Artykuł metodologiczny

Izolacja i badanie biofizyczne kutykuli owoców

17.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3529

⸱

30 marca 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, City College of New York, City University of New York Graduate Center and Institute for Macromolecular Assemblies, 2Department of Chemical Engineering, City College of New York

W tym artykule

Podsumowanie

Nadziemne organy roślin są chronione przez kutykulę, która stanowi supramolekularny kompleks biopoliestru i wosków. Przedstawiamy protokoły monitorowania selektywnego usuwania wosków epikutykularnych i intrakutykularnych z kutykuli owoców pomidora w skalach molekularnej i mikro, odpowiednio za pomocą NMR w stanie stałym oraz mikroskopii sił atomowych, a także oceny zdolności do sieciowania zmodyfikowanych biopoliestrów kutykularnych.

Streszczenie

Kutikula, hydrofobowa warstwa ochronna nadziemnych części roślin lądowych, pełni funkcję wszechstronnej bariery obronnej przeciwko różnym stresom biotycznym i abiotycznym, a także reguluje przepływ wody z środowiska zewnętrznego.1 Główną strukturę kutikuli tworzą biopoliester (kutyna) oraz długołańcuchowe kwasy tłuszczowe (woski); integralność funkcjonalna warstwy kutikularnej zależy zarówno od zewnętrznej warstwy „epikutikularnej”, jak i od mieszaniny składającej się z biopolimeru kutyny oraz wosków „intrakutikularnych”.2 W niniejszym opracowaniu opisujemy kompleksowy protokół całkowitej ekstrakcji wosków z kutikul komercyjnych owoców pomidora (Solanum lycopersicum) lub sekwencyjnego i selektywnego usuwania wosków epikutikularnych i intrakutikularnych z kompozytu kutikularnego. Metoda Jettera i Schäffera (2001) została zaadaptowana do stopniowej ekstrakcji wosków epikutikularnych i intrakutikularnych z kutikuli owoców.3,4 W celu monitorowania procesu sekwencyjnego usuwania wosków, równolegle z mikroskopią sił atomowych (AFM) zastosowano spektroskopię NMR 13C w stanie stałym z polaryzacją krzyżową i magicznym kątem obrotu (CPMAS), co pozwoliło na uzyskanie strukturalnych profili materiałów w skali molekularnej, uzupełnionych o informacje na temat topografii i chropowatości powierzchni kutikularnych w skali mikro. Aby ocenić zdolność do sieciowania odwoskowanych kutikul z owoców pomidora typu dzikiego oraz mutantów z pojedynczą mutacją genu, wykorzystano MAS 13C NMR do porównania względnych proporcji utlenionych grup alifatycznych (CHO i CH2O).

Kolejne etapy ekstrakcji Soxhleta z wykorzystaniem zestawu rozpuszczalników o różnej polarności umożliwiają całkowite usunięcie wosków, stanowiąc skuteczną metodę izolacji frakcji woskowych w oparciu o właściwości hydrofobowe ich składników alifatycznych i aromatycznych, przy jednoczesnym zachowaniu struktury chemicznej biopoliestru kutyny. Mechaniczna ekstrakcja wosków epikutykularnych oraz selektywne usuwanie wosków intrakutykularnych, monitorowane za pomocą komplementarnych metod fizycznych, zapewnia bezprecedensowe możliwości badania budowy kutykuli: podejście to pozwala ujawnić organizację supramolekularną i integrację strukturalną różnych typów wosków, architekturę macierzy kutyna-wosk oraz skład chemiczny każdego z komponentów. Ponadto analiza NMR stanu stałego 13C pozwala wykryć różnice w relatywnej liczbie grup chemicznych CHO i CH2O w dojrzałych czerwonych owocach pomidora typu dzikiego oraz mutantów. Techniki NMR stanowią wyjątkowe narzędzia do określania struktury molekularnej materiałów kutykularnych, które są nierozpuszczalne, amorficzne i chemicznie heterogeniczne. Jako nieinwazyjna technika obrazowania selektywnego powierzchniowo, AFM zapewnia skuteczną i bezpośrednią metodę badania organizacji strukturalnej kompleksu kutykularnego w skali od nm do μm.

Protokół

1. Enzymatyczna izolacja kutykuli pomidora5

  1. Umieścić kilka pomidorów handlowych lub hodowlanych w misce. Obrać skórkę z owoców w dużych fragmentach; odrzucić tkankę wewnętrznego perykarpium. Przemyć skórki pomidorów wodą dejonizowaną i przechowywać je pod wodą w zlewce.
  2. Przygotować 50 mM bufor octanu sodu o pH 4,0 (w 31 °C), wsypując 1,22 g trihydratu octanu sodu (Mr. 136,08 g/mol) i dodając 2,34 ml lodowatego kwasu octowego (17,485 M) do zlewki, uzupełniając 200 ml wody dejonizowanej, a następnie regulując pH do 4,0 w temperaturze 31 °C. Przygotować mieszaninę zawierającą 4 ml pektynazy (EC 3.2.1.15; 10 U ml-1, TCI America), 0,2 g celulazy (EC 232.734.4; 1,3 units/mg ciała stałego, Sigma Aldrich) oraz 13 mg NaN3, a następnie dodać 196 ml buforu octanu sodu do mieszaniny enzymów, aby otrzymać 200 ml końcowego koktajlu enzymatycznego.5 Całkowicie zanurzyć obraną skórkę pomidora w koktajlu enzymatycznym i inkubować w 31 °C przez 24 godziny przy stałym wytrząsaniu (G24 Environmental Incubator Shaker; New Brunswick Scientific Co.).
  3. Zebrać skórki pomidorów za pomocą sitka kuchennego lub lejka Büchnera i przemyć je wodą dejonizowaną. Następnie umieścić je w suszarce próżniowej w temperaturze pokojowej na jedną godzinę. Przechowywać wysuszone skórki pomidorów w opisanej i zakrytej butelce do późniejszych procedur usuwania wosku.

2. Całkowite odtłuszczanie metodą ekstrakcji Soxhleta6

  1. Sprzęt używany do całkowitego odtłuszczania składa się ze źródła ciepła (płaszcza grzejnego i regulatora Variac), kolby okrągłodennej służącej jako zbiornik z rozpuszczalnikiem, ekstraktora Soxhleta, spiekanego szklanego tygla lub jednorazowego tygla do ekstrakcji, ziaren wrzutek oraz chłodnicy (patrz Rys. 1). Należy pamiętać, że wąskie ramię syfonu (części 6 i 7 na Rys. 1) jest bardzo delikatne i podatne na uszkodzenia, co wymaga ostrożnego obchodzenia się z nim.
  2. Umieść 0,5-1 g skórki pomidora (uzyskanej w kroku 1.) w moździerzu i rozetrzyj próbkę tłuczkiem na gruby proszek, chyba że próbki mają zostać wykorzystane do pomiarów AFM (Sekcja 5). Wypełnij spiekanый szklany lub jednorazowy tygiel próbką mniej więcej do połowy i za pomocą pęsety ostrożnie umieść go u podstawy kolumny ekstrakcyjnej.
  3. Zamocuj chłodnicę i owiń ją folią aluminiową. Podgrzewaj rozpuszczalnik w postaci metanolu (klasy ACS) w obecności kilku ziaren wrzutek, aż zacznie łagodnie wrzeć i nastąpi cofanie się skroplonej cieczy na ściankach kolby. Przykryj zbiornik z rozpuszczalnikiem zarówno watą szklaną, jak i folią aluminiową. Kontroluj proces przez godzinę, regulując napięcie Variaca tak, aby w zbiorniku gromadziła się około jedna kropla na sekundę, a syfonowanie w aparacie Soxhleta następowało w momencie wypełnienia tygla.
  4. Kontynuuj proces ekstrakcji przez 12 h, a następnie obniż płaszcz grzejny i pozwól aparatowi ostygnąć. Zdejmij ekstraktor wraz ze zbiornikiem jako jedną całość, aby zutylizować rozpuszczalnik. Za pomocą pęsety podnieś tygiel tuż poniżej szyjki kolumny ekstrakcyjnej, odlej z niego nadmiar rozpuszczalnika i połóż tygiel na czystej powierzchni. Przechyl kolumnę ekstrakcyjną, aby umożliwić odpływ cieczy do kolby poniżej. Odłącz kolbę i wlej odpady do oznakowanego pojemnika na zużyte rozpuszczalniki.
  5. Powtórz kroki 2.3 i 2.4 dla kolejnych rozpuszczalników o stopniowo zmniejszającej się polarności, np. chloroformu i heksanu, przez 12 h w każdym przypadku.
  6. Pozostaw próbkę kutyny pomidorowej do wyschnięcia wewnątrz tygla, dmuchając na nią strumieniem azotu lub umieszczając ją w suszarce próżniowej w temperaturze pokojowej. Na koniec zmierz masę suchej próbki i przechowuj ją w temperaturze pokojowej w słoiku z nakrętką uszczelnionym paraf സിനിമem.

3. Selektywna izolacja wosków epikutikularnych i intrakutikularnych3,4

  1. Najpierw całe pomidory (inna partia pomidorów niż opisana w punkcie 1) należy umyć wodą destylowaną. Osuszyć je ręcznikami papierowymi oraz chusteczkami Kimwipes, a następnie położyć szypułkami do dołu na kawałku folii aluminiowej.
  2. Całe pomidory należy pokryć 120% (w/w, stosunek masowy) wodnym roztworem gumy arabskiej, nakładając go od góry ku dołowi, i pozostawić na około godzinę do wyschnięcia gumy arabskiej na skórce owocu, aż powstanie cienka błona. Błonę tę należy usunąć za pomocą pęsety, uważając, aby nie przebić skórki pomidora. Procedurę należy powtórzyć jeszcze raz.
  3. Błony należy dodać do probówek zawierających mieszaninę chloroformu i wody w stosunku 1:1 (v/v) i mieszać przez trzy minuty. Po intensywnym wstrząsaniu i rozdzieleniu faz należy odpipetować frakcje chloroformowe i odparować je w oddzielnych, otwartych probówkach, aby uzyskać wosk epikutykularny. Pomidory pozostaną nienaruszone fizycznie. Należy zanurzyć je w chloroformie na dwie minuty w temperaturze pokojowej i zebrać wosk intrakutykularny po odparowaniu rozpuszczalnika. Następnie pomidory należy obrać ze skórki i poddać obróbce enzymatycznej (za pomocą celulazy i pektynazy w buforze octanu sodu), aby usunąć odpowiednio celulozę i pektynę (jak opisano w punkcie 1).
  4. W razie potrzeby należy przeprowadzić całkowite odtłuszczanie tych enzymatycznie wyizolowanych kutykul za pomocą ekstrakcji w aparacie Soxhleta (patrz krok 2), stosując trzy rozpuszczalniki o różnej polarności (odpowiednio metanol, chloroform i heksan).

4. Charakterystyka molekularna kutyny z owoców pomidora za pomocą spektroskopii jądrowego rezonansu magnetycznego w stanie ciało z magicznym kątem obrotu i polaryzacją krzyżową (CPMAS ssNMR)6

  1. Umieścić 4-6 mg całkowicie odwoskowanych kutykul pomidora (kuty n) w rotorze z cyrkonu fastMAS o średnicy 1,6 mm, używając dołączonego przez dostawcę narzędzia do pakowania. (Odpowiednie są zarówno zmielone odwoskowane kutykule pomidora, jak i bardzo małe kawałki kutykul częściowo odwoskowanych). Należy upewnić się, że próbka jest zapakowana w rotor równomiernie, ale nie zbyt ciasno. Po założeniu górnej pokrywki, pomalować połowę pokrywki czarnym markerem, aby ułatwić pomiar prędkości wirowania.
  2. Dostroić shimming spektrometru NMR w celu uzyskania minimalnej szerokości linii widma w połowie wysokości oraz skalibrować szerokości impulsów 90 ° dla protonów (1H) i węgla (13C), używając związku standardowego, takiego jak adamantan.
  3. Używając glicyny lub glutaminy jako związków modelowych, uzyskać maksymalną intensywność sygnału poprzez optymalizację wszystkich parametrów (poziomy mocy dopasowania Hartmanna-Hahna, czas kontaktu 1H - 13C, siła heterojądrowego rozsprzęgania 1H) eksperymentu polaryzacji krzyżowej z wirowaniem pod magicznym kątem (CPMAS). Dla widm rejestrowanych przy częstotliwości 1H wynoszącej 600 MHz zalecane warunki obejmują częstotliwość wirowania 10 kHz lub 15 kHz, 3-sekundową przerwę między akwizycjami oraz heterojądrowe rozsprzęganie protonów SPINAL7 przy natężeniu pola magnetycznego odpowiadającym częstotliwości 185 kHz.
  4. Wsunąć rotor z kuty ną do sondy, a następnie umieścić sondę w magnesie. Stopniowo zwiększać prędkość wirowania do 10 kHz, aby sprawdzić prawidłowość zapakowania próbki i stabilność rotora. Zweryfikować końcową stabilność wirowania rotora z dokładnością do ±20 Hz.
  5. Iteracyjnie regulować kondensatory strojenia i dopasowania sondy, aby osiągnąć minimalne odbicie mocy dla częstotliwości NMR zarówno 1H, jak i 13C. Ustawić temperaturę eksperymentu na 25 °C (lub temperaturę pokojową).
  6. Rozpocząć zoptymalizowany wcześniej eksperyment CPMAS, odpowiadający warunkowi dopasowania Hartmanna-Hahna wyznaczonemu dla częstotliwości wirowania 10 kHz.
  7. Zarejestrować 4096 przejściowych sygnałów, poddać widmo obróbce poprzez wykładnicze (Lorentzowskie) poszerzenie linii o 50-100 Hz i przeprowadzić transformację Fouriera w celu wygenerowania widma NMR intensywności sygnału w funkcji przesłonięcia chemicznego (ppm).
  8. Odnieść przesunięcia chemiczne 13C zewnętrznie, używając adamantanu ustawionego na 38,4 ppm (grupa -CH2-)8 jako standardu.
  9. Zwiększyć częstotliwość wirowania rotora do 15 kHz i powtórzyć pomiar CPMAS (kroki 4.6-4.8) zgodnie z warunkiem dopasowania Hartmanna-Hahna wyznaczonym dla tej drugiej częstotliwości wirowania.
  10. Powtórzyć eksperymenty CPMAS (kroki 4.1-4.9) z próbkami naturalnych (woskowych) i częściowo odwoskowanych kutykul owoców.

5. Badanie powierzchni kutykuli pomidora za pomocą mikroskopii sił atomowych (Digital Instruments Nanoscope IIIa; procedury mogą się nieznacznie różnić w zależności od modelu mikroskopu)6

  1. Włącz skaningowy mikroskop sondowy (SPM) (Ryc. 2) i upewnij się, że przełącznik trybu mikroskopu jest ustawiony na tryb kontaktowej mikroskopii sił atomowych (AFM).
  2. Ręcznie podnieś głowicę SPM, obracając dwa przednie pokrętła regulacyjne. Odłącz uchwyt sondy AFM od głowicy SPM, odkręcając śrubę mocującą z tyłu głowicy.
  3. Za pomocą pęsety usuń istniejącą dźwignię AFM z uchwytu, a następnie ostrożnie wyjmij z opakowania nową dźwignię z azotku krzemu (sondę AFM) i zamontuj ją w miejsce starej. Użyj mikroskopu świetlnego, aby zweryfikować, czy nowo zainstalowana dźwignia AFM nie jest uszkodzona.
  4. Przymocuj próbkę kutykuli pomidora (fragment częściowo odtłuszczonej kutykuli pomidora o wymiarach ok. 10 mm x 10 mm) do dysku ze stali nierdzewnej (podkładki na próbkę) za pomocą taśmy dwustronnej. Użyj mikroskopu świetlnego, aby sprawdzić, czy powierzchnia kutykuli pozostała płaska i gładka po umieszczeniu próbki na podkładce.
  5. Umieść podkładkę z próbką kutykuli pomidora na obszarze magnetycznym na górze skanera SPM.
  6. Wyreguluj dwa przednie ręczne śruby nastawcze skanera w górę, obracając pokrętła; ustaw zmotoryzowaną tylną śrubę nastawczą na poziomie zbliżonym do dwóch przednich śrub. Upewnij się, że wszystkie trzy śruby są ustawione wystarczająco wysoko, aby uniknąć złamania sondy AFM podczas umieszczania uchwytu w głowicy SPM.
  7. Włóż ponownie uchwyt sondy do głowicy SPM i zabezpiecz go, dokręcając śrubę mocującą z tyłu głowicy.
  8. Po włączeniu lasera ustaw plamkę lasera na dźwigni AFM, korzystając z centralnego (y) i prawego (x) pokręteł regulacji lasera na górze głowicy. Monitoruj odbitą wiązkę lasera na kartce papieru, aby ustawić plamkę lasera dokładnie na końcu dźwigni AFM.
  9. Iteracyjnie reguluj pozycję ruchomego lustra za pomocą pokręteł regulacji fotodetektora, aby uzyskać maksymalny sygnał (sygnał SUM), zapewniając tym samym równomierny odbiór odbitej wiązki lasera przez cztery kwadranty fotodetektora.
  10. Obniż sondę AFM, cofając przednie śruby regulacyjne oraz zmotoryzowaną tylną śrubę nastawczą skanera SPM, monitorując wizualnie zbliżanie się sondy AFM do powierzchni próbki za pomocą mikroskopu odwróconego. Upewnij się, że wszystkie trzy śruby znajdują się na tym samym poziomie, aby uniknąć artefaktów wynikających z obrazowania przechylonej próbki. Przybliż sondę do próbki, ale nie na tyle blisko, aby sonda dotknęła lub przebiła powierzchnię próbki.
  11. Na tym etapie światło lasera odbite od dźwigni AFM odbije się od ruchomego lustra do fotodetektora. Dla trybu kontaktowego AFM z sondą z azotku krzemu ustaw napięcie sygnału wyjściowego (Vertical Deflection) na -2 V dla Setpoint 0 V oraz sygnał różnicowy (DIFF Signal – różnica pionowa/pozioma) na 0 V poprzez regulację pozycji lustra.
  12. W oprogramowaniu Nanoscope kliknij ikonę mikroskopu i wybierz odpowiedni profil (Contact mode AFM).
  13. W panelu „Scan Controls Settings” ustaw szybkość skanowania i rozmiar skanowania, np. rozmiar skanowania 10 micron i szybkość skanowania 2 Hz.
  14. Pozwól sondzie AFM zetknąć się z powierzchnią próbki, klikając ikonę engage-tip. Poprzez sterowanie zmotoryzowaną tylną śrubą podstawy SPM, program obniży teraz sondę, aż zetknie się ona z powierzchnią próbki. Proces skanowania rozpocznie się automatycznie po pomyślnym zetknięciu sondy.
  15. Monitoruj proces skanowania, korzystając z trybów obrazowania (image) i oscyloskopu (scope) oprogramowania, iteracyjnie dostosowując parametry takie jak setpoint, wzmocnienie całkujące, wzmocnienie proporcjonalne, rozmiar skanowania, szybkość skanowania, liczbę linii oraz liczbę próbek na linię, aby uzyskać obrazy o najwyższej rozdzielczości. Rozpocznij skanowanie z dużym zakresem osi z (data scale); następnie ostrożnie zmniejszaj wartość skali danych, aby uzyskać najlepszy kontrast cech powierzchni na obrazie. Minimalizuj występowanie białych obszarów na zeskanowanym obrazie, które wskazują, że wysokość cech powierzchni przekracza dostępny zakres osi z.
  16. Zapisz obraz, aby utrwalić plik danych; następnie przetwórz dane za pomocą funkcji spłaszczania (flattening), aby usunąć artefakty obrazu wynikające z dryftu skanera w pionie (Z), wygięć obrazu oraz przesunięcia pionowego między liniami skanowania;9 na koniec oblicz średnią chropowatość. Po zapisaniu danych wycofaj sondę AFM, odwracając działanie sterowanego komputerowo silnika śruby, który służył do jej zbliżenia. Przetwarzanie obrazów może być wykonywane w trybie analizy obrazów offline i/lub przy użyciu innego komputera.
  17. Użyj przednich dolnych szarych metalowych pokręteł uchwytu sondy, aby zmienić pozycje x i y obszaru skanowania; następnie powtórz pomiar w pięciu miejscach próbki, aby sprawdzić powtarzalność, wymieniając dźwignię AFM w przypadku pogorszenia jakości obrazu.

6. Reprezentatywne wyniki

Analiza przesunięć chemicznych widm CPMAS 13C NMR (Rys. 3) pozwoliła zidentyfikować główne grupy funkcyjne obecne w całkowicie odwoskowanej kutykuli pomidora (kutynie). Stwierdzono, że kluczowe fragmenty węglowe w biopoliestrze kutynowym to alifaty długołańcuchowe (0-45 ppm), alifaty utlenione (45-110 ppm), aromaty i związki z wielokrotnymi wiązaniami (110-160 ppm) oraz grupy karbonylowe (160-220 ppm). Utlenione fragmenty alkilowe (CHO + CH2O) odgrywają kluczową rolę w tworzeniu wiązań kowalencyjnych między jednostkami monomerowymi biopolimeru kutynowego, kształtując tym samym architekturę molekularną macierzy kutyny. Różnice w względnych polach piku zaobserwowane w obszarze widma między 45 a 100 ppm sugerują, że kutyna mutanta posiada stosunkowo większy udział tworzących sieciowania fragmentów strukturalnych CHO w porównaniu do kutyny typu dzikiego; dokładne pomiary ilościowe z wykorzystaniem metod NMR z bezpośrednią polaryzacją (DPMAS)5 potwierdzają ten wniosek (dane nie zostały przedstawione).

Widma CPMAS 13C NMR wykazały również stopniowo zmniejszający się pik wosków przy 31 ppm (Ryc. 4), co wskazuje na sekwencyjne usuwanie wosków epikutykularnych i intrakutykularnych z kompozytu kutyna-wosk przy jednoczesnym zachowaniu głównej architektury chemicznej biopolimeru kutyny. Równoległa analiza obrazów AFM (Ryc. 5) ujawniła nieregularności powierzchni wynikające z etapowej ekstrakcji wosków epikutykularnych i intrakutykularnych z kutykuli owocu, co sygnalizuje zmiany w organizacji struktury kutykularnej.

Schemat zestawu do ekstrakcji Soxhleta z opisanymi elementami służącymi do wydajnej ekstrakcji ciało stałe-ciecz.
Rysunek 1. Ekstraktor Soxhleta (źródło obrazu: Wikipedia).

Układ mikroskopii sondy skaningowej oraz schemat przedstawiający komponenty do analizy powierzchni w nanoskali.
Rysunek 2. A) Mikroskop sondy skaningowej. B) Głowica SPM (zaadaptowano z podręcznika szkoleniowego AFM dostarczonego przez Digital Instruments).

Wykres spektroskopii NMR porównujący przesunięcia chemiczne ^13C odmian pomidora M82 i CM15.
Rysunek 3. Widma 150 MHz CPMAS 13C NMR kutykul (kutyn) z w pełni odwoskowanych, czerwonych, dojrzałych owoców pomidora typu dzikiego (M82) oraz mutantów (CM15) wykazują rezonanse z przesunięciami chemicznymi odpowiadającymi grupom funkcyjnym sieciowanego poliestru opartego na kwasach hydroksy tłuszczowych, a także niektóre grupy z wielokrotnymi wiązaniami. Wszystkie widma zarejestrowano przy częstotliwości wirowania 10 kHz.

Wykres widma NMR przedstawiający proces usuwania wosku; piki wskazują przesunięcia chemiczne w analizie zawartości wosku.
Rysunek 4. Widma 150 MHz 13CCPMAS NMR kutykuli komercyjnych czerwonych, dojrzałych owoców pomidora wykazują zmiany składu po sekwencyjnym usuwaniu wosków epikutykularnych i intrakutykularnych, odpowiednio poprzez mechaniczną ekstrakcję gumą arabską oraz dwuminutową kąpiel w chloroformie. Wszystkie widma zarejestrowano przy częstotliwości wirowania 15 kHz.

Analiza chropowatości powierzchni; wykresy 3D; chropowatość RMS; wpływ usuwania wosku na teksturę powierzchni.
Rycina 5. Obrazy AFM i szacunki chropowatości dla częściowo odwoskowanych kutykul komercyjnych pomidorów opisanych na Rycinie 4 po stopniowym usuwaniu wosków epikutykularnych (lewo) i intrakutykularnych (prawo).

Dyskusja

Opisane tutaj protokoły umożliwiają szczegółową charakterystykę molekularną i mikroskalową złożonego, trudnego do obróbki materiału roślinnego bez konieczności destrukcyjnego rozkładu chemicznego. Aby zbadać mieszanie biopoliestru kutynowego z różnymi lipidami (woskami), które kontrolują organizację strukturalną kompleksu kutykularnego,10 przeprowadzono i monitorowano procedury selektywnego usuwania wosków epikutykularnych i intrakutykularnych z heterogenicznej mieszaniny kutykularnej. Do oceny ekstrakcji molekularnych składników wosku wykorzystano spektroskopię NMR 13C w fazie stałej, a mikroskopia sił atomowych posłużyła do zbadania towarzyszących zmian chropowatości powierzchni.6,11 W celu porównania zdolności do tworzenia wiązań krzyżowych kutyn z owoców pomidora typu dzikiego oraz mutantów z pojedynczą mutacją genową, wykorzystano również spektroskopię NMR 13C w fazie stałej do oszacowania względnej liczby grup chemicznych CHO i CH2O.

Warto zwrócić uwagę na kilka cech konstrukcyjnych tego protokołu. Ponieważ materiały woskowe obejmują szeroki zakres lipidów, w celu całkowitego odtłuszczenia niezbędne jest traktowanie kutykuli owoców serią rozpuszczalników o różnych polarnościach. Ponadto czas odtłuszczania może wynosić od 8 do 24 godzin, w zależności od charakteru próbek kutykuli. Aby spójnie ekstrahować woski epikutykularne z nienaruszonej kutykuli owoców, konieczne jest równomierne nałożenie powłoki adhezyjnej na powierzchnię.

NMR 13C CPMAS w fazie stałej12 jest szybką metodą jakościową służącą do identyfikacji różnych komponentów strukturalnych wysoce heterogennych i nierozpuszczalnych biopolimerów roślinnych przy zachowaniu ich natywnych właściwości fizycznych;13 tradycyjne NMR w fazie ciekłej może być również wykorzystane do charakterystyki ekstraktów mieszanin woskowych. Jeśli wymagana jest ilościowa ocena grup funkcyjnych w nienaruszonych polimerach roślinnych,5 jako metoda uzupełniająca powinno być zastosowane wysokowiernościowe NMR 13C z bezpośrednią polaryzacją i wirowaniem pod kątem magicznym (DPMAS)5,14. Dokładne oznaczenie ilościowe grup funkcyjnych wymaga starnej optymalizacji czasów relaksacji, długości impulsów wzbudzenia oraz mocy sprzęgania heterojądrowego.15 Sprzęganie heterojądrowe może być ustawione dla natężenia pola 1H w zakresie od 50 kHz do 185 kHz przy użyciu metodologii TPPM16 lub SPINAL7. Oprócz tych parametrów czułość pomiarów CPMAS zależy od czasu spin-lock oraz warunku dopasowania Hartmanna-Hahna.15 Zamiast tradycyjnego CPMAS można zastosować technikę CP z rampą amplitudy (RAMP-CP), aby zmaksymalizować wydajność polaryzacji krzyżowej poprzez liniową (~20-50 %) lub styczną zmianę amplitudy 1H przy zachowaniu stałej amplitudy natężenia pola 13C podczas okresu spin-lock (lub odwrotnie).17,18 Przeprowadzenie pomiarów CPMAS przy co najmniej dwóch różnych częstotliwościach wirowania rotora jest niezbędne do odróżnienia pasm bocznych wirowania od głównych pików widma.

Równoległe pomiary AFM przeprowadzone w trybie kontaktowym umożliwiają bezpośrednie obrazowanie stanu powierzchni kutykuli z wysoką prędkością skanowania i wysoką rozdzielczością,19 na przykład podczas sekwencyjnego usuwania składników woskowych. Praca AFM w trybie stukowym (bezkontaktowym) może być stosowana jako alternatywa do charakterystyki powierzchni delikatnych „miękkich” materiałów roślinnych, co pozwala uniknąć możliwych uszkodzeń spowodowanych siłami bocznymi (ścinającymi) i zdrapywaniem powierzchni próbki.5,20 W obu przypadkach sekwencyjna akwizycja wielu obrazów tego samego miejsca na powierzchni służy do zidentyfikowania ewentualnych uszkodzeń powierzchni wynikających z „oddziaływań sonda-powierzchnia” podczas pomiarów AFM.6,21 Dla uzyskania optymalnej powtarzalności należy stosować sondy AFM o stałych sprężystości odpowiednich dla miękkich powierzchni kutykularnych oraz zachować stałą temperaturę i wilgotność.6,15,20 Podczas gdy NMR w stanie stałym oferuje profil molekularny średnich właściwości ansamblowych (objętościowych) kutykul owoców pomidora, obrazowanie sił atomowych stanowi komplementarną nieinwazyjną metodę 22,23 śledzenia topografii powierzchni tych niezwykle złożonych zespołów makromolekularnych.1,2

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Niniejsza praca była finansowana ze środków Narodowej Fundacji Nauk USA (U.S. National Science Foundation) w ramach grantów nr MCB-0741914 i MCB-0843627; dodatkowe wsparcie infrastrukturalne dla The City College of New York zapewniły Narodowe Instytuty Zdrowia (National Institutes of Health) w ramach grantu 2 G12 RR03060-26 z Narodowego Centrum Zasobów Badawczych (National Center for Research Resources). Wyrażamy wdzięczność grupie J.K.C. Rose z Katedry Biologii Roślin Uniwersytetu Cornella za udostępnienie kutykul pomidora M82 (typ dziki) i CM15 (mutant). Dziękujemy dr. Spyrosowi Monastiriotisowi z grupy Inżynierii Chemicznej prof. Alexandra Couzisa w CCNY za nieocenioną pomoc w eksperymentach AFM. Dziękujemy pani Lauren Goharze za wsparcie w zakresie projektowania graficznego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Octan sodu trójwodnySigma-AldrichS8625-500G
PektynazaTCI AmericaP0026EC 3.2.1.15; 10 U ml-1, przechowywać w lodówce
CelulazaSigma-AldrichC1184-100KUEC232.734.4; 1,3 units/mg, przechowywać w lodówce
Kwas octowy lodowatySigma-AldrichA9967
Azydek soduSigma-AldrichS2002-100GNiezwykle niebezpieczny
Inkubator z wytrząsarkąNew Brunswick ScientificModel No.G24MFG No.M1036-000G
Suszarka próżniowaPrecision Scientific31566
Regulator Variac
Tygiel szklany spieczony (85 mm/25mm)VWR international89056
Jednorazowy tygiel do ekstrakcji (80 mm/25 mm)VWR international28320
MetanolVWR internationalEMD-MX0485-7
Wata szklanaVWR internationalRK20789
Folia aluminiowaFisher Scientific01-213-100
PęsetaVWR international82027-452
ChloroformVWR internationalEM-CX1050-1
HeksanFisher ScientificH302-4
Azot gazowy
ParafilmVWR international52858
Ręczniki papieroweVWR international89002-984
Ręczniki Kim wipesVWR international21905-026
Guma arabskaSigma-AldrichG9752
Rotor cyrkonowy 1,6 mm fastMASVarian Inc., Agilent
Spektrometr NMRVarian Inc., Agilentstandard bore magnet
GlicynaSigma-Aldrich50046Związek wzorcowy dla CPMAS
GlutaminaSigma-Aldrich49419Związek wzorcowy dla CPMAS
AdamantanSigma-Aldrich100277Do kalibracji impulsu 90° w NMR
Wielomodalny mikroskop sondy skanującej (Nanoscope IIIA)Digital Instruments
Oprogramowanie NanoscopeDigital InstrumentsWersja 5.30r3sr3 (2005)
Sonda AFM (nieprzewodząca końcówka z azotku krzemu)Veeco Instruments, Inc.Model NP-20
Mikroskop świetlnyDigital Instruments
Podkładka magnetycznaDigital Instruments
Taśma dwustronnaVWR international
Obieraczka do owoców
Lejek BüchneraVWR international89038

Bibliografia

  1. Dom#237;nguez, E., Heredia-Guerrero, J. A., Heredia, A