Opracowaliśmy nowe narzędzia laboratoryjne i protokoły do obrazowania intravitalnego grasicy. Nasza technika powinna pomóc w identyfikacji „nisz” w obrębie grasicy, w których zachodzi rozwój limfocytów T.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie przyżyciowe grasicy myszy z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mikroskopia dwufotonowa (TPM) umożliwia obrazowanie głębokich obszarów wewnątrz tkanek i narządów. W połączeniu z rozwojem nowych narzędzi stereotaktycznych i procedur chirurgicznych, TPM staje się potężną techniką identyfikacji „nisz” wewnątrz narządów oraz dokumentowania „zachowań” komórkowych u żywych zwierząt. Choć obrazowanie intravitalne dostarcza informacji najlepiej oddających rzeczywiste zachowanie komórek wewnątrz narządu, jest ono bardziej pracochłonne i wymagające technicznie pod względem niezbędnego sprzętu i procedur niż alternatywne obrazowanie ex vivo. W związku z tym opisujemy procedurę chirurgiczną oraz nowy „stereotaktyczny” uchwyt do narządów, który pozwala nam śledzić ruchy komórek Foxp3+ w obrębie grasicy.
Foxp3 jest głównym regulatorem generowania regulacyjnych limfocytów T (Tregs). Ponadto komórki te można klasyfikować według ich pochodzenia: tzn. Tregs różnicujące się w grasicy nazywa się „naturalnie występującymi Tregs” (nTregs), w przeciwieństwie do Tregs konwertowanych obwodowo (pTregs). Chociaż w literaturze opisano znaczną ilość badań dotyczących fenotypu i fizjologii tych limfocytów T, bardzo niewiele wiadomo o ich oddziaływaniach in vivo z innymi komórkami. Niedobór ten może wynikać z braku technik pozwalających na przeprowadzenie takich obserwacji. Protokół opisany w niniejszej pracy stanowi rozwiązanie tego problemu.
Nasz protokół polega na wykorzystaniu myszy nude, które nie posiadają endogennego tymusu z powodu punktowej mutacji w sekwencji DNA, która upośledza różnicowanie niektórych komórek nabłonkowych, w tym komórek nabłonkowych tymusu. Myszy nude poddano naświetlaniu gamma, a następnie zrekonstruowano za pomocą szpiku kostnego (BM) pochodzącego od myszy Foxp3-KIgfp/gfp. Po regeneracji szpiku (6 tygodni), każdemu zwierzęciu wykonano przeszczep embrionalnego tymusu do torebki nerki. Po przyjęciu przeszczepu tymusu (6 tygodni), zwierzęta zanieczulono; nerkę z przeszczepionym tymusem odsłonięto, zamocowano w naszym uchwycie do organów i utrzymano w warunkach fizjologicznych w celu obrazowania in vivo za pomocą TPM. Wykorzystujemy to podejście do badania wpływu leków na generowanie limfocytów T regulatorowych.
Protokół
1. Przygotowanie zwierząt
Ważne uwagi: zawiesiny komórek szpiku kostnego (BM) oraz przeszczepy grasicy przeprowadzano w warunkach aseptycznych. Zawiesiny BM przygotowywano w komorach laminarnych w pomieszczeniu do hodowli komórkowej, natomiast przeszczepy grasicy wykonywano w sali operacyjnej znajdującej się w naszym zwierzęciu. Aby zachować i zagwarantować te warunki aseptyczne, nie było nam dozwolone rejestrować materiałów wideo w tych miejscach. Jednak wszystkie materiały chirurgiczne zostały autoklawowane, a stół operacyjny uprzednio oczyszczony preparatem Virkon (Pharmacal Research Laboratories Inc.) oraz 70% etanolem. Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) i były zgodne z dyrektywami Federacji Europejskich Stowarzyszeń Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych (FELASA). Numer zatwierdzenia to AO10/2010. Wszystkie eksperymenty obrazowe były procedurami terminalnymi, a zwierzęta zostały poddane eutanazji natychmiast po zakończeniu akwizycji obrazów.
