Izolacja i oczyszczanie kinezyny z embrionów Drosophila

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje sposób izolacji aktywnej, pełnowymiarowej kinezyny z embrionów Drosophila do biofizycznych badań pojedynczych cząsteczek. Przedstawiamy sposób zbierania embrionów, przygotowania lizatu embrionalnego, a następnie polimeryzacji mikrotubul (MT). Kinezynę oczyszcza się poprzez jej unieruchomienie na mikrotubulach, odwirowanie kompleksów kinezyna-MT, a następnie uwolnienie kinezyny z mikrotubul poprzez dodanie ATP.

Streszczenie

Białka motoryczne transportują ładunki wzdłuż mikrotubul, dostarczając je do konkretnych lokalizacji wewnątrzkomórkowych. Ponieważ zakłada się, że zaburzenia transportu leżą u podstaw wielu chorób neurodegeneracyjnych, zrozumienie transportu motorowego opartego na mikrotubulach oraz jego regulacji prawdopodobnie doprowadzi w przyszłości do opracowania lepszych metod terapeutycznych. Kinezyna-1 jest eukariotycznym białkiem motorycznym, które porusza się w kierunku anterogradnym (do końca plusowego) wzdłuż mikrotubul (MTs), a proces ten jest napędzany hydrolizą ATP. Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół oczyszczania w celu izolacji aktywnej kinezyny o pełnej długości z embrionów Drosophila, co umożliwia połączenie genetyki Drosophila z biofizycznymi badaniami pojedynczych cząsteczek. Rozpoczynając od około 50 pojemników do składania jaj, zawierających około 1000 samic w każdym, przeprowadzono nocne zbiory. Uzyskano w ten sposób około 10 ml upakowanych embrionów. Embriony poddano dechorionacji podchlorynem (uzyskując około 9 g embrionów), a następnie homogenizacji. Po rozbiciu homogenat został sklarowany poprzez wirowanie z niską prędkością, a następnie centryfugację z wysoką prędkością. Sklarowany supernatant potraktowano GTP i taksolem w celu polimeryzacji MTs. Kinezynę unieruchomiono na spolimeryzowanych MTs poprzez dodanie analogu ATP, 5'-adenylyloimidodifosforanu w temperaturze pokojowej. Po związaniu kinezyny mikrotubule osadzono za pomocą centryfugacji z wysoką prędkością przez poduszkę sacharozową. Osad mikrotubul ponownie zawieszono, a proces ten powtórzono. Na koniec dodano ATP, aby uwolnić kinezynę z MTs. Następnie centryfugacja z wysoką prędkością spowodowała osadzenie MTs, pozostawiając kinezynę w supernatancie. Kinezynę tę poddano filtracji odśrodkowej przy użyciu filtra z progiem odcięcia 100 KD w celu dalszego oczyszczania, a następnie podzielono na alikwoty, zamrożono gwałtownie w ciekłym azocie i przechowywano w -80 °C. Elektroforezę w żelu SDS oraz western blotting przeprowadzono z użyciem oczyszczonej próbki. Aktywność motorową oczyszczonych próbek przed i po końcowym etapie filtracji odśrodkowej oceniono za pomocą testu pojedynczych cząsteczek mikrotubul in vitro. Frakcje kinezyny przed i po filtracji odśrodkowej wykazały procesywność, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami w literaturze. Trwają dalsze eksperymenty w celu oceny interakcji między kinezyną a innymi białkami związanymi z transportem.

Protokół

Szczepy much można zakupić i namnożyć w laboratorium. W zależności od liczby otrzymanych probówek z hodowlą Drosophila, należy często „przesadzać” (flip) kulturę, gdy probówki osiągną maksymalną pojemność. Namnażanie trwa do momentu zapełnienia około 50 probówek z hodowlą Drosophila. Następnie przygotowuje się „kubki do much” z zlewkami trójkątnych o pojemności 100 ml (przygotowanie kubków do much omówiono w następnej sekcji). Po 24 godzinach należy wykorzystać embriony z tych kubków do zaszczepienia nowych probówek z hodowlą Drosophila z przymocowaną na dnie pożywką dla much. W temperaturze pokojowej czas wzrostu embrionów Drosophila od stadium embrionów nocnych do w pełni wyrośniętych much wynosi około 8,5 dnia. Zaszczepione embriony wykluwają się po 12-15 godzinach w pierwszym stadium larwalnym. Larwy rosną przez około 4 dni, przechodząc dwukrotnie linienie do drugiego i trzeciego stadium larwalnego, odpowiednio 24 i 48 godzin po wykluciu. Następnie larwy zamykają się w pupariach i przechodzą 4-dniową metamorfozę, aż do wyjścia z poczwarki ¹. Należy pozostawić muchy na około dwa do trzech dni w probówkach z hodowlą Drosophila, aby zwiększyć ich liczbę w każdej z nich. Po zapełnieniu 400 probówek dostępna będzie wystarczająca liczba much dla pięćdziesięciu kubków do składania jaj (około 1000 samic na kubek). Muchy potrzebują czasu na aklimatyzację w nowym środowisku. Zazwyczaj mija około dwóch dni od przeniesienia do kubków, zanim będą gotowe do zbioru. Codzienna wymiana płytek z agarem pozwoli utrzymać kubki w czystości, co wydłuży życie much. (W celu pogłębienia wiedzy na temat pielęgnacji i namnażania Drosophila, prosimy zapoznać się z publikacją D. B. Roberts' Drosophila: A Practical Approach ²).

Dobrym źródłem pozyskiwania dużych ilości zarodków Drosophila są klatki populacyjne ³, które są dostępne w sprzedaży. Sposób montażu i utrzymania klatek populacyjnych opisano w rozdziałach 5 i 7 książki Drosophila Melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology⁴. Klatki populacyjne są jednak kosztowne i trudne w utrzymaniu. Ponieważ w klatkach populacyjnych może znajdować się bardzo duża liczba much, do ich przenoszenia i karmienia niezbędne jest zastosowanie dwutlenku węgla. Jak wspomniano wcześniej, dwutlenek węgla pogarsza stan zdrowia much, co skutkuje mniejszą liczbą składanych jaj. W mniejszej skali można wykorzystać zlewki trójkątne o pojemności 100 ml. Przy użyciu pięćdziesięciu zlewek 100 ml można uzyskać 9 g zdechorionowanych zarodków. W celu usunięcia martwych much, niewykorzystanej pasty drożdżowej oraz innych zanieczyszczeń stworzyliśmy dwuwarstwowe sitko o różnych rozmiarach oczek. Pierwsze sito wyłapuje niepożądane materiały, takie jak martwe muchy, pozwalając jednocześnie na przejście zarodków (rozmiar porów 350 micron). Druga część zawiera siatkę (rozmiar porów 120 microns), która ma za zadanie zatrzymać zarodki Drosophila, podczas gdy pozostałe zanieczyszczenia przechodzą przez siatkę.

1. Przygotowanie probówek z muchami i zbieranie embrionów

1. Przenieś rozmnożone muchy z wielu probówek do pustej plastikowej probówki, aż ich ilość osiągnie wysokość jednego cala. Następnie przenieś te muchy do 100 ml kubka do zbierania jaj (zlewka trójnogiego z nylonowymi okienkami z siatki). Podczas przenoszenia much lekko opukuj kubek o twardą powierzchnię, aby zapobiec ich ucieczce. Przykryj kubek szalką Petriego z agarem zawierającym pastę drożdżową i pozostaw na 24-48 h w celu stabilizacji.
2. Zbierz szalki z agarem z pięćdziesięciu kubków z muchami i wypłucz zawartość szalek do łapacza z sita, używając czystego pędzla i bieżącej wody. Przepłucz embriony w sicie obfitą ilością wody, aż cała pasta drożdżowa zostanie wypłukana.
3. Przeprowadź dechorionację oczyszczonych embrionów poprzez zanurzenie ich w 50% bleach przez 3 min.
4. Płucz obficie wodą destylowaną, aż embriony przestaną pachnieć wybielaczem. Następnie osusz siatkę z embrionami, kilkukrotnie przykładając ją do złożonego w kostkę ręcznika papierowego. Przenieś embriony do czystej probówki i zapisz ich wagę.

2. Homogenizacja i klarowanie zarodków

1. Umieścić embriony pozbawione chorionu w homogenizatorze Dounce wraz z 1,5-krotnością objętości lodowatego buforu do ekstrakcji.
2. Wykonać 5 ruchów luźnym tłuczkiem. Homogenizat rozdzielić na alikwoty do czystych probówek wirówkowych. Wirować przy 15 000 g przez 40 min w temperaturze 4 °C.
3. Ostrożnie zebrać klarowny nadsącz, pomijając górną białą warstwę lipidową oraz dolny osad.
4. Przenieść nadsącz do czystych probówek wirówkowych i wirować przy 50 000 g przez 30 min w temperaturze 4 °C.
5. Otrzymany nadsącz po wirowaniu wysokoprędkościowym, zebrany w opisany wyżej sposób, można wykorzystać natychmiast lub zamrozić szokowo i przechowywać w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy.

3. Polimeryzacja mikrotubul i wiązanie kinezyny

1. rozmrozić zamrożony supernatant po wirowaniu przy wysokiej prędkości do temperatury pokojowej. Aby polimeryzować mikrotubule, dodać GTP (0.3 mM) oraz taksol (20 μM) i delikatnie mieszać w temperaturze pokojowej przez 20 min w wytrząsace obrotowej.
2. Aby związać kinezynę, dodać 2.5 mM niehydrolizowalnego analogu ATP – 5'-adenyloimidodifosforanu (AMPPNP), a następnie mieszać przez 10 min w temperaturze pokojowej w wytrząsace obrotowej.

4. Sedymentacja różnicowa mikrotubul i kinezyny

1. Osadź próbkę przez równą objętość poduszki sacharozowej (20% sacharozy i 10 μM taxolu w buforze do ekstrakcji) poprzez wirowanie przy 23,000 g (rotor sw41ti, TLS-55) przez 30 min w temperaturze 4 °C.
2. Przemyj osad poprzez resuspensję w objętości stanowiącej 10% pierwotnej objętości homogenatu w buforze do ekstrakcji zawierającym 10 μM taxolu i 75 mM NaCl.
3. Powtórz sedymentację z kolejną równą objętością poduszki sacharozowej, zgodnie z krokiem 4.1.
4. Resuspenduj osad z przemywania solnego w 5% buforze do ekstrakcji z dodatkiem 20 μM taxolu, 75 mM NaCl, 10 mM MgSO₄ oraz 10 mM ATP.
5. Wirowuj przy 120,000 g (rotor sw41ti: 31,000 rpm, TLS-55: 42,000 rpm) przez 20 min w temperaturze 4 °C. Zbierz nadsącz (frakcja kinezyn).
6. Przeprowadź filtrację odśrodkową przy 14,000 g przez 15 min w temperaturze 4 °C. Odzyskaj skoncentrowaną próbkę i powtórz filtrację z nowym filtrem w opisany wyżej sposób przez 30 minut, a następnie zbierz skoncentrowaną próbkę.
7. Wykonaj analizę białek w celu określenia stężenia. W skrócie, różne stężenia znanego białka (albuminy surowicy bydlęcej; BSA) zmieszano ze znaną objętością odczynnika Bradforda i zmierzono gęstość optyczną przy długości fali 595nm. Następnie sporządzono krzywą wzorcową gęstości optycznej w zależności od stężenia, aby obliczyć nieznane stężenie oczyszczonej frakcji kinezyn, wykorzystując gęstość optyczną tej próbki zmierzoną w warunkach analogicznych do próbek wzorcowych BSA. Wykonano również elektroforezę w żelu oraz western blotting z użyciem znanej ilości oczyszczonej kinezyny.
8. Rozdziel frakcję kinezyn na małe alikwoty o pożądanym stężeniu i zamroź gwałtownie w ciekłym azocie w celu przechowywania w temperaturze -80 °C.

5. Reprezentatywne wyniki

Pełnej długości funkcjonalna kinezyna została oczyszczona z embrionów Drosophila. Rysunek 1 przedstawia żel barwiony srebrem, pokazujący poszczególne frakcje podczas oczyszczania. Ścieżka 1 to próbka nad supernatantu po wirowaniu z wysoką prędkością w celu klarowania (krok 2.5), ścieżka 2 to próbka osadu po klarowaniu, ścieżka 3 to próbka supernatantu po pierwszej sedymentacji na poduszce sacharozowej (krok 4.1), ścieżka 4 to próbka osadu po pierwszej sedymentacji, ścieżka 5 to próbka supernatantu po drugiej sedymentacji (krok 4.3), ścieżka 6 to próbka osadu po drugiej sedymentacji, ścieżka 7 to próbka osadu z końcowej sedymentacji (krok 4.5), ścieżka 8 to próbka oczyszczonej kinezyny, ścieżka 9 to próbka przefiltrowanej kinezyny, a ścieżka 10 to marker. Skoncentrowany prążek w ścieżkach 8 i 9 przy około 115 kD to ciężki łańcuch kinezyny 1, co jest zgodne z Rysunkiem 1, ścieżką 8 w pracy Saxtona opublikowanej w 1988 roku⁵. Rysunek 2 przedstawia western blot frakcji oczyszczonej kinezyny wykrytej przy użyciu przeciwciała przeciwko ciężkiemu łańcuchowi kinezyny. Przeciwciało AKINO1-A nie wykazuje istotnych reakcji krzyżowych z innymi członkami rodziny kinezyn ⁶. Należy zauważyć, że choć niniejszy protokół pozwala na uzyskanie dobrego źródła funkcjonalnej kinezyny i frakcja jest wzbogacona w kinezynę-1, prawdopodobnie występują w niej zanieczyszczenia, w tym potencjalnie inne kinezyny i białka motorowe. Usunęliśmy szereg mniejszych zanieczyszczeń poprzez filtrację. W kwestii usuwania innych białek motorowych, czego nie da się osiągnąć wyłącznie na podstawie wielkości, proces oczyszczania jest podobny do metod stosowanych przez innych badaczy kinezyny ⁷ i uważamy, że większość aktywnego motoru to kinezyna-1, jednak bardziej zaawansowane oczyszczanie pozwoliłoby na usunięcie potencjalnych zanieczyszczeń motorowych, tak jak zrobili to Cole et al⁸ oraz Saxton et al.⁹

Procesywność kinezyny oceniono za pomocą testu wiązania pojedynczych cząsteczek do mikrotubul in vitro, zgodnie z bardziej szczegółowym opisem w książce Scholeya zatytułowanej „Motility Assay for Motor Proteins”¹⁰. W skrócie, kulki polistyrenowe z pojedynczym aktywnym motorem doprowadzono do kontaktu z mikrotubulą w obecności nasycającego stężenia (1 mm) ATP. Motor przyłączył się do mikrotubuli i zaczął oddalać się od centrum pułapki laserowej. Po osiągnięciu zdefiniowanego przesunięcia kulki z centrum pułapki (100 nm) moc wiązki laserowej została automatycznie wyłączona, co umożliwiło motorowi ruch wzdłuż mikrotubuli bez obciążenia. Film przedstawia kulkę o średnicy 500 nm z pojedynczą kinezyną poruszającą się wzdłuż mikrotubuli. Długość ekranu wideo odpowiada 20 μm. Rysunek 3 przedstawia zmierzony rozkład długości przebiegu dla pojedynczych, pełnowymiarowych cząsteczek kinezyny Drosophila, oczyszczonych zgodnie z przedstawionym tutaj protokołem. Dopasowanie wykładnicze do rozkładu wskazuje średnią długość przebiegu pojedynczej kinezyny wynoszącą odpowiednio 1,55 ± 0,1 μm dla próbki filtrowanej i 1,28 ± 0,12 μm dla próbki niefiltrowanej.

Rysunek 1. Żel barwiony srebrem frakcji oczyszczonych: Próbki z każdej frakcji naniesiono na żel 10%. W każdej studni załadowano 10 μg białka. Ścieżka 1: próbka nadpływu po wirowaniu z dużą prędkością po klarowaniu (krok 2.5), ścieżka 2: próbka osadu po klarowaniu, ścieżka 3: próbka nadpływu po pierwszej sedymentacji na poduszce sacharozowej (krok 4.1), ścieżka 4: próbka osadu po pierwszej sedymentacji, ścieżka 5: próbka nadpływu po drugiej sedymentacji (krok 4.3), ścieżka 6: próbka osadu po drugiej sedymentacji, ścieżka 7: próbka osadu z końcowej sedymentacji (krok 4.5), ścieżka 8: oczyszczona próbka kinezyny, ścieżka 9: kinezyna przefiltrowana przy użyciu wirówkowego filtra Amicon ultra 0.5 ml z odcięciem 100 kD (Millipore, USA). Niebieskie strzałki wskazują białka, których ilość uległa zmniejszeniu, a czerwona strzałka wskazuje stężenie kinezyny w wyniku etapu filtracji wirowej zastosowanego w niniejszym protokole.

Rysunek 2. Oczyszczona frakcja KHC poddana immunoblottingowi z przeciwciałem anty-kinezynowym: Oczyszczoną próbkę kinezyny poddano elektroforezie żelowej i przeniesiono (na membranę nitrocelulozową), a następnie inkubowano z przeciwciałem pierwszorzędowym AKINO1-A (1:1,000 w TBST) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, po czym inkubowano z przeciwciałem wtórnym osioł-anty-królik (1:10,000 w TBST) przez godzinę w temperaturze pokojowej. Do wykrycia przedstawionego powyżej sygnału kinezyny użyto zestawu ECL (chemiluminescencyjnego).

Rysunek 3. Długość ruchu i prędkość pojedynczej pełnowymiarowej kinezyny Drosophila: (A) i (B) Długość ruchu i prędkość przefiltrowanej próbki kinezyny. (C) i (D) Długość ruchu i prędkość nieprzefiltrowanej próbki kinezyny.

Rycina 4. Film przedstawiający ruch kinesyny. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.

Dyskusja

Mózg bydlęcy jest najczęściej stosowanym materiałem wyjściowym ¹¹ do oczyszczania pełnowymiarowej kinezyny, choć wykorzystywano również mózg myszy ¹². Dużą wadą stosowania mózgu bydlęcego jako źródła kinezyny jest dostępność świeżego materiału wyjściowego: rzeźnie są zazwyczaj niedostępne, a mózg musi być niezwykle świeży, aby uzyskać aktywną kinezynę. Ponadto skuteczne są jedynie mózgi młodych krów. Wreszcie, manipulacje genetyczne u krów nie są obecnie realną opcją, w związku z czym można badać je...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agar (ziarnisty)	Fisher Scientific	1423-500
Dekstroza (D-glukoza) bezwodna	Fisher Scientific	D16-3
Szalki Petriego	BD Biosciences	35 1007	Typ 60x15mm (poliestrowe) 20/opakowanie
Drosophila probówki hodowlane	UCI
Zlewka stożkowa	Econo Lab Inc.	B700-100	Objętość: 100ml, rozmiar: 58x72mm
Drożdże	Red Star	2751
Siatka nylonowa	Genesee Scientific	57-102	Wielkość porów 120 mikronów
Siatka nylonowa	Small Parts, Inc.	06-350/35
Pipety	Sigma-Aldrich	108321-27-3
Pipety	Sigma-Aldrich	108321-27-3
Glicerol	Fisher Scientific	56-81-5
EGTA	Sigma-Aldrich	67-42-5
MgS04 (bezwodny)	Fisher Scientific	7487-88-9
PMSF	Sigma-Aldrich	329-98-6
Leupeptyna	Sigma-Aldrich	103476-89-7
Aprotonina	Sigma-Aldrich	9087-70-1
TAME	Sigma-Aldrich	178403-8
STI	Calbiochem	65635
GTP	Sigma-Aldrich	36051-31-7
Taxol	Sigma-Aldrich	33069-62-4
Analog ATP 5’-adenylyloimidodifosforan	Sigma-Aldrich	3605-31-7
NaCl	Mallinckrodt Baker Inc.	7647-14-5
ATP	Sigma-Aldrich	74804-12-9
Odśrodkowe filtry Amicon Ultra: 0,5 mL, próg odcięcia 100kD, opakowanie 8 sztuk	EMD Millipore	UFC510008