Wizualizacja sygnalizacji naczyniowej Ca2+ wyzwalanej przez ROS pochodzące z parafiny

Podsumowanie

Opisana jest skuteczna metoda uzyskiwania wglądu w wizualizację pochodzącej z pasożytnii indukcji ROS śródbłonkowej sygnalizacji Ca2+. Metoda ta wykorzystuje pomiar mobilizacji Ca2 + wywołanej przez ROS wyzwalanej przez parakrynną w komórkach śródbłonka naczyń krwionośnych w modelu kohodowli.

Streszczenie

Stres oksydacyjny jest związany z wieloma stanami patologicznymi, w tym uszkodzeniem niedokrwiennym/reperfuzyjnym i sepsą. Pojęcie stresu oksydacyjnego odnosi się do nieprawidłowego tworzenia ROS (reaktywnych form tlenu), do których należą_O2^•-,_H2O2i rodniki hydroksylowe. Reaktywne formy tlenu wpływają na wiele procesów komórkowych, w tym transdukcję sygnału, proliferację komórek i śmierć komórek^1-6. ROS mogą potencjalnie bezpośrednio uszkadzać komórki naczyniowe i narządowe oraz mogą inicjować wtórne reakcje chemiczne i zmiany genetyczne, które ostatecznie prowadzą do amplifikacji początkowego uszkodzenia tkanek za pośrednictwem ROS. Kluczowym elementem kaskady amplifikacji, która pogłębia nieodwracalne uszkodzenia tkanek, jest rekrutacja i aktywacja krążących komórek zapalnych. Podczas stanu zapalnego komórki zapalne wytwarzają cytokiny, takie jak czynnik martwicy nowotworu-α (TNFα) i IL-1, które aktywują komórki śródbłonka (EC) i komórki nabłonkowe oraz dodatkowo zwiększają odpowiedź zapalną⁷. Dysfunkcja śródbłonka naczyń krwionośnych jest ustaloną cechą ostrego stanu zapalnego. Makrofagi przyczyniają się do dysfunkcji śródbłonka podczas stanu zapalnego poprzez mechanizmy, które pozostają niejasne. Aktywacja makrofagów powoduje zewnątrzkomórkowe uwalnianie _O2^•- i różnych cytokin prozapalnych, co wyzwala sygnalizację patologiczną w sąsiednich komórkach 8. Oksydazy NADPH są głównym i podstawowym źródłem ROS w większości typów komórek. Ostatnio wykazaliśmy my i inni^9,10, że ROS wytwarzane przez oksydazy NADPH indukują mitochondrialną produkcję ROS podczas wielu stanów patofizjologicznych. Dlatego pomiar produkcji mitochondrialnej ROS jest równie ważny oprócz pomiaru cytozolowych ROS. Makrofagi wytwarzają ROS przez enzym flawoproteinowy oksydazę NADPH, który odgrywa główną rolę w zapaleniu. Po aktywacji fagocytarna oksydaza NADPH wytwarza obfite ilości O₂^•-, które są ważne w mechanizmie obronnym gospodarza^11,12. Chociaż_O2^•- pochodzenia parakrynnego odgrywa ważną rolę w patogenezie chorób naczyniowych, wizualizacja sygnalizacji wewnątrzkomórkowej indukowanej przez ROM parakrynny, w tym mobilizacji Ca^{2 + ,} jest nadal hipotezą. Opracowaliśmy model, w którym aktywowane makrofagi są wykorzystywane jako źródło_O2^•- do przekazywania sygnału do sąsiednich komórek śródbłonka. Korzystając z tego modelu, pokazujemy, że O₂^•- pochodzące z makrofagów prowadzi do sygnalizacji wapniowej w sąsiednich komórkach śródbłonka.

Protokół

Reaktywne formy tlenu mogą być mierzone w żywych komórkach za pomocą barwników wrażliwych na utlenianie (1 i 2) lub za pomocą czujników plazmidowych (3 i 4) za pomocą mikroskopii konfokalnej.