Szczegółowa procedura przedstawia się następująco:
- Naświetl (za pomocą irradiatora γ) 8-tygodniowe myszy Nude dawką 900 rads, aby zniszczyć endogenne prekursory krwiotwórcze w szpiku kostnym (BM). Po napromieniowaniu zwróć zwierzęta do klatek do czasu przygotowania komórek szpiku dawcy do wstrzyknięcia dożylnego i dalszej rekonstytucji BM. Przeszczep szpiku przeprowadzono 1 h po napromieniowaniu.
- Wyodrębnij zwierzęta dawców szpiku. Kości piszczelowe i udowe kończyn tylnych jednego zwierzęcia są zazwyczaj wystarczające do rekonstytucji do 3 zwierząt biorców. Po eutanazji za pomocą CO2, usuń kończyny tylne, a następnie usuń skórę i mięśnie z kości.
- Odetnij zamknięty koniec każdej kości i wypłucz go PBS (lub RPMI) lub rozgnieć je wszystkie w moździerzu z tłuczkiem, dodając 2 ml PBS (lub RPMI), aby wydobyć szpik kostny.
- Rozbij strukturę szpiku do postaci zawiesiny jednokomórkowej poprzez wielokrotną, energiczną aspirację za pomocą pipety P1000. Alternatywnie można kilkukrotnie przepuścić szpik przez igłę strzykawki 21G. Odwiruj (400g, 5 min, R.T.), ponownie zawieś komórki w PBS i wstrzyknij dożylnie napromieniowanym biorcom Nude. W naszych eksperymentach użyto szpiku z myszy Foxp3-KIgfp/gfp, w których wszystkie limfocyty T regulacyjne (Tregs) będą wykazywać ekspresję GFP1.
- Przyjęcie szpiku dawcy następuje w pierwszych dniach po transferze, ponieważ zwierzęta bez rekonstytucji BM nie przeżywają dłużej niż 14 dni. Należy jednak odczekać od 4 do 6 tygodni, aby umożliwić pełną regenerację wszystkich komponentów szpiku. Do wody dodano Bactrim (Roche) (2 mg/ml) w pierwszym tygodniu po napromieniowaniu, aby zmniejszyć ryzyko infekcji bakteryjnych.
- Transplantacja grasicy embrionalnej została już opisana2. W skrócie: rozpocznij rozmnażanie izogenicznych par myszy i codziennie sprawdzaj obecność czopa nasiennego (dowód kopulacji). Oddziel samice z czopem i poddaj je eutanazji CO2 w 15. dniu ciąży (obserwacja czopa to 1. dzień ciąży). Usuń embriony i grasice. Umieść embrionalne grasice w zimnym PBS do czasu transferu.
- Aby przeprowadzić transplantację grasicy, znieczul myszy Nude będące biorcami BM ketaminą (120 μg/g masy ciała myszy) / ksylazyną (16 μg/g masy ciała myszy) i utrzymuj je na podgrzewaczce w temperaturze 37°C aż do utraty przytomności.
- Chirurgicznie odsłoń nerkę, aby przeprowadzić transplantację grasicy. Najpierw przemyj skórę preparatem ChloraPrep (Carefusion Inc.) i 70% etanolem. Następnie wykonaj 1 cm nacięcie na skórze boczno-grzbietnej części ciała zwierzęcia, 2 mm poniżej ostatniego żebra piersiowego.
- Otwórz jamę otrzewną i wyciągnij z niej nerkę. Wykonaj małe, powierzchowne nacięcie w torebce nerki za pomocą ostrza skalpela. Używając pincety z bardzo cienką końcówką, utwórz kieszonkę pod torebką nerki myszy biorcy i wprowadź do niej do 4 płatów grasicy.
