Niniejszy protokół przedstawia technikę pobierania kręgów szyjnych z krążków międzykręgowych bydła do hodowli organów in vitro.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie nienaruszonych krążków międzykręgowych z ogona bydlęcego do hodowli organowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Krążek międzykręgowy (IVD) jest stawem kręgosłupa łączącym kręg z kręgiem. Jego funkcją jest przekazywanie obciążeń kręgosłupa oraz zapewnianie mu elastyczności. Składa się z trzech części: najgłębiej położonego jądra miażdżystego (NP) otoczonego pierścieniem włóknistym (AF) oraz dwóch chrzęstnych płyt końcowych, które łączą NP i AF z trzonem kręgu po obu stronach. Ból dyskogenny, prawdopodobnie spowodowany chorobą zwyrodnieniową krążków międzykręgowych (DDD) oraz przepuklinami krążków, został zidentyfikowany jako główny problem w naszym nowoczesnym społeczeństwie. Aby badać możliwe mechanizmy degeneracji IVD, systemy hodowli organów in vitro z żywymi komórkami krążka są niezwykle atrakcyjne. Hodowla in vitro nienaruszonych wołowych krążków międzykręgowych ogonowych stała się istotnym systemem modelowym, który pozwala na badanie aspektów mechanobiologicznych w dobrze kontrolowanym środowisku fizjologicznym i mechanicznym. Wołowe IVD z ogona można stosunkowo łatwo pozyskać w większej liczbie, a są one bardzo podobne do ludzkich IVD lędźwiowych pod względem gęstości komórek, populacji komórkowej i wymiarów. Jednak wcześniejsze techniki pobierania wołowych IVD ogonowych, zachowujące płytki chrzęstne i kostne, okazywały się nieskuteczne po 1-2 dniach hodowli, ponieważ drogi odżywiania były ewidentnie zablokowane przez skrzepy krwi. IVD są największymi organami beznaczyniowymi, w związku z czym dostarczanie składników odżywczych do komórek w NP zależy wyłącznie od dyfuzji poprzez wypustki kapilarne z przyległego trzonu kręgu. Obecność fragmentów kostnych i skrzepów krwi na powierzchniach płyt końcowych może utrudniać dyfuzję składników odżywczych do centrum krążka i zagrażać żywotności komórek. Nasza grupa opracowała stosunkowo szybki protokół „wyłuskiwania” (crack-out) IVD z ogona przy niskim ryzyku kontaminacji. Jesteśmy w stanie upaśmiennić świeżo przecięte powierzchnie kostnych płyt końcowych, używając chirurgicznego systemu płukania strumieniowego, który usuwa skrzepy krwi i pozostałości po cięciu, a także bardzo efektywnie przywraca drogę dyfuzji składników odżywczych do centrum IVD. Należy unikać obecności płytek wzrostu po obu stronach kości kręgu i usunąć je przed rozpoczęciem hodowli. W tym filmie przedstawiamy kluczowe kroki podczas przygotowania i demonstrujemy sposób na pomyślną hodowlę organu, utrzymującą wysoką żywotność komórek przez 14 dni w warunkach hodowli z wolnym pęcznieniem. Czas hodowli można przedłużyć, jeśli możliwe jest utrzymanie odpowiedniego środowiska mechanicznego przy użyciu bioreaktora z obciążeniem mechanicznym. Technika zaprezentowana w tym materiale może zostać rozszerzona na inne gatunki zwierząt, takie jak izolacja ogonowych i lędźwiowych IVD u świń, owiec i królików.
Protokół
1. Pobieranie krążków międzykręgowych
- Cały ogon bydlęcy pozyskuje się z lokalnej rzeźni, jeśli to możliwe bez skóry, ponieważ jej obecność zwiększa ryzyko kontaminacji (Rys. 2).
- Przygotować dużą deskę do krojenia oraz sterylną stację roboczą i narzędzia na wierzchu deski (Rys. 2).
- Pod sterylnym dygestorium z laminarnym przepływem powietrza przygotować sterylną gazę zwilżoną 0,9% chlorkiem sodu zawierającym 55mM cytrynianu sodu i umieścić ją w każdym dołku płytki 6-dołkowej.
- Przygotować miednicę i rozcieńczyć roztwór Betadiny z wodą z kranu w stosunku 1:100.
- Zanurzyć cały ogon bydlęcy w miednicy z 1% roztworem Betadiny na 5 min.
- Krótko osuszyć ogon sterylną gazą i umieścić go na steryjnej stacji roboczej.
- Ostrożnie usunąć mięśnie wokół ogona za pomocą ostrza skalpela nr 22.
- Odciąć części ogona, które nie są potrzebne, zazwyczaj oba końce ogona, które zawierają odpowiednio bardzo duże i bardzo małe IVD (Rys. 3).
- Dalej przyciąć mięśnie i ścięgna wokół IVD, używając ostrza skalpela nr 10. Należy uważać, aby nie przeciąć zewnętrznego pierścienia krążka.
- Zaznaczyć przednią część IVD chirurgicznym markerem do skóry (krok ten jest opcjonalny, pomaga wyznaczyć środek rotacji osiowej w naszym bioreaktorze).
- Zlokalizować punkt połączenia IVD z kręgiem, delikatnie poruszając ogonem. Wyczuć granicę między IVD a kością tępą stroną ostrza skalpela. Miejsce rozdzielenia powinno znajdować się 1-2 mm od IVD w stronę kręgu. Umieścić wykonany na zamówienie przemysłowy uchwyt ostrza w miejscu rozdzielenia (Rys. 4).
- Rozdzielić IVD i kręg, uderzając w górę wykonanego na zamówienie przemysłowego uchwytu ostrza (Rys. 3).
- Powtórzyć czynność po drugiej stronie połączenia IVD-kręg.
- Owiąć wyizolowany IVD sterylną gazą zwilżoną 0,9% chlorkiem sodu zawierającym 55mM cytrynianu sodu.
- Kontynuować izolację IVD do pożądanej liczby próbek (zazwyczaj można pozyskać około 6 próbek o średnicy od 10-20 mm).
- Podłączyć system płukania strumieniowego (Zimmer, inc.) do sterylnego roztworu Ringer'a z mleczanem; worki 5L są praktyczną wielkością (alternatywnie sterylny PBS lub 0,9% roztwór soli fizjologicznej).
- Przytrzymać IVD pęsetą i wypłukać strumieniowo obie strony powierzchni płytki granicznej za pomocą systemu płukania strumieniowego Zimmer Pulsavac (Rys. 1C). Strumień powinien być skierowany na powierzchnię płytki granicznej pod kątem od 30 - 60° przez około 30 s na każdą stronę (Rys. 1 i 7).
- Umieścić IVD z powrotem w płytce 6-dołkowej i owinąć zwilżoną gazą podczas płukania strumieniowego kolejnej próbki krążka.
- IVD są gotowe do hodowli organowej i dalszych zastosowań (np. oceny żywotności komórek, obciążenia mechanicznego, hodowli organowej) (Rys. 1D).
2. Reprezentatywne wyniki
Pomiarami wyników służącymi do oceny prawidłowego przygotowania krążka międzykręgowego może być eksperyment dyfuzyjny, w którym barwnik fluorescencyjny o niskiej masie cząsteczkowej (np. procion red) jest przygotowany jako roztwór 1% w PBS2. Następnie IVD pozostawia się w co najmniej 100 mL roztworu barwnika, pozwalając na jego pasywną dyfuzję do IVD przez 24h w warunkach swobodnego pęcznienia. IVD jest następnie błyskawicznie zamrażane w ciekłym azocie, doprowadzane do temperatury pokojowej i odwadniane poprzez serię przeniesień do acetonu (początkowo schłodzonego do -80 °C, następnie do -20 °C, potem do 4 °C i na koniec do temperatury pokojowej). Krążek można następnie zatopić w polimetakrylanie metylu (PMMA) i pociąć ostrym ostrzem w celu uzyskania przekrojów o grubości 100 μm. Przekroje te można oglądać za pomocą dowolnego standardowego mikroskopu w świetle przechodzącym, lecz preferencyjnie przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej, ponieważ procion red emituje czerwoną fluorescencję (Ryc. 5-6). Belki kostne powierzchni kostnej wydają się bardzo czyste po etapie płukania strumieniowego (Ryc. 7).
Parametrami warunkującymi sukces hodowli organów są przede wszystkim brak kontaminacji, utrzymana żywotność komórek (Ryc. 8-9), wysokość krążka oraz ogólna „integralność krążka”, oceniana na podstawie przekrojów histologicznych i barwienia safraniną O/fast green lub hematoksyliną Meyera 3. Opracowaliśmy protokoły i makra opublikowane w innych opracowaniach4,5 w celu barwienia żywej tkanki krążka oraz skanowania żywotności komórek w 3D z wykorzystaniem konfokalnego mikroskopu skaningowego oraz zestawu do barwienia żywe/martwe (Molecular Probes, Invitrogen, Basel, Szwajcaria). Opracowaliśmy ponadto makro i rutynę do automatycznego liczenia komórek w celu oszacowania ich żywotności w tkance 3D lub nośnikach 3D przy użyciu platformy NIH ImageJ4-6. Zaproponowano alternatywne protokoły określania żywotności komórek krążka poprzez wstępne trawienie sekwencyjne macierzy zewnątrzkomórkowej za pomocą pronazy i kolagenazy typu 2, a następnie barwienie zawiesiny komórkowej7. Wcześniejsza wersja protokołu obejmowała etap inkubacji w PBS zawierającym dziesięciokrotnie większe stężenie penicyliny/streptomycyny przez 10 min po pobraniu krążków, przed rozpoczęciem hodowli organów. Wprowadzenie etapu płukania strumieniem wody sprawia, że krok ten staje się zbędny, gdyż płukanie wydaje się korzystniejsze dla celów hodowlanych.
Rysunek 1. Przegląd kroków metodologicznych przygotowania bydlęcych krążków międzykręgowych z odcinka kośćca z nienaruszonymi płytkami granicznymi i cienką warstwą (1-2 mm) kości. A) Schematyczny widok krążka międzykręgowego (IVD) i jego dróg odżywiania. B) Procedura wycinania IVD za pomocą dostosowanego uchwytu z ostrzem i przemysłowego ostrego noża. C) Etap płukania strumieniowego w celu zapewnienia wysokiej żywotności komórek i umożliwienia wymiany składników odżywczych przy zachowaniu płytek granicznych i 1-2 mm kości po obu stronach. D) Ostatecznie IVD może być hodowany w komorze na próbki bioreaktora lub wykorzystany w dowolnej aplikacji analitycznej.
Rysunek 2. GÓRA: Ogon bydlęcy o pełnej długości (idealnie pozyskany w ciągu 2-3 godzin po uboju, aby zapewnić wysoką żywotność komórek). DÓŁ: Obraz rentgenowski ogona bydlęcego w wieku około 6 miesięcy, ilustrujący obecność płytek wzrostu (GP), wtórnego ośrodka kostnienia, pomiędzy kostnymi płytkami krańcowymi (EP) a trzonami kręgów (VB).
Rysunek 3. A) Narzędzia do sekcji ogona bydlęcego w warunkach sterylnych. B) Dostosowany uchwyt ostrza do wycinania segmentów ruchowych z ogona bydlęcego podczas przecinania krążka międzykręgowego. C) Widok boczny dostosowanego uchwytu ostrza ze standardowym ostrzem przemysłowym (Lutz, Niemcy).
Rycina 4. Rysunek i zdjęcie bydlęcego ogona po usunięciu otaczających mięśni i więzadeł, ilustrujące miejsca rozdzielenia w celu wycięcia segmentów ruchomych. Częściowy kręg powinien zostać „pęknięty” za pomocą specjalnie wykonanego uchwytu ostrza, najlepiej w odległości 1-2 mm od chrzęstnych płytek granicznych, aby zapewnić pełną powierzchnię kości.
Rycina 5. Prezentacja skuteczności oczyszczania podczas etapu przemywania strumieniowego przed (A) i po (B). Zwróć uwagę na czyste powierzchnie kostne segmentów krążków międzykręgowych po procedurze natryskowej.
Rycina 6. Eksperyment dyfuzji z wolnym pęcznieniem świeżo przygotowanych wyciętych krążków międzykręgowych (IVDs) z ogona bydlęcego, pozostawionych na 24 godziny w 1% roztworze procion red, wykazujący efekt blokady przez płytkę wzrostu. Cyfrowy obraz RTG w widoku strzałkowym IVD nadal zawierającego płytkę wzrostu oraz obraz mikroskopii fluorescencyjnej drugiej warstwy kości w przekroju strzałkowym eksplantu krążka międzykręgowego z ogona bydlęcego z chrzęstną i kostną płytką graniczną po 24h wolnej dyfuzji. GP: płytka wzrostu, 2ndry CO: wtórne centrum kostnienia.
Rycina 7. Eksperyment swobodnego pęcznienia świeżo przygotowanych wyciętych krążków międzykręgowych (IVDs) z ogona bydlęcego, pozostawionych na 24 godziny w 1% roztworze Procion Red, wykazujący efekt oczyszczający zabiegu płukania strumieniowego. Sagitalne grube przekroje (~100 mm) wyciętych bydlęcych IVDs z płytkami granicznymi o grubości ~1,5 mm, które poddano płukaniu strumieniowemu (lewa strona) oraz strona kontrolna bez zabiegu (prawa strona) – płukanie strumieniowe. Wstawka przedstawia wzór natrysku, który został zastosowany z systemu opracowywania ran Zimmer podczas 24-godzinnych eksperymentów swobodnej dyfuzji w eksplantach krążków międzykręgowych bydlęcych w 1% Procion Red.
Rycina 8. Obrazy Live/Dead będące projekcjami stosów obrazowania konfokalnego ( ̃250μm), wykonane z segmentów krążka międzykręgowego bydła przygotowanych metodą jet-lavage i utrzymywanych w stanie swobodnego pęcznienia odpowiednio przez 0 i 14 dni w obrębie jądra miażdżystego (NP), wewnętrznego pierścienia włóknistego (IA) oraz zewnętrznego pierścienia włóknistego (OA). Komórki zielone = komórki żywe barwione calcein AM (acetyl methylester), komórki czerwone = jądra komórek martwych barwione etydyną homodimerem-1.
Rysunek 9. Żywotność komórek dysku międzykręgowego oceniana za pomocą konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej na żywej tkance i skanowania stosów 3D. Żywotność komórek jądra miażdżystego (NP) oraz pierścienia włóknistego (AF) w ciągu 21 dni hodowli w warunkach swobodnego pęcznienia. (Średnia ± SEM, N=6) Różnice statystyczne między grupami badano za pomocą nieparametrycznego testu sum rang Kruskala-Wallisa. W NP stwierdzono istotne różnice między dniem 21 a wszystkimi pozostałymi punktami czasowymi. W AF istotne różnice stwierdzono między dniem 7 a dniem 0. (* p < 0.05, ** p < 0.01).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Pierwszym krokiem do pomyślnej hodowli organów jest upewnienie się, że eksplant nie jest zanieczyszczony. Przed rozpoczęciem procedury należy zdjąć skórę z ogona. Każdy włos zwierzęcy wniesiony do sterylnego laboratorium może stanowić problem w kontekście kontaminacji. Ogon bydlęcy powinien być idealnie jak najświeższy (wpływa to na początkową żywotność komórek). Ponadto, w celu dalszego zmniejszenia ryzyka zanieczyszczenia, zaleca się etap mycia betadyną. Zamiast używania specjalnie wykonanego uchwytu do ostrza i młotka...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
Projekt ten był wspierany przez Szwajcarską Narodową Fundację Naukową (Swiss National Science Foundation, SNF # 310030-127586/1).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Świeża tkanka krążka międzykręgowego bydła z ogonów bydlęcych, z lokalnej rzeźni (najlepiej w ciągu kilku godzin po śmierci i bez skóry). | |||
| System Pulsavac Plus AC | Zimmer inc., Switzerland | 00-5150-486-01 | Najlepsza wydajność z końcówką typu hip-spray i z zasilaczem AC (wersja z pakietem 8 baterii AA d–różnie również działa, ale jest mniej wygodna) |
| Dysza rozproszona o wysokiej wydajności z osłoną przed rozbryzgami, długość 12,7cm | Zimmer inc., Switzerland | 00-5150-175-00 | Dostępnych jest kilka końcówek natryskowych; tę przetestowaliśmy pomyślnie |
| Ostrza skalpela nr 22 i nr 10 | Swann-Morton | #10: 0201 #22: 0208 | |
| Uchwyty ostrzy skalpela nr 3 i nr 4 | Hausmann, Germany | #3: 06.103.00 #4: 06.104.00 | |
| Przemysłowe ostrze Lutz | Lutz, Germany | 1022.0884 | |
| Bufor fosforanowo-solny (PBS) | Invitrogen | 10010-023 | |
| Podłoże DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | GIBCO, by Life Technologies | 11960-044 | |
| Roztwór Ringer’a z mleczanem (bez glukozy) | Bichsel, Switzerland | 133 0002 | |
| Płytka wielodobowa 6-dołkowa | Techno Plastic Products | 92006 | |
| Roztwór Betadyny | Mundipharma, Switzerland | 10055025 | |
| Chirurgiczny marker do skóry | Porex Surgical, Switzerland | 9560 | |
| Duża deska do cięcia | Możliwa dowolna marka |
Bibliografia
- Lee, C. R., Iatridis, J. C., Poveda, L., Alini, M. In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies. Spine (Phila Pa 1976). 31, 515-522 (1976).
- Chan, S. C. W., Gantenbein-Ritter, B., Leung, V. Y., Chan, D. Cryopreserved intervertebral disc with injected bone marrow-derived stromal cells: a feasibility study using organ culture. Spine. J. 10 (6), 486-496 (2010).
- Chan, S. C., Ferguson, S. J., Wuertz, K., Gantenbein-Ritter, B. Biological Response of the Intervertebral Disc to Repetitive Short Term Cyclic Torsion. Spine (Phila Pa 1976). , (2011).
- Gantenbein-Ritter, B., Sprecher, C. M., Chan, S., Illien-Jünger, S., Grad, S. Confocal imaging protocols for live/dead staining in three-dimensional carriers. Methods Mol. Biol. 740, 127-140 (2011).
- Gantenbein-Ritter, B., Potier, E., Zeiter, S., van der Werf, M. Accuracy of three techniques to determine cell viability in 3D tissues or scaffolds. Tissue Engineering Part C Methods. 14, 353-358 (2008).
- Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. (1997).
- Haschtmann, D., Stoyanov, J. V., Ettinger, L., Nolte, L. P., Ferguson, S. J. Establishment of a novel intervertebral disc/endplate culture model: analysis of an ex vivo in vitro whole-organ rabbit culture system. Spine. 31, 2918-2925 (2006).
- Gantenbein, B., Grünhagen, T., Lee, C. R., van Donkelaar, C. C. An in vitro organ culturing system for intervertebral disc explants with vertebral endplates: a feasibility study with ovine caudal discs. Spine. 31, 2665-2673 (2006).
- Korecki, C. L., Kuo, C. K., Tuan, R. S., Iatridis, J. C. Intervertebral disc cell response to dynamic compression is age and frequency dependent. J. Orthop. Res. 27, 800-806 (2009).
- Korecki, C. L., MacLean, J. J., Iatridis, J. C. Dynamic compression effects on intervertebral disc mechanics and biology. Spine (Phila Pa 1976). 33, 1403-1409 (1976).
- Jim, B., Steffen, T., Moir, J., Roughley, P., Haglund, L. Development of an intact intervertebral disc organ culture system in which degeneration can be induced as a prelude to studying repair potential. European Spine Journal. , 1-11 (2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Tagi
Przygotowanie kr ka mi dzykr gowegokr ek mi dzykr gowy z ogona bydl cegosystem p ukania strumieniowegotechnika hodowli organ woczyszczanie powierzchni p yt ko cowychmetoda eksperymentu dyfuzyjnegobarwienie ywe martwehodowla w swobodnym obrzmieniubioreaktor obci enia mechanicznegousuni cie p ytki wzrostu