1. Wizualizacja cytozolowego ROS w komórkach J774

1. Hoduj makrofagi pochodzące z monocytów myszy J774.1 (10,⁶ komórek/ml) na szklanych dnach 35-milimetrowych szalkach (aparat Harvarda) przez 48 godzin.
2. Komórki prowokacyjne z agonistami TLR (2 μg/ml, agonista kwasu lipo-teichojowego-TLR2; 10 μg/ml, agonista Poly (I:C)-TLR3; 1 μg/ml agonista LPS-TLR4) przez 6 godzin w temperaturze 37°C.
   Uwaga: Makrofagi traktowane w podobnych warunkach wykorzystano do mobilizacji Ca²⁺ w modelu kohodowli.
3. Dodać wrażliwy na utlenianie barwnik H₂DCF-DA (Invitrogen), aby uzyskać końcowe stężenie 10 μM w ECM (pożywka zewnątrzkomórkowa: 121 mM NaCl, 5 mM NaHCO₃, 10 mM Na-HEPES, 4,7 mM KCl, 1,2 mM KH₂PO₄, 1,2 mM MgSO₄, 2 mM CaCl₂, 10 mM glukozy i 2,0% dstronu, pH 7,4; wszystkie otrzymane z Sigma) zawierającej 2% BSA do szalek i inkubacji komórek przez 20 minut przed wizualizacją w warunkach konfokalnych mikroskopia.
4. Po załadowaniu barwnika wizualizuj komórki umieszczone na stoliku o kontrolowanej temperaturze odpowiedniego systemu obrazowania. Używamy systemu obrazowania konfokalnego Carl Zeiss LSM 510 Meta sprzężonego ze źródłem lasera jonowego argon o wzbudzeniu 488 nm do fluorescencji DCF przy użyciu 40-krotnego obiektywu olejowego¹³ (rys. 1A i D).
5. Analizuj obrazy za pomocą oprogramowania ImageJ (1.44), bezpłatnego oprogramowania National Institutes of Health (Rasband, W.S., ImageJ, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997-2009).

2. Wizualizacja mROS w komórkach J774

1. Hoduj makrofagi pochodzące z monocytów myszy J774.1 (10,⁶ komórek/ml) na szklanych dnach 35-milimetrowych szalkach (aparat Harvarda) przez 48 godzin.
2. Rzuć wyzwanie komórkom za pomocą ligandów TLR, aby indukować produkcję mROS (2 μg / ml, kwas lipotejchojowy-TLR2; 10 μg / ml, Poly (I:C)-TLR3; 1 μg / ml LPS-TLR4) przez 6 godzin w temperaturze 37 ° C.
3. Dodać mitochondrialny wskaźnik ponadtlenkowy MitoSOX Red (Invitrogen), aby uzyskać końcowe stężenie 5 μM w ECM zawierającym 2% BSA do szalek i inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze 37°C, aby umożliwić ładowanie MitoSOX Red.
4. Po załadowaniu barwnikiem wizualizuj komórki na stoliku o kontrolowanej temperaturze systemu obrazowania konfokalnego Carl Zeiss LSM 510 Meta sprzężonego ze źródłem lasera jonowego argonu przy wzbudzeniu 561 nm dla czerwonej fluorescencji MitoSOX przy użyciu 40-krotnego obiektywu olejowego (ryc. 1B i E).
5. W przypadku eksperymentów kontrolnych, po załadowaniu barwnikiem dodać PBS lub DMSO (kontrola ujemna) lub 2μM antymycynę A (jako mitochondrialny generator ponadtlenków-kontrola pozytywna) do komórek przed zobrazowaniem próbki, jak opisano w 2.4 (ryc. 1C).
6. Przeanalizuj obrazy za pomocą oprogramowania ImageJ (1.44).