- Włóż nerkę z powrotem na miejsce, zaszyj jamę otrzewną jednym lub dwoma szwami, a następnie zamknij skórę myszy, stosując tę samą metodę szycia. Alternatywnie można zastosować klej chirurgiczny.
- Bezpośrednio po zakończeniu operacji wstrzyknij podskórnie lek przeciwbólowy (Butorfanol w dawce 5 mg/kg), aby uniknąć bólu zwierzęcia, i utrzymuj zwierzęta na podgrzewaczce, aż zaczną budzić się z narkozy. Myszy są trzymane indywidualnie przez pierwsze 3 dni po transplantacji, aby zapobiec usuwaniu szwów przez współlokatorów z klatki. Usuń szwy po 1 tygodniu.
- Myszy Nude nie posiadają limfocytów T. Można zatem ocenić przyjęcie przeszczepu grasicy, monitorując odsetek limfocytów T CD4+ lub CD8+ we krwi. Raz w tygodniu, 2 tygodnie po transplantacji grasicy, pobierz krew od zwierząt i zabarw ją przeciwciałami monoklonalnymi (MAbs) anty-CD4 i anty-CD8. Gdy stosunek CD4:CD8 wynosi około 2:1, przeszczepiona grasica jest w pełni funkcjonalna (Rycina 1).
2. Pozyskiwanie obrazów intravitalnych
Przygotuj wcześniej wszystkie niezbędne materiały i odstaw je na bok.
- Zanurzyć zwierzęta w narkozie za pomocą ketaminy/ksylazyny (dawki takie same jak opisane w punkcie 1.5) i umieścić je na macie grzewczej o temperaturze 37°C. Wstrzyknąć dożylnie 100 μl dekstranu znakowanego izotiocyjanianem rodaminy B (20 mg/ml w PBS), aby umożliwić późniejszą wizualizację przepływu krwi.
- Odsłonić nerkę zawierającą przeszczepiony grasiczkę zgodnie z protokołem opisanym wcześniej w punkcie 1.6.
- Aby zapobiec powrotowi nerki na jej pierwotną pozycję, zszyć boczne brzegi nacięcia skóry.
- Umieścić kawałek nasączonej PBS waty na górnej części narządu, aby utrzymać go w wilgoci.
- Położyć matę grzewczą na podstawie uchwytu dla zwierząt (Rycina 2A).
- Umieścić zwierzę na macie grzewczej w uchwycie, narządem do góry (Rycina 2B).
- Unieruchomić narząd z obu stron za pomocą zacisku wykonanego z cienkiej folii aluminiowej (Rycina 2C).
- Zamknąć uchwyt dla zwierząt i umieścić górną sondę grzewczą jak najbliżej tkanki (Rycina 2D). Sonda ta stale mierzy temperaturę narządu i przesyła te informacje do grzałki w celu regulacji prądu elektrycznego, utrzymując temperaturę na poziomie 37°C.
- Usunąć nasączoną PBS watę i nałożyć na preparat niskotopliwą agarozę (2% w PBS) o temperaturze 30°C.
- Przykryć cały preparat górną grzałką (Rycina 2E). W otworze grzałki znajduje się szkiełko podstawowe izolujące agarozę od obiektywu (Rycina 2F). Monitorować narkozę myszy i co 40 min podawać połowę dawki wspomagającej. Po pozyskaniu obrazów uśmiercić zwierzę za pomocą CO2.
Uwaga: zdjęcia klipsa z folii aluminiowej i górnego grzejnika przedstawiono na rysunku 3.
3. Akwizycja obrazowania dwufotonowego
Użyliśmy pionowego mikroskopu dwufotonowego „Prairie Ultima X-Y”. Nasz system jest wyposażony w laser Ti:Szafir, cztery górne PMT do jednoczesnej akwizycji z maksymalnie 4 kanałów oraz obiektyw imersyjny wodny 20x.
- Włącz laser ti:szafirowy oraz cały system mikroskopowy.
- Zamontuj lustra dichroiczne i zestawy filtrów zgodnie z pożądanymi długościami fal. W naszym przypadku zastosowano uchwyt Olympus-BX2 Chroma zawierający lustro dichroiczne 565 nm, jeden filtr 525/50 nm (dla sygnału Foxp3-GFP) oraz jeden filtr 595/50 nm (dla sygnału Dextran-Rhodamine-B wewnątrz naczyń krwionośnych). Wykorzystano zakres długości fal lasera od 880 do 900 nm.
- Zamocuj uchwyt dla zwierzęcia w mikroskopie, podłącz i włącz wszystkie grzałki, wlej wodę do otworu górnej grzałki, ostrożnie zanurz obiektyw w wodzie i ustaw ostrość na naczynie lub komórki GFP-Tregs.
- Korzystając z zewnętrznego sterowania mikroskopem w osiach x,y,z, szybko przeszukaj tkankę w celu zlokalizowania obszaru zainteresowania.
- Dostrój wzmocnienie (gain) w PMT, aby zoptymalizować separację kolorów i zminimalizować moc lasera niezbędną do uzyskania wystarczającego sygnału powyżej tła. Staraj się używać minimalnej mocy lasera, aby uniknąć fotouszkodzeń tkanki.
- Po zlokalizowaniu obszarów zainteresowania rozpocznij obrazowanie time-lapse. W naszym przypadku typowy protokół akwizycji 5D (x, y, z, t oraz kolor) polega na pozyskiwaniu sekwencyjnych obrazów objętości tkanki o głębokości 50 μm, podzielonej na kroki z o wielkości 4.0 μm, przy wymiarach x i y wynoszących 140 μm każdy. Pozyskanie każdej objętości trwa około 30 sekund. Zatem 60 akwizycji zajmie około 30 min obrazowania.
- Prześlij dane na serwer instytucjonalny i użyj oprogramowania ImageJ, Imaris lub Volocity do wielowymiarowego renderowania i śledzenia komórek.
4. Reprezentatywne wyniki
Rycina 1. Akceptacja i funkcja grasicy zarodkowej. Po regeneracji szpiku kostnego (BM), grasice zarodkowe przeszczepiono zwierzętom z odtworzonym szpikiem kostnym; dwa tygodnie po transplantacji grasicy myszy te poddawano pobraniu krwi raz w tygodniu w celu monitorowania odsetka podtypów limfocytów T poprzez barwienie przeciwciałami monoklonalnymi (MAbs) anty-CD4 lub anty-CD8. Uznaliśmy, że grasica została pomyślnie zaakceptowana u zwierząt, u których stosunek CD4:CD8 wynosił około 1,5-2,0:1 (A). Aby potwierdzić jej funkcjonalność, uśmiercono część zwierząt z przeszczepioną grasicą i porównano odsetek różnych subpopulacji tymocytów z myszami typu dzikiego (WT) (B). Odsetki subpopulacji podwójnie ujemnych (DN; tymocyty CD4-CD8-) (poprzez barwienie przeciwciałami MAbs anty-CD25 i anty-CD44), podwójnie dodatnich (DP; tymocyty CD4+CD8+) oraz pojedynczo dodatnich (SP) tymocytów CD4+ lub CD8+ były podobne u tych zwierząt.
Rysunek 2. Montaż uchwytu dla zwierzęcia. Po głębokim znieczuleniu zwierzę umieszcza się na podkładce grzejnej, uprzednio zamontowanej na stole uchwytu dla zwierzęcia (A). Nerka zawierająca przeszczepioną grasicę jest skierowana ku górze (B). Zacisk z folii aluminiowej delikatnie obejmuje całą nerkę (C), aby utrzymać ją w miejscu. Wstawka na Rys. 1C szczegółowo przedstawia zacisk. Następnie montuje się górną część uchwytu dla zwierzęcia (D). Nasączoną PBS watę usuwa się z powierzchni narządu, zastępując ją ciepłą agarozą niskotopliwą, a następnie dodaje górny grzejnik (E). Na koniec cały zestaw przenosi się pod mikroskop, który tutaj jest reprezentowany przez obiektyw (F).
Rycina 3. Szczegóły elementów uchwytu. Na zdjęciach przedstawiono zacisk z folii aluminiowej (A) utrzymujący nerkę (B). Zaznaczono również obszar, w którym znajduje się przeszczepiony grasica. Wskazuje on w przybliżeniu miejsce nacięcia torebki grasicy i wykonania kieszonki do umieszczenia grasicy embrionalnej. Górne szkiełko kryjące grzałki (C) zostało przymocowane silikonem do jego dolnej części (D).
Film 1. Obrazowanie intravitalne tymocytów Foxp3-GFP+ wewnątrz grasicy, w której podczas całego procesu utrzymywano fizjologiczne poziomy natlenienia i temperatury (37°C). Zwróć uwagę na przepływ krwi i ruch Tregs. Prędkości te można zmierzyć i porównać z opublikowanymi danymi. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.
Film 2. Obrazowanie intravitalne komórek Treg wewnątrz grasicy; obrazy zostały zarejestrowane w temperaturze 30°C. Zwróć uwagę na brak ruchu oraz okrągły kształt komórek pomimo utrzymanego przepływu krwi. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.
Dyskusja
W niniejszej pracy przedstawiliśmy procedury obrazowania dwufotonowego tymocytów wewnątrz żywego zwierzęcia. Opisaliśmy również parametry, które należy starannie kontrolować, takie jak zachowanie przepływu krwi oraz utrzymanie temperatury organu podczas procedur obrazowania. Niemniej jednak, mimo starannych wysiłków w celu stabilizacji organu, mogą wystąpić artefakty ruchowe, takie jak „dryfowanie organu”. Korekcja obrazu a posteriori może zostać przeprowadzona za pomocą algorytmów opracowanych specjalnie w tym celu. Dalsza analiza obrazów może również stać się podstawą do opracowania nowych protokołów dążących do zminimalizowania błędów.
Gruczoł grasicy jest organem, w którym powstają wszystkie limfocyty T, dlatego jest to miejsce, na którym immunolodzy zainteresowani zrozumieniem generowania limfocytów T γδ, CD4 lub CD8 skupiają swoją uwagę. Większość badań dotyczących limfocytów T opiera się na różnicach w liczbie i/lub stabilności tych komórek po różnych manipulacjach in vitro/in vivo. Jednak dopiero dzięki wizualizacji in vivo mogliśmy zaobserwować interakcje między komórkami układu odpornościowego zaangażowanymi w utrzymanie homeostazy3-7. Zatem obserwacja tymocytów in vivo jest prawdopodobnie jedną z najważniejszych brakujących informacji pozwalających lepiej zrozumieć biologię limfocytów T. Intrawitalna TPM dostarcza szczegółowego obrazu ruchów i interakcji limfocytów T, a w niniejszej pracy demonstrujemy, w jaki sposób można ją wykorzystać do szczegółowych badań tymocytów. Każda technika ma jednak swoje ograniczenia. Choć obrazowanie intrawitalne jest najdokładniejszym systemem odzwierciedlającym zachowanie komórek wewnątrz organizmu, prawdą jest również, że pozyskiwanie obrazów z eksplantowanych organów jest mniej pracochłonne i było wykorzystywane do gromadzenia istotnych informacji o układzie odpornościowym8,9. Ponadto nie można zaprzeczyć, że metody obrazowania intrawitalnego wymagają zabiegu chirurgicznego w celu odsłonięcia tkanek i naczyń krwionośnych u znieczulonych zwierząt, co samo w sobie może spowodować zmianę fizjologii całego organu10. Niemniej jednak istnieją metody nieinwazyjne, które eliminują artefakty spowodowane procedurą chirurgiczną11, a opracowywane są nowe metody, które pozwalają na lepsze wcześniejsze przygotowanie zwierząt12. W związku z tym nowe procedury i narzędzia chirurgiczne zminimalizują lub ominą obecne ograniczenia obrazowania intrawitalnego, stając się coraz bardziej dostępne dla społeczności naukowej.
Wykazaliśmy, że opisana przez nas metoda jest wykonalna i pozwala na rejestrację wszystkich zastosowanych manipulacji systemowych in vivo, takich jak podawanie leków. W związku z tym sugerujemy stosowanie tej metody wraz z dostępnymi już technikami ex vivo w celu uzupełnienia i wzmocnienia dalszych badań dotyczących rozwoju tymocytów.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
Pragniemy podziękować dr. Davidowi Olivieri za krytyczną recenzję niniejszego manuskryptu, dr. Nuno Moreno za pomoc logistyczną przy budowie uchwytu dla zwierząt oraz mat grzewczych, a także dr. Vijayowi K. Kuchroo za uprzejme przekazanie myszy Foxp3-KIgfp/gfp. Praca ta jest finansowana przez „Fundação para Ciência e Tecnologia” (FCT, Portugalia), grant nr PTDC/EBB-BIO/115514/2009.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Dekstran znakowany rodaminą B izotiocyjanianem | Sigma-Aldrich | R9379 | przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 20 mg/ml | |
| Mikroskop dwufotonowy | Prairie Technologies Inc. | Prairie Ultima X-Y | ||
| Laser Ti:Szafir | Coherent, Inc. | Chameleon Ultra Family | ||
| Obiektyw imersyjny 20x/1.00 NA | Olympus Inc. | XLUMPLFLN 20XW | ||
| Uchwyt (filtry/lustro dichroiczne) | Chroma Technology Corp. | 91018 BX2 (U-MF2) | ||
| Filtr 525 nm/50 | Chroma Technology Corp. | ET525/50m | ||
| Filtr 595 nm/50 | Chroma Technology Corp. | ET595/50m | ||
| Lustro dichroiczne 565 nm | Chroma Technology Corp. | 565dcxr | ||
| Oprogramowanie Imaris | Bitplane AG Inc. | Imaris | ||
| Volocity | PerkinElmer Inc. | Volocity | ||
| ImageJ | NIH, USA | ImageJ |
Bibliografia
- Bettelli, E. Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells. Nature. 441, 235-238 (2006).
- Ramsdell, F., Zúñiga-Pflücker, J. C., Takahama, Y. In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture. Current protocols in immunology. Coligan, J. E. , (2006).
- Tadokoro, C. E. Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo. J. Exp. Med. 203, 505-511 (2006).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
- Miller, M. J. Imaging the single cell dynamics of CD4+ T cell activation by dendritic cells in lymph nodes. J. Exp. Med. 200, 847-856 (2004).
- Shakhar, G. Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo. Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).
- Hugues, S. Distinct T cell dynamics in lymph nodes during the induction of tolerance and immunity. 5, 1235-1242 (2004).
- Tang, Q. Visualizing regulatory T cell control of autoimmune responses in nonobese diabetic mice. Nat. Immunol. 7, 83-92 (2006).
- Le Borgne, M. The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla. Nature immunology. 10, 823-830 (2009).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvascular research. 5, 384-394 (1973).
- Wang, B., Zinselmeyer, B. H., McDole, J. R., Gieselman, P. A., Miller, M. J. Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo. J. Vis. Exp. (46), e2062-e2062 (2010).
- Barretto, R. P. J. Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy. Nature medicine. 17, 223-228 (2011).
Przedruki i uprawnienia
