Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Spektralne obrazowanie konfokalne nikotynowych receptorów znakowanych fluorescencyjnie u myszy typu knock-in z przewlekłą podażą nikotyny

13.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3516

⸱

10 lutego 2012

 , 
1Department of Biology, University of Victoria

W tym artykule

Podsumowanie

Opracowaliśmy nową technikę kwantyfikacji zmian receptorów nikotynowych acetylocholiny w obrębie regionów podkomórkowych specyficznych podtypów neuronów OUN, aby lepiej zrozumieć mechanizmy uzależnienia od nikotyny, wykorzystując kombinację podejść, w tym znakowanie receptora białkiem fluorescencyjnym metodą knock-in oraz spektralną mikroskopię konfokalną.

Streszczenie

Kanały jonowe sterowane ligandami w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) są zaangażowane w liczne schorzenia o poważnych konsekwencjach medycznych i społecznych. Na przykład uzależnienie od nikotyny poprzez palenie tytoniu jest główną przyczyną przedwczesnych zgonów na całym świecie (World Health Organization) i prawdopodobnie wynika ze zmiany rozmieszczenia kanałów jonowych w mózgu1. Przewlekła ekspozycja na nikotynę, zarówno u gryzoni, jak i u ludzi, prowadzi do zwiększenia liczby nikotynowych receptorów acetylocholiny (nAChRs) w tkance mózgowej1-3. Podobnie zmiany w glutaminergicznych kanałach GluN1 lub GluA1 są powiązane z wywoływaniem uczulenia na inne substancje uzależniające, takie jak kokaina, amfetaminy i opiaty4-6.

W konsekwencji zdolność do mapowania i ilościowego określania wzorców dystrybucji i ekspresji specyficznych kanałów jonowych jest kluczowa dla zrozumienia mechanizmów uzależnień. Badania nad efektami poszczególnych leków w specyficznych obszarach mózgu zostały rozwinięte dzięki wprowadzeniu takich technik, jak ligandy promieniotwórcze. Jednakże niska rozdzielczość przestrzenna wiązania ligandów promieniotwórczych uniemożliwia ilościowe określenie kanałów jonowych sterowanych ligandami w specyficznych podtypach neuronów.

Genetycznie kodowane reportery fluorescencyjne, takie jak zielone białko fluorescencyjne (GFP) i jego liczne warianty kolorystyczne, zrewolucjonizowały dziedzinę biologii7. Poprzez genetyczne znakowanie białka endogennego reporterem fluorescencyjnym możliwe jest wizualizowanie białek in vivo7-10. Jedną z zalet znakowania białek sondą fluorescencyjną jest wyeliminowanie konieczności stosowania przeciwciał, które wiążą się z problemami nieswoistości oraz dostępności do białka docelowego. Wykorzystaliśmy tę strategię do fluorescencyjnego znakowania nAChR, co umożliwiło badanie montażu receptorów przy użyciu transferu energii rezonansowej Förstera (FRET) w transfektowanych komórkach hodowlanych11. Niedawno zastosowaliśmy metodę knock-in w celu stworzenia myszy z podjednostkami α4 nAChR znakowanymi żółtym białkiem fluorescencyjnym (α4YFP), co pozwoliło na precyzyjną kwantyfikację receptorów ex vivo z rozdzielczością submikrometrową w neuronach OUN za pomocą spektralnej mikroskopii konfokalnej12. Celowana fluorescencyjna mutacja knock-in jest wprowadzana do locus endogennego i znajduje się pod kontrolą jego natywnego promotora, co zapewnia prawidłowe poziomy ekspresji i regulacji receptora w porównaniu do receptorów nieznakowanych u myszy typu dzikiego. Podejście knock-in można rozszerzyć na fluorescencyjne znakowanie innych kanałów jonowych, co stanowi potężną metodę wizualizacji i kwantyfikacji receptorów w OUN.

W niniejszej pracy opisujemy metodologię ilościowego określania zmian w ekspresji nAChR w konkretnych neuronach OUN po chronicznej ekspozycji na nikotynę. Nasze metody obejmują implantację mini-pomp osmotycznych, fiksację poprzez perfuzję wewnątrzsercową oraz obrazowanie i analizę fluorescencyjnie znakowanych podjednostek receptorów nikotynowych u myszy knock-in α4YFP (Ryc. 1). Zoptymalizowaliśmy technikę fiksacji, aby zminimalizować autofluorescencję utkanek mózgu. Szczegółowo opisujemy metodologię obrazowania z wykorzystaniem spektralnego mikroskopu konfokalnego w połączeniu z algorytmem liniowego rozdzielania widm (spectral unmixing) w celu odjęcia sygnału autofluorescencji, co pozwala na dokładne uzyskanie sygnału fluorescencji α4YFP. Na koniec przedstawiamy wyniki wywołanej chroniczną nikotyną upregulacji receptorów α4YFP w przyśrodkowej drodze perforującej hipokampa.