3. Wizualizacja cytozolowych ROS w stabilnych HyPer-cyto MPMVECs

1. Używamy pHyPer-cyto (Evrogen), ssaczego wektora ekspresji kodującego czujnik fluorescencyjny HyPer, który lokalizuje się w cytoplazmie i specyficznie wykrywa submikromolowe stężenie_H2O2,¹⁴.
2. Transfekcja mysich komórek mikronaczyniowych płuc śródbłonka (MPMVEC) z wektorem pHyPer-cyto przy użyciu odczynników do elektroporacji lub transfekcji. Używamy ogniw 10 x 10⁶ i transfekujemy 10 μg pHyPer-cyto za pomocą elektroporacji za pomocą systemu elektroporatora BioRad Gene pulser (250 V; 500 μF). Hodowla MPMVEC w pożywce DMEM uzupełniona 10% FBS, aminokwasami endogennymi, suplementem wzrostu śródbłonka i antybiotykami.
   Uwaga: Po transfekcji płytki komórek o niskiej gęstości, aby ułatwić wzrost kolonii.
3. Zastąp pożywkę kompletną pożywką z dodatkiem 500 μg/ml G418 48 godzin po transfekcji. Badanie przesiewowe dla klonów, które mają najwyższy odsetek komórek HyPer dodatnich i pasażacyjnych klonów HyPer dodatnich w celu zwiększenia liczby komórek HyPer dodatnich (ryc. 2).
   Uwaga: Używamy seryjnego rozcieńczania komórek do selekcji klonalnej pojedynczych komórek i badania przesiewowego stabilnych komórek o wysokiej ekspresji HyPer.
4. Stabilne wzrosty HyPer-cyto MPMVEC na 0,2% żelatynowych szkiełkach nakrywkowych (80% konfluencji). Następnego dnia komórki prowokacyjne z ligandami TLR (2 μg / ml, kwas lipotejchojowy-TLR2; 10 μg / ml, Poly (I:C)-TLR3; 1 μg / ml LPS-TLR4) przez 6 godzin w temperaturze 37°C. Nieleczone komórki służą jako kontrola.
5. Po zabiegu zamontować szkiełka nakrywkowe w komorze komórkowej Attofluor (Invitrogen). Dodaj 1 ml wstępnie podgrzanego zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS) do komory i umieść komorę na stoliku o kontrolowanej temperaturze systemu obrazowania konfokalnego Carl Zeiss LSM 510 Meta. Wizualizacja i obraz zmiany fluorescencji przy wzbudzeniu 488 nm za pomocą 40-krotnego obiektywu olejowego (rys. 3A i D).
6. Analizować obrazy za pomocą oprogramowania ImageJ (1.44) (patrz rozdział 6).

4. Wizualizacja mitochondrialnych ROS w stabilnych HyPer-dMito MPMVEC

1. Używamy pHyPer-dMito (Evrogen), ssaczego wektora ekspresji kodującego HyPer ukierunkowany na mitochondria, który lokalizuje się w mitochondriach i specyficznie wyczuwa submikromolowe stężenie _H2O2.
2. Transfekować MPMVEC za pomocą pHyPer-dMito i generować stabilne MPMVEC HyPer-dMito zgodnie z krokami opisanymi w sekcji 3.2-3.3.
3. Stabilne szkiełka nakrywkowe HyPer-dMito MPMVEC są stabilne na 0,2% żelatynowych szkiełkach nakrywkowych (80% konfluencji).
4. Komórki prowokacyjne następnego dnia z ligandami TLR (2 μg/ml, kwas lipotejchoinowy-TLR2; 10 μg/ml, Poly (I:C)-TLR3; 1 μg/ml LPS-TLR4) przez 6 godzin w temperaturze 37°C. Nieleczone komórki służą jako kontrola ujemna. Dodaj 2 μM antymycynę A (mitochondrialny induktor ponadtlenkowy - kontrola pozytywna) przed wizualizacją próbki.
5. Po zabiegu zamontować szkiełka nakrywkowe w komorze komórkowej Attofluor (Invitrogen). Dodaj 1 ml wstępnie podgrzanego zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS) do komory i umieść komorę na stoliku o kontrolowanej temperaturze systemu obrazowania konfokalnego Carl Zeiss LSM 510 Meta. Wizualizacja i obraz zmiany fluorescencji przy wzbudzeniu 488 nm za pomocą obiektywu olejowego 40x (rys. 3B, C i E).
6. Analizować obrazy za pomocą oprogramowania ImageJ (1.44) (patrz rozdział 6).

5. Model kokulturowy do wizualizacji ROS pochodzenia parakrynnego wyzwalał sygnalizację Ca²⁺ w komórkach śródbłonka

Do wizualizacji i pomiaru zmian [Ca²⁺]i używamy barwnika fluorescencyjnego Ca²⁺ fluo-4 AM (Invitrogen).

1. Hoduj MPMVEC na 0,2% pokrytych żelatyną szklanych szkiełkach nakrywkowych o średnicy 25 mm (80% konfluencji).
2. Inkubować komórki wyhodowane na szkiełkach nakrywkowych w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ECM zawierającym 2% BSA i 0,003% kwasu pluronowego o końcowym stężeniu 5 μM fluo-4 AM (Invitrogen), aby umożliwić obciążenie fluo-4 AM. Po załadowaniu umyj komórki eksperymentalnym roztworem do obrazowania (ECM zawierającym 0,25% BSA) zawierającym sulfinpirazon, aby zminimalizować utratę barwnika.
3. Po załadowaniu fluo-4 zamontuj szkiełka nakrywkowe na komorze celi Attofluor (Invitrogen). Dodaj 800 μl wstępnie podgrzanego eksperymentalnego roztworu do obrazowania do komory i umieść go na stoliku z kontrolowaną temperaturą systemu obrazowania konfokalnego Carl Zeiss LSM 510 Meta.
4. W oddzielnej etykiecie probówki nieaktywowane lub aktywowane makrofagi wyizolowane od myszy^phox-/- typu dzikiego lub gp91 (traktowanych LPS przez 6 godzin) z czerwonym CMTPX do śledzenia komórek (500 ng / ml) (Invitrogen) w ECM zawierającym 2% BSA i 0,003% kwasu pluronowego. Umyj i ponownie zawieś komórki za pomocą 200 μl eksperymentalnego roztworu do obrazowania.
5. Dodaj oznakowane makrofagi do MPMVEC załadowanych fluo-4 AM w zespole komory.
6. Rejestruj zieloną i czerwoną fluorescencję co 3 sekundy przez 10-20 minut za pomocą systemu obrazowania konfokalnego Carl Zeiss LSM510 Meta ze źródłem lasera jonowego argonu ze wzbudzeniem przy 488 i 561 nm odpowiednio dla fluo-4 AM i czerwonej fluorescencji trackera komórek (rys. 4 AC).
   Uwaga: Alternatywnie, linia komórkowa J774.1 może być użyta do wywołania mobilizacji MPMVECs Ca²⁺.
7. Analizować zmiany intensywności fluorescencji fluo-4 za pomocą oprogramowania ImageJ (1.44) (patrz punkt 6).

6. Analiza danych za pomocą oprogramowania ImageJ

Prześlij obrazy uzyskane z systemu konfokalnego jako plik w formacie .lsm do analizy danych. Oprogramowanie ZEN 2009 i ZEN 2010 dostarczane z mikroskopem konfokalnym LSM 510 Meta lub wielofotonowym mikroskopem konfokalnym LSM 710 zapisuje pliki w formacie .lsm. Zalecamy używanie tych natywnych plików .lsm do analizy obrazu, ponieważ zachowana jest oryginalna jakość. Ten format pliku można otworzyć bezpośrednio w programie do analizy obrazu Image J. Poniższe kroki zawierają przykładową analizę ilościową pojedynczego obrazu. Do tej analizy danych nie są wymagane żadne dodatkowe wtyczki.

1. Otwórz plik .lsm lub . Plik TIFF w programie Image J za pomocą FILE>OPEN
2. Kliknij zakładkę KANAŁY IMAGE>COLOR>SPLIT i podziel kanały na kanały zielony i DIC. Użyj obrazu z zielonego kanału do późniejszej analizy.
3. Kliknij dwukrotnie i wybierz zakładkę "Wybór pędzla eliptycznego" i ustaw wartość piksela na 20.
4. W przypadku obrazów Hyper-cyto kliknij pojedynczą komórkę, aby zdefiniować okrągły obszar pomiaru. Następnie naciśnij "M", aby zmierzyć intensywność wybranego obszaru. Wartości są zachowywane w nowym oknie wyników.
5. Następnie, przytrzymując "Shift", kliknij inną komórkę, aby wybrać inny obszar, a następnie naciśnij "M". Intensywność jest rejestrowana w oknie wyników. Powtórz kroki 4-5 na 50 różnych komórkach.
6. W przypadku obrazów Hyper d-mito ustaw wartość piksela na 10 w polu Pędzel eliptyczny. Region zainteresowania (ROI) musi być ręcznie śledzony, w tym mitochondria poszczególnych komórek.
7. Odręcznie obrysuj obszar wokół mitochondriów, a następnie naciśnij "M". Powtórz kroki 6-7 na 50 różnych komórkach.
8. Skopiuj średnie wartości z okna wyników i wklej je w arkuszu programu Excel lub dowolnym oprogramowaniu, aby wykreślić wyniki. Używamy SigmaPlot lub Graphpad PRISM do wykreślenia danych jako wykresu.

7. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1 pokazuje cytozolową i mitochondrialną produkcję ROS po prowokacji z ligandami TLR. Reprezentatywne obrazy konfokalne pokazują wzrost fluorescencji DCF (cytozolowej) i MitoSOX Red (mitochondria) po 6 godzinach stymulacji. Zmiany fluorescencji były znormalizowane i wyrażone jako zmiana fałdowania.

Rysunek 2 pokazuje generowanie stabilnych komórek śródbłonka HyPer-cyto i HyPer-dMito. Komórki śródbłonka myszy transfekowano konstruktami plazmidowymi pHyPer-cyto lub pHyPer-dMito za pomocą elektroporacji. Komórki o stabilnej ekspresji plazmidów wybierano za pomocą G418 przez dwa tygodnie. Po selekcji rozcieńczone komórki wysiewano na 96 płytkach dołkowych. Poszczególne kolonie zostały odizolowane i zobrazowane w celu uzyskania jednorodnej ekspresji.

Rysunek 3 pokazuje pomiar śródbłonkowych, cytozolowych i mitochondrialnych poziomów_H2O2. Reprezentatywne obrazy konfokalne wykazują wzrost fluorescencji HyPer-cyto (cytozolowej) i HyPer-dMito (mitochondriów) po 6 godzinach stymulacji. Zmiany intensywności fluorescencji zostały znormalizowane i wyrażone jako zmiana fałdowania.

Rysunek 4 pokazuje ocenę indukowanej przez makrofagi mobilizacji cytozolowego cytozolu Ca²⁺ przez makrofagi. Makrofagi stymulowane LPS dodano do komórek śródbłonka mikronaczyniowego płuc (PMVEC), które wcześniej były obciążone wewnątrzkomórkowym barwnikiem wskaźnikowym Ca^{2 +} ([Ca^{2 +}] i) Fluo-4. Zastosowanie makrofagów aktywowanych LPS typu dzikiego wywołało wzrost [Ca^{2 +}] i PMVEC, który został osłabiony przez nokaut funkcjonalnej oksydazy NADPH (gp91^phox-/-).

Rysunek 1. Wizualizacja generowanych przez makrofagi komórkowych ROS i mitochondrialnego ponadtlenku. Komórki J774.1 prowokowano ligandami TLR2, 3 i 4. (2 μg/ml, kwas lipotejchoinowy-TLR2; 10 μg/ml, Poly (I:C)-TLR3; 1 μg/ml LPS-TLR4) przez 6 h w temperaturze 37°C. Po leczeniu komórki załadowano (A) komórkowym wskaźnikiem ROS (_H2DCF-DA; zielona fluorescencja) lub (B) mitochondrialnym wskaźnikiem ponadtlenkowym (MitoSOX Red; czerwona fluorescencja). (C) Antymycynę A zastosowano jako kontrolę pozytywną do produkcji mitochondrialnych ROS. Zmiany intensywności fluorescencji oceniano za pomocą mikroskopii konfokalnej. (D) i (E) Kwantyfikacja średniej zmiany fluorescencji.

Rysunek 2. Schematyczne przedstawienie generowania stabilnej ekspresji cytozolowych i mitochondrialnych wskaźników ROS komórek śródbłonka.

Rysunek 3. Wizualizacja śródbłonkowych, cytozolowych i mitochondrialnych poziomów_H2O2. MPMVEC stabilnie eksprymujące (A) HyPer-cyto lub (B) HyPer-dMito prowokowano ligandami TLR2, 3 i 4 (2 μg/ml, kwas lipotejchoinowy-TLR2; 10 μg/ml, Poly (I:C)-TLR3; 1 μg/ml LPS-TLR4) przez 6 godzin w temperaturze 37°C. (C) Antymycynę A zastosowano jako kontrolę pozytywną do produkcji mitochondrialnej ROS. Po leczeniu zmiany intensywności fluorescencji oceniano za pomocą mikroskopii konfokalnej. (D) i (E) Kwantyfikacja średniej zmiany fluorescencji.

Rysunek 4. ROS pochodzące z makrofagów wywołują upośledzoną mobilizację Ca²⁺ komórek śródbłonka. (A) Schematyczne przedstawienie badania modelu kohodowli komórek śródbłonka/makrofagów. (B) Świeżo wyizolowane mysie makrofagi zarówno od myszy bez WT, jak i gp91phox (The Jackson Laboratory) aktywowano za pomocą 1 μg / ml LPS przez 6 godzin. Makrofagi oznaczono kolorem czerwonym (czerwonym) i dodano do PMVEC załadowanych Fluo-4 (zielony) w celu oceny sygnalizacji parakrynnej O₂^•-. (C) Makrofagi aktywowane LPS wyizolowane z myszy WT wywołały dużą i szybką mobilizację Ca^{2 +} w PMVEC w porównaniu z makrofagami z myszy bez gp91phox. Walidacja aktywacji makrofagów została zademonstrowana wcześniej.

Dyskusja

Opisana tutaj metoda umożliwia szybki i ilościowy pomiar reaktywnych form tlenu w żywych komórkach przy użyciu barwników wrażliwych na utlenianie lub czujników plazmidowych. Agoniści receptorów TLR (Toll-like receptors) to związki, które stymulują komórki poprzez TLR obecne na powierzchni komórki i uruchamiają dalsze szlaki sygnałowe¹⁵. W naszym protokole użyliśmy trzech różnych agonistów TLR, a mianowicie: agonista kwasu lipo-teichojowego-TLR2; agonista Poly (I:C)-TLR3; Agonista LPS-TLR4, o którym doniesiono,...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Komora komórkowa Attofluor	Invitrogen	A7816
Antymycyna A	Sigma-Aldrich	A8674
DMEM pożywka o niskiej zawartości glukozy	Invitrogen	10567-014
Suplement czynnika wzrostu śródbłonka (EKGS)	Upstate, Millipore	02-102
Surowica bydlęca	płodu Invitrogen	12662011
G418	Invitrogen	10131-027
Żelatyna	Sigma-Aldrich	G1393
H2DCFDA	Invitrogen	D-399
LPS	Sigma-Aldrich	L4516
LTA	Sigma-Aldrich	L2515
MitoSOX Red	Invitrogen	M36008
Opti-MEM I Zredukowane Serum Medium	Invitrogen	51985091
Pen/Strep (10x)	Invitrogen	15140163
pHyPer-cyto	Evrogen	FP941
pHyPer-dMito	Evrogen	FP942
Poly(I:C)	Sigma-Aldrich	P0913
Prism software 5.0	GraphPad Software Inc.
Oprogramowanie SigmaPlot 11.0	Systat, Inc.
Trypsin-EDTA (10x)	Invitrogen	15400054
Kolby T-25	Corning	430639
Kolby T-75	Oprogramowanie BD Biosciences	353136
96-dołkowa płytka mikrodołkowa TC	BD Biosciences	353072
Zen 2009	Carl Zeiss, Inc.