metabolitów lub nowych genów kandydackich, które uznaje się za odpowiedzialne za ich biosyntezę. Strategia opisana w niniejszym protokole napotyka jednak trzy główne problemy: i) trudność w adnotacji pików, ii) złożoność przewidywania szlaków, iii) rozdzielczość informacji o genach oraz jakość danych o ekspresji genów. Aby rozwiązać pierwszy problem, adnotację pików należy przeprowadzić poprzez współelucję związków wzorcowych lub podejście kombinatoryczne z wykorzystaniem informacji z analizy MSⁿ, ekstraktów referencyjnych, analizy mutantów, wyszukiwania w bazach danych metabolitów oraz przeglądu literatury (Rysunek 2, ¹²). W odniesieniu do drugiego problemu, przewidywanie szlaków jest możliwe jedynie po prawidłowej adnotacji pików. Niemniej jednak profilowanie metabolitów w zależności od specyfiki tkankowej może również wspierać adnotację pików, ponieważ akumulacja metabolitów powinna być skorelowana z ekspresją powiązanych genów. Dlatego połączenie profili z różnych tkanek i warunków wzrostu może być pomocne w rozwiązaniu tego drugiego problemu. Trzeci problem dotyczący rozdzielczości informacji o genach zależy od postępów w sekwencjonowaniu danych. W przypadku rośliny modelowej, której sekwencja genomu nie została ukończona, przydatna jest analiza koekspresji z wykorzystaniem genów ortologicznych u innych roślin modelowych. Szczegółowe porównanie dopasowania oraz analiza drzew filogenetycznych sekwencji aminokwasów mogą pomóc w powiązaniu organizmów modelowych z innymi gatunkami.

Niniejszy protokół jest odpowiedni dla wszystkich szlaków metabolicznych. Jest on najskuteczniejszy w analizie metabolizmu pośredniego i wtórnego, w których udowodniono występowanie silnej kontroli transkrypcyjnej ^1,5,11,16. W niektórych przykładach analiza koekspresji została pomyślnie przeprowadzona w odniesieniu do asymilacji siarki, genów β-oksydacji, degradacji rozgałęzionych aminokwasów, rozkładu chlorofilu i katabolizmu lizyny ³, metabolizmu ściany komórkowej ^10,7 oraz kaskady sygnalizacji świetlnej ¹⁴. Adnotacja funkcji genów poprzez połączenie genomiki, metabolomiki i informatyki służy nie tylko do identyfikacji genów biosyntetycznych i bezpośrednich regulatorów w postaci czynników transkrypcyjnych, ale także do zrozumienia procesów fizjologicznych i odpowiedzi organizmu (patrz przykład na Rysunku 3. ¹⁴).

Aby rozszerzyć tę metodę z roślin modelowych na gatunki uprawne, potężnym podejściem w badaniu ogólnego metabolizmu jest porównywanie metaboliczne między różnymi gatunkami roślin. Na przykład, jeśli ten sam związek zostanie wykryty u różnych gatunków roślin i zostaną zidentyfikowane w nich geny ortologiczne, analiza koekspresji międzygatunkowej z wykorzystaniem genów ortologicznych może dostarczyć silnych dowodów na poparcie postawionej hipotezy. Podejście to można zastosować w przypadku Arabidopsis, topoli, lucerny oraz ważnych roślin uprawnych, takich jak jęczmień, ryż, pszenica i soja, przeprowadzając analizę koekspresji gatunków roślin (⁶, PlaNet: http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/,; ⁹, COP: http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/; patrz przykład, ¹⁵).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Woda destylowana klasy ULC/MS	BIOSOLVE	23214102
Acetonitryl (ACN) klasy ULC/MS	BIOSOLVE	01204102
Metanol (MeOH) klasy ULC/MS	BIOSOLVE	13684102
Kwas mrawkowy (HCOOH) klasy ULC/MS do chromatografii cieczowej	BIOSOLVE	06914131
Związki wzorcowe	EXTRASYNTHESE
System liniowej pułapki jonowej (IT) ESI-MS FINNIGAN-LTQ	Thermo Fisher Scientific, Inc.
System HPLC Surveyor	Thermo Fisher Scientific, Inc.
Kolumna analityczna Luna C18(2), średnica 2,0 mm, długość 150 mm, wielkość porów 100 Å i sferyczne cząstki 3 mm	Phenomenex	00F-4251-B0
Oprogramowanie Xcalibur	Thermo Fisher Scientific, Inc.