Protokół

1. Implantacja pompy

  1. Przed implantacją pomp należy napełnić i przygotować mini-pompy osmotyczne Alzet (Alzet, Model 2002, Cupertino, USA), uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Ten model mini-pompy osmotycznej podaje roztwór z prędkością 0,5 μl/hr przez 14 dni. Należy zapewnić warunki sterylne. Należy zważyć puste i napełnione pompy. Po zakończeniu eksperymentu (10 dni po implantacji) pozostały w pompie ciecz można usunąć za pomocą strzykawki z igłą i zważyć w celu obliczenia podanej objętości.
  2. Pompy z roztworem kontrolnym zawierają sól fizjologiczną (0,9% w/v, Teknova, S5819, Hollister, USA). Aby przygotować roztwór nikotyny, roztwór stokowy 1 M soli wodorowinianu nikotyny (-)-nikotyny (Sigma, kat# N5260) rozcieńcza się w soli fizjologicznej (0,9% w/v) i sterylizuje poprzez filtrację przez filtr strzykawkowy 0,22 μm. Wcześniej podawaliśmy nikotynę w dawkach 0,4 i 2 mg/kg/hr (obliczonych jako wolna zasada nikotyny) przez 10 dni.
  3. Przygotuj trzy kąpiele w soli fizjologicznej (trzy szalki Petriego wypełnione solą fizjologiczną o średnicy 10 cm). Po napełnieniu i zakapslowaniu pompy, należy ją dokładnie wypłukać w każdej kolejnej kąpieli w soli fizjologicznej, aby usunąć wszelkie ślady leku z zewnętrznej obudowy. Napełnione pompy należy zanurzyć w roztworze soli fizjologicznej do czasu operacji, przechowując pompy kontrolne i nikotynowe w oddzielnych pojemnikach z solą fizjologiczną.
  4. Aby wspomóc prawidłową rekonwalescencję i zmniejszyć ryzyko infekcji pooperacyjnej, należy przygotować czyste klatki do długoterminowego odpoczynku.
  5. Do krótkoterminnej rekonwalescencji bezpośrednio po operacji należy przygotować klatkę zawierającą matę grzewczą i lampę grzewczą.
  6. Aby zbadać chroniczne efekty nikotyny, w każdej grupie (kontrolnej lub nikotynowej) stosujemy od 5 do 6 myszy z knock-in α4YFP w stanie homozygotycznym (w wieku 2-3 miesięcy). Linia myszy knock-in α4YFP była krzyżowana wstecznie przez 10 pokoleń z linią myszy C57BL/6J. Dbamy o to, aby wiek i płeć wszystkich myszy w badaniu były takie same oraz aby wszystkie operacje przeprowadzono tego samego dnia w celu zminimalizowania zmienności. Aby zapobiec hipotermii myszy podczas i po operacji, należy wyposażyć stół operacyjny w matę grzewczą pokrytą sterylnym obłożeniem chirurgicznym.
  7. Indukujemy u myszy knock-in α4YFP znieczulenie tlenem 3 L/min i izofluranem 3%, a następnie utrzymujemy znieczulenie przy tlenie 2,5 L/min i izofluranie 1%. Preferujemy znieczulenie izofluranem, ponieważ po zakończeniu operacji izofluran szybko opuszcza organizm, a myszy odzyskują przytomność i mobilność w ciągu ok. 2 min. Należy natychmiast zastosować krople do oczu (Tear-Gel, Novartis), aby uniknąć uszkodzenia rogówki.
  8. Pompy są implantowane podskórnie poprzez nacięcie skóry na karku, a następnie pompa jest przesuwana w kierunku kaudalnym wzdłuż grzbietu. Miejsce na grzbiecie między przednimi kończynami należy przetrzeć 95% etanolem, aby przykleić futro. Skórę należy uchwycić pęsetą Graefe 0,8 mm (Fine Science Tools, 11050-10) i wykonać centralne nacięcie boczne o długości 1 cm za pomocą nożyczek irydowych (Fine Science Tools, 14060-10).
  9. Aby stworzyć przestrzeń podskórną dla pompy, należy wprowadzić standardowe nożyczki (Fine Science Tools, 14101-14) do nacięcia i ostrożnie przesunąć je w kierunku kaudalnym zwierzęcia.
  10. Używając pęsety Graefe 1,0 mm (Fine Science Tools, 11650-10), należy wyjąć pompę z soli fizjologicznej. Trzymając nacięcie otwartym za pomocą pęsety, należy wprowadzić pompę do nacięcia tak, aby kapsel pompy osmotycznej był skierowany w stronę kaudalną zwierzęcia, a następnie przesunąć pompę do końca kaudalnego.
  11. Ranę należy zamknąć, ściskając ją pęsetą 0,8 mm i nakładając odpowiednią ilość kleju Vetbond (3M, kat# 1469SB). Przytrzymać do czasu zamknięcia rany.
  12. Należy zdjąć zwierzę z maski z izofluranem, wstrzyknąć lek przeciwbólowy, meloksykam (0,1 mg/kg s.c.), i umieścić w klatce do krótkoterminnej rekonwalescencji do momentu odzyskania przytomności i mobilności. Następnie należy umieścić zwierzę w klatce do długoterminowej rekonwalescencji z dostępem do jedzenia i wody ad libitum.

2. Fixacja myszy z knock-inem α4YFP poprzez perfuzję wewnątrzsercową

  1. Przygotować roztwory na jeden dzień przed procedurą i przechowywać w temperaturze 4° C. Aby zminimalizować zmienność, wszystkie myszy zostaną poddane perfuzji tego samego dnia i z użyciem tej samej partii roztworów.
  2. Przeprowadzić utrwalanie perfuzyjne w dobrze wentylowanym pomieszczeniu. Przepłukać linię pompy perystaltycznej (Masterflex Easy Load, 7518-00; Masterflex Pump Controller, 60648) wodą ddH2O.
  3. Dodać ~0,0015g heparyny (Sigma, kat# H4784), która jest antykoagulantem, do 20 ml PBS pH 7,6 (Invitrogen, kat# 70011).
  4. Uśpić mysz knock-in α4YFP poprzez domięśniowy zastrzyk mieszaniny ketaminy (25 mg/kg, Wyeth Animal Health) i chlorowodorku medatomidyny (0,25 mg/kg, Pfizer) w mięsień tylnej kończyny, a następnie natychmiast umieścić zwierzę z powrotem w klatce domowej.
  5. Przymocować zwierzę do styropianowej pokrywy włożonej do metalnej tacki. Przetrzeć klatkę piersiową 95% etanolem. Chwycić skórę pęsetą Adsona (Fine Science Tools, 91106-12) i rozciąć jamę klatki piersiowej nożyczkami irydowymi. Zaciśnąć klatkę piersiową za pomocą ultraprecyzyjnego zacisku hemostatycznego (Fine Science Tools, 13021-12) i odsłonić serce.
  6. Rozpocząć pompowanie PBS z prędkością 4 ml/min i wprowadzić igłę motylkową 23G (Becton Dickinson, 367253) do lewej komory serca zwierzęcia. Natychmiast rozciąć prawy przedsionek, aby umożliwić odpływ krwi i perfuzatu.
  7. Przeprowadzić perfuzję 20 ml PBS (pH 7,6), następnie 30 ml 4% paraformaldehydu (pH 7,6, rozcieńczonego PBS ze stokowego roztworu 16% PFA, Electron Microscopy Sciences, kat# 15710), a następnie 20ml 5% sacharozy (pH 7,6). Stwierdzono, że nadmierne utrwalanie zwiększa autofluorescencję. Perfuzja 5% sacharozą wypłukuje pozostałe PFA z mózgu, co obniża autofluorescencję.
  8. Wyjąć mózg i przechowywać w 30% sacharozie przez 3 dni.
  9. Aby zamrozić mózgi do cięcia w płaszczyźnie koronowej, odciąć móżdżek żyletką i umieścić mózg w plastikowej formie do zatapiania (VWR, kat# 18986-1) stroną rostralną do góry, a następnie zanurzyć w medium montażowym O.C.T. (Tissue-Tek, kat# 4583). Zamrozić w suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -20 °C przed krojeniem.
  10. Wyciąć przekroje mózgu (o grubości 30 μm) na kriostacie, a następnie przenieść na powlekane szkiełka. Przechowywać przekroje mózgu w temperaturze -20°C w kasetkach do szkiełek zawierających jeden bezwodny kamień siarczanu wapnia. Kasetka do szkiełek powinna znajdować się w szczelnie zamkniętym worku strunowym, aby uniknąć wilgoci i późniejszego „oparzenia mrozowego” podczas przechowywania w -20°C.

3. Obrazowanie fluorescencyjnych nAChR za pomocą spektralnej mikroskopii konfokalnej

  1. Należy zapewnić minimalną ekspozycję preparatów na jakiekolwiek źródło światła, aby zminimalizować fotobleaching.
  2. Przykryć skrawki mózgu szkiełkami przy użyciu medium montażowego, które nie hamuje fluorescencji białek fluorescencyjnych. Dobre wyniki osiągamy stosując Mowiol 4-88 (pH 8.5 w Tris-HCl i glicerolu, EMD-Calbiochem, kat# 475904), który twardnieje po kilku godzinach. Przed nałożeniem szkiełek należy upewnić się, że Mowiol wyrównał temperaturę do temperatury pokojowej, aby uniknąć pęcherzyków powietrza. Do montażu szkiełek nie należy używać lakieru do paznokci, ponieważ powoduje on gaszenie fluorescencji YFP.
  3. Obrazy są pozyskiwane przy użyciu spektralnego systemu mikroskopu konfokalnego Nikon C1si. Szczegółowe informacje na temat metody spektralnego obrazowania konfokalnego i linearnego rozdzielania sygnałów (linear unmixing) podano w innych źródłach 13-15. Uzasadnieniem dla zastosowania spektralnego mikroskopu konfokalnego jest fakt, że utrwalona tkanka mózgowa wykazuje naturalną autofluorescencję. Obrazowanie spektralne konfokalne w systemie Nikon C1si wykorzystuje matrycę 32 detektorów z fotopowielaczami, które próbkują określony zakres długości fal emitowanego światła fluorescencyjnego, załamanego przestrzennie na różne długości fal za pomocą dyspersyjnego elementu dyfrakcyjnego, podobnie jak pryzmat rozszczepiający białe światło na tęczę kolorów16. Wynikiem jest stos obrazów lambda – obrazy zbierane przy różnych długościach fal światła, tak aby dla każdego piksela stosu obrazów lambda zebrane zostało widmo emisji. Ponieważ YFP i autofluorescencja tkankowa mają charakterystyczne sygnatury spektralne, stos lambda może zostać poddany dekonwolucji za pomocą algebraicznego algorytmu linearnego rozdzielania sygnałów na oddzielne sygnały YFP i autofluorescencyjne (Rys. 2). Dzięki temu można dokonać bardzo dokładnej kwantyfikacji fluorescencji YFP nawet w tkankach o znacznym poziomie autofluorescencji.
  4. Różne ustawienia można dostosować w celu optymalizacji jakości obrazu i wydajności zbierania fluorescencji. Przedstawiamy ustawienia, których zazwyczaj używamy, ale mogą one być modyfikowane w zależności od próbki i mikroskopu konfokalnego. Aby dokładnie skwantyfikować zmiany w ekspresji podjednostki α4YFP przy przewlekłej nikotynie, upewniamy się, że intensywność poziomów skali szarości sygnałów we wszystkich pikselach znajduje się poniżej wartości nasycenia (< 4095 dla 12-bitowej skali szarości). Ponadto, aby uwzględnić potencjalny wzrost sygnału wynikający z upregulacji receptorów, dostosowujemy ustawienia konfokalne tak, aby wartości pikseli wynosiły około jednej trzeciej wartości nasycenia (~1300-1400) lub mniej. Po zoptymalizowaniu ustawień pozostają one identyczne dla wszystkich sesji obrazowania i próbek.
  5. Do obrazowania α4YFP przy użyciu immersyjnego obiektywu olejowego 60X CFI Plan Apo VC (1.40 N.A., odległość robocza 0.13 mm) stosujemy następujące ustawienia: linia lasera 488 nm przy 15% maksymalnej transmisji lasera argonowego 40 mW, wzmocnienie detektora spektralnego 220, zakres spektralny obrazowania od 496.5 nm do 656.5 nm z rozdzielczością 5 nm, 512 x 512 pikseli na obszarze 50 μm x 50 μm, średni rozmiar otworu pinhole (śr. 60 μm), czas przebywania piksela 4.08, uśrednianie z dwóch skanów oraz 12-bitowa skala szarości.

4. Liniowy unmixing obrazów konfokalnych spektralnych i analiza obrazu

  1. Aby przeprowadzić liniowe rozdzielanie widmowe (linear spectral unmixing) obrazu próbki wykonanego za pomocą spektralnego mikroskopu konfokalnego, należy najpierw pozyskać widmo referencyjne dla YFP oraz widmo referencyjne dla autofluorescencji tkankowej.
  2. Kluczowym wymogiem dla każdego widma referencyjnego jest uzyskanie widma fluorescencji o wysokim stosunku sygnału do szumu, obrazowanego przy użyciu tej samej linii laserowej, która była stosowana do obrazowania próbek. Chociaż linia lasera argonowego 514 nm wykazuje wyższą wydajność wzbudzania YFP, preferujemy obrazowanie YFP linią laserową 488 nm, ponieważ zapewnia ona lepszą separację od szczytu emisji YFP, a linia 488 nm rzadziej zniekształca szczyt, co pozwala na uzyskanie pełnego widma emisji YFP, w tym wznoszącej części szczytu. Obrazujemy rozpuszczalne YFP przetransfekowane do linii komórkowej, aby uzyskać silny sygnał YFP, a otrzymane widmo YFP jest przechowywane w naszej bibliotece widm referencyjnych. Można również zastosować nadekspresyjną α4YFP w liniach komórkowych, ponieważ ona również zapewni widmo o wysokim stosunku sygnału do tła.
  3. Aby uzyskać widmo referencyjne autofluorescencji, obrazujemy autofluorescencję z przekroju mózgu myszy typu dzikiego z różnych obszarów mózgu, które planujemy obrazować u myszy α4YFP, i pozyskujemy odpowiadające im widma. Stosujemy tę samą linię laserową, 488 nm, i obrazujemy przy użyciu niemal identycznych parametrów, choć możemy zmienić wzmocnienie detektora, intensywność lasera lub zastosować uśrednianie obrazów, aby zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu.
  4. Po uzyskaniu spektralnego obrazu konfokalnego z obszaru mózgu myszy α4YFP, obraz jest następnie dekonwolwowany na sygnały YFP i autofluorescencji poprzez zastosowanie algorytmu liniowego rozdzielania widmowego z wykorzystaniem widma referencyjnego YFP oraz widma referencyjnego autofluorescencji myszy typu dzikiego z tego samego obszaru mózgu.
  5. Rozdzielony obraz α4YFP można następnie otworzyć w oprogramowaniu do analizy obrazów, takim jak ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/), a następnie obliczyć średnią intensywność pikseli dla obszaru zainteresowania. Do importowania plików konfokalnych Nikon ics/ids można użyć wtyczki do ImageJ o nazwie „loci_tools.jar” (http://www.loci.wisc.edu/bio-formats/imagej).
  6. Powtarzamy to samo liniowe rozdzielanie widmowe i analizę dla myszy typu dzikiego w tym samym obszarze mózgu, aby uzyskać wartość rezydualną tła.
  7. Następnie oblicza się skorygowaną średnią intensywność α4YFP poprzez odjęcie wartości rezydualnej tła (4.6) od średniej nieskorygowanej wartości α4YFP (4.5).

5. Reprezentatywne wyniki

Przedstawiamy reprezentacyjną projekcję w prawdziwych kolorach stosu obrazów lambda dla przyśrodkowej habenuli myszy α4YFP homozygotycznej (Ryc. 3A), wykonaną za pomocą spektralnego mikroskopu konfokalnego. Przedstawiamy również widmo emisji z obszaru zainteresowania zawierającego neurony dodatnie pod kątem α4YFP z tego samego obrazu stosu lambda (Ryc. 3B). Wyraźny szczyt emisji jest widoczny przy ~527 nm, co odpowiada szczytowej emisji fluorescencji YFP. Obszar sąsiadujący z przyśrodkową habenulą wykazuje widmo emisji pozbawione szczytu spektralnego przy 527 nm, co wskazuje na brak podjednostek nAChR α4YFP. Po liniowym rozdzieleniu spektralnym (unmixing) z wykorzystaniem widm referencyjnych YFP oraz autofluorescencji mózgu myszy o znacznym nakładaniu się emisji (Ryc. 4), możliwe jest oddzielenie sygnału YFP od sygnału autofluorescencyjnego, co pozwala na uzyskanie obrazu rozdzielonego dla α4YFP, obrazu rozdzielonego dla autofluorescencji oraz kanału pozostałości. Wyraźną lokalizację fluorescencji α4YFP można zidentyfikować w gęsto upakowanych somach przyśrodkowej habenuli (Ryc. 4).

W hipokampie α4YFP lokalizuje się głównie w przyśrodkowej drodze perforującej, drodze skroniowo-amonatycznej oraz w alveus12. Są to wszystkie glutaminergiczne unerwienia hipokampa. zbadaliśmy wpływ przewlekłego podawania nikotyny na ekspresję α4YFP w drodze perforującej hipokampa (Rys. 5). Przewlekłe podawanie nikotyny (2 mg/kg/hr przez 10 dni) spowodowało istotny wzrost (69 ± 14%) fluorescencji α4YFP u myszy traktowanych przewlekle nikotyną w porównaniu do myszy z grupy kontrolnej traktowanych solą fizjologiczną (p = 0,001, test sum rang Wilcoxona) (Rys. 5).

Proces obrazowania myszy z knock-in α4YFP, schemat rozdzielania spektralnego, konfiguracja mikroskopii konfokalnej.
Rysunek 1. Schemat blokowy przedstawiający procedurę obrazowania zmian w podjednostkach α4YFP nAChR przy przewlekłym podawaniu nikotyny. Miniaturowe pompy osmotyczne są wypełniane solą fizjologiczną lub nikotyną i implantowane podskórnie u homozygotycznych myszy α4YFP. Po 10 dniach myszy są perfundowane i utrwalane w 4% paraformaldehydzie, a mózgi myszy są cięte (grubość 30 μm) na szkiełkach. Przekrój mózgu jest obrazowany za pomocą spektralnego mikroskopu konfokalnego (Nikon C1si), a następnie obraz poddawany jest rozdzielaniu spektralnemu na obrazy YFP i obraz autofluorescencji. Następnie obrazy α4YFP są dalej analizowane przy użyciu oprogramowania ImageJ.

Schemat analizy danych widmowych; widma absorpcyjne; wykresy znormalizowanej intensywności w funkcji długości fali.
Rycina 2. Schemat stosu lambda obrazowanego za pomocą spektralnego mikroskopu konfokalnego i rozdzielonego liniowo na jego komponenty widmowe. (A) Gromadzenie stosu lambda obrazów. (B) Stos lambda składa się z obrazów zarejestrowanych przy różnych długościach fali światła, dzięki czemu dla każdego piksela w całym stosie zbierane jest widmo emisji. (C) Ponieważ YFP i autofluorescencja tkanki posiadają charakterystyczne sygnatury widmowe, stos lambda może zostać poddany dekonwolucji przy użyciu algebraicznego algorytmu liniowego rozdzielania (linear unmixing) na oddzielne sygnały YFP i autofluorescencji. Dzięki temu możliwe jest bardzo dokładne określenie ilości fluorescencji YFP nawet w tkankach o wysokim poziomie autofluorescencji.

Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej z wykresem widm emisji; analiza właściwości optycznych.
Rycina 3. Spektralny obraz konfokalny obszaru mózgu wykazującego ekspresję α4YFP nAChRs. (A) Projekcja w prawdziwych kolorach stosu obrazów lambda z przyśrodkowej jąderka habitenularnego myszy α4YFP, wykonana za pomocą spektralnego mikroskopu konfokalnego Nikon C1si. (B) Wykresy widm z obszaru zainteresowania, który obejmuje neurony zawierające α4YFP (zielony), oraz z obszaru zainteresowania poza przyśrodkowym jąderkiem habitenularnym (czerwony).

Mikroskopia fluorescencyjna, analiza spektralna; obrazy mikroskopowe z wykresem widm emisji.
Rycina 4. Liniowe rozdzielanie widm (unmixing) w obrębie przyśrodkowej habenuli. (A) Obrazy rozdzielonego sygnału α4YFP oraz (B) autofluorescencji po liniowym rozdzielaniu widm. (C) Widma referencyjne YFP (zielone trójkąty) i autofluorescencji (żółte koła) wykorzystane do rozdzielania widm.

Obrazowanie fluorescencyjne i wykres słupkowy ekspresji α4YFP porównujący działanie nikotyny i soli fizjologicznej.
Rycina 5. Nadmierna ekspresja α4 nAChRs w hipokampie myszy knock-in α4YFP poddanych przewlekłemu działaniu nikotyny. (A) Mozaika kafelkowa fluorescencji α4YFP z hipokampa. Dwa zaznaczone przerywanymi liniami obszary wskazują przybliżone lokalizacje w dolnym ramieniu drogi perforującej hipokampa, w których przeprowadzono analizy dla każdej myszy. (B) Fluorescencja α4YFP była istotnie wyższa w drodze perforującej myszy poddanych przewlekłemu działaniu nikotyny niż myszy otrzymujących przewlekle sól fizjologiczną (*, p = 0.001, test suma rang Wilcoxona). Wyniki przedstawiono jako średnia ± SEM z n = 20 pomiarów dla myszy traktowanych solą fizjologiczną oraz nikotyną (5 myszy w każdej grupie badawczej).

Analiza stosu Z w mikroskopii konfokalnej; schemat z wykresem intensywności, wyniki sekcjonowania optycznego.
Rysunek 6. Lepsza ekspresja w głąb tkanki α4YFP w porównaniu z znakowaniem przeciwciałami. Ortogonalne widoki X-Z fluorescencji α4YFP (A) oraz przeciwciała VGlut2 z Cy5 jako znacznikiem wtórnym (B). (C) Wykresy wykazujące większą degradację intensywności sygnału fluorescencyjnego wraz z głębokością dla barwienia przeciwciałami (czarne kwadraty) w porównaniu z α4YFP (otwarte kółka).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wykorzystanie fluorescencyjnego receptora w modelu mysim typu knock-in do określenia ilości i lokalizacji konkretnego kanału jonowego niesie ze sobą szereg zalet. W przeciwieństwie do białek takich jak aktyna, która jest powszechnie ekspresyjna we wszystkich komórkach, kanały jonowe występują w znacznie mniejszej liczbie, a ich ekspresja różni się w zależności od podtypów neuronów, co utrudnia dokładną analizę za pomocą tradycyjnych technik immunohistochemicznych. Produkt genu α4YFP jest ekspresowany na poziomach WT, po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

Anthony Renda otrzymał wsparcie w ramach University of Victoria Graduate Fellowship Award. Badania te były finansowane z grantu Discovery Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, nagrody NARSAD Young investigator Award (dla R.N.), funduszy Victoria Foundation - Myre and Winifred Sim Fund, grantu Canadian Foundation for Innovation, British Columbia Knowledge Development Fund oraz grantu Research Tools and Instrumentation Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada. Dziękujemy Jillian McKay, Christinie Barnes, Ariel Sullivan, Jennifer MacDonald oraz Danielowi Morgado za doskonałą opiekę nad myszami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
mini pompy osmotycznefigure-materials-1 Alzetmodel 2002
sól fizjologicznaTEKnova, Inc.S5819
(-)-nikotyny wodorowinian winianuSigma-AldrichN5260
krople do oczuNovartis AGTear-Gel
klej Vetbond3M1469SB
heparyna sodowaSigma-AldrichH4784
10x PBSInvitrogen70011
ketaminaWyeth Animal Health0856-4403-01
chlorowodorek medatomidynyPfizer Pharma GmbH1950673
igła motylkowa 23GBD Biosciences367253
paraformaldehydElectron Microscopy Sciences15710
plastikowa forma do zatapianiaVWR international18986-1
medium montażowe O.C.T.Tissue-Tek4583
Mowiol 4-88EMD Millipore475904pH 8.5

Bibliografia

  1. Perry, D. C., Davila-Garcia, M. I., Stockmeier, C. A., Kellar, K. J. Increased nicotinic receptors in brains from smokers: membrane binding and autoradiography studies. J. Pharmacol. Exp. Ther. 289, 1545-1552 (1999).
  2. Schwartz, R. D., Kellar, K. J. Nicotinic cholinergic receptor binding sites in the brain: regulation in vivo. Science. 220, 214-216 (1983).
  3. Marks, M. J., Burch, J. B., Collins, A. C. Effects of chronic nicotine infusion on tolerance development and nicotinic receptors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 226, 817-8125 (1983).
  4. Carlezon, W. A. J., Nestler, E. J. Elevated levels of GluR1 in the midbrain: a trigger for sensitization to drugs of abuse. Trends Neurosci. 25, 610-615 (2002).
  5. Fitzgerald, L. W., Ortiz, J., Hamedani, A. G., Nestler, E. J. Drugs of abuse and stress increase the expression of GluR1 and NMDAR1 glutamate receptor subunits in the rat ventral tegmental area: common adaptations among cross-sensitizing agents. J. Neurosci. 16, 274-2782 (1996).
  6. Saal, D., Dong, Y., Bonci, A., Malenka, R. C. Drugs of abuse and stress trigger a common synaptic adaptation in dopamine neurons. Neuron. 37, 577-5782 (2003).
  7. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
  8. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
  9. Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
  10. Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
  11. Nashmi, R., Dickinson, M. E., McKinney, S., Jareb, M., Labarca, C., Fraser, S. E. Assembly of α4β2 nicotinic acetylcholine receptors assessed with functional fluorescently labeled subunits: effects of localization, trafficking, and nicotine-induced upregulation in clonal mammalian cells and in cultured midbrain neurons. J. Neurosci. 23, 11554-11567 (2003).
  12. Nashmi, R., Xiao, C., Deshpande, P., McKinney, S., Grady, S. R., Whiteaker, P. Chronic nicotine cell specifically upregulates functional α4* nicotinic receptors: basis for both tolerance in midbrain and enhanced long-term potentiation in perforant path. J. Neurosci. 27, 8202-8218 (2007).
  13. Dickinson, M. E., Bearman, G., Tilie, S., Lansford, R., Fraser, S. E. Multi-spectral imaging and linear unmixing add a whole new dimension to laser scanning fluorescence microscopy. BioTechniques. 31, 1272-1278 (2001).
  14. Nashmi, R., Fraser, S. E., Lester, H., Dickinson, M. E. Molecular imaging: fret microscopy and spectroscopy. Periasamy, A., Day, R. N. , Oxford University Press. 180-192 (2005).
  15. Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Lett. 531, 245-249 (2002).
  16. Larson, J. M. The Nikon C1si combines high spectral resolution, high sensitivity, and high acquisition speed. Cytometry A. 69, 825-8234 (2006).
  17. Melvin, N. R., Sutherland, R. J. Quantitative caveats of standard immunohistochemical procedures: implications for optical disector-based designs. J. Histochem. Cytochem. 58, 577-5784 (2010).
  18. Jones, I. W., Wonnacott, S. Why doesn't nicotinic ACh receptor immunoreactivity knock out. Trends Neurosci. 28, 343-345 (2005).
  19. Moser, N., Mechawar, N., Jones, I., Gochberg-Sarver, A., Orr-Urtreger, A., Plomann, M. Evaluating the suitability of nicotinic acetylcholine receptor antibodies for standard immunodetection procedures. J. Neurochem. , (2007).
  20. Whiteaker, P., Cooper, J. F., Salminen, O., Marks, M. J., McClure-Begley, T. D., Brown, R. W., Collins, A. C., Lindstrom, J. M. Immunolabeling demonstrates the interdependence of mouse brain a4 and b2 nicotinic acetylcholine receptor subunit expression. The Journal of Comparative Neurology. 499, 1016-1038 (2006).
  21. Marks, M. J., McClure-Begley, T. D., Whiteaker, P., Salminen, O., Brown, R. W. B., Cooper, J., Collins, A. C., Lindstrom, J. M. Increased nicotinic acetylcholine receptor protein underlies chronic nicotine-induced up-regulation of nicotinic agonist binding sites in mouse brain. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. , 337-3187 (2011).
  22. Marks, M. J., Rowell, P. P., Cao, J. Z., Grady, S. R., McCallum, S. E., Collins, A. C. Subsets of acetylcholine-stimulated 86[Rb]+ efflux and 125[I]-epibatidine binding sites in C57BL/6 mouse brain are differentially affected by chronic nicotine treatment. Neuropharmacology. 46, 1141-1157 (2004).
  23. King, S. L., Caldarone, B. J., Picciotto, M. R. Beta2-subunit-containing nicotinic acetylcholine receptors are critical for dopamine-dependent locomotor activation following repeated nicotine administration. Neuropharmacology. 47, 132-139 (2004).
  24. Robinson, S. F., Marks, M. J., Collins, A. C. Inbred mouse strains vary in oral self-selection of nicotine. Psychopharmacology (Berl). 124, 332-339 (1996).
  25. Sparks, J. A., Pauly, J. R. Effects of continuous oral nicotine administration on brain nicotinic receptors and responsiveness to nicotine in C57Bl/6 mice. Psychopharmacology (Berl). , 141-145 (1999).
  26. Rahman, S., Zhang, J., Engleman, E. A., Corrigall, W. A. Neuroadaptive changes in the mesoaccumbens dopamine system after chronic nicotine self-administration: a microdialysis study. Neuroscience. 129, 415-4124 (2004).
  27. Picciotto, M. R., Zoli, M., Rimondini, R., Lena, C., Marubio, L. M., Pich, E. M. Acetylcholine receptors containing the β2 subunit are involved in the reinforcing properties of nicotine. Nature. 391, 173-177 (1998).
  28. Fowler, C. D., Lu, Q., Johnson, P. M., Marks, M. J., Kenny, P. J. Habenular α5 nicotinic receptor subunit signalling controls nicotine intake. Nature. 471, 597-601 (2011).
  29. Maskos, U., Molles, B. E., Pons, S., Besson, M., Guiard, B. P., Guilloux, J. P. Nicotine reinforcement and cognition restored by targeted expression of nicotinic receptors. Nature. 436, 103-107 (2005).
  30. Matta, S. G., Balfour, D. J., Benowitz, N. L., Boyd, R. T., Buccafusco, J. J., Caggiula, A. R., Craig, C. R., Collins, A. C., Damaj, M. I., Donny, E. C., Gardiner, P. S., Grady, S. R., Heberlein, U., Leonard, S. S. Guidelines on nicotine dose selection for in vivo research. Psychopharmacology. 190, 269-319 (2007).
  31. Lang, T., Rizzoli, S. O. Membrane protein clusters at nanoscale resolution: more than pretty pictures. Physiology (Bethesda). 25, 116-1124 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Spektralna mikroskopia konfokalnamyszy z knock-inem Alpha4YFPliniowe rozplątywanie widmimplantacja mini-pompy osmotycznejfiksacja poprzez perfuzję wewnątrzsercowąkriosekcjonowanie tkanki mózgowejodejmowanie autofluorescencjiprzyśrodkowa droga perforująca
Spektralne obrazowanie konfokalne nikotynowych receptorów znakowanych fluorescencyjnie u myszy typu knock-in z przewlekłą podażą nikotyny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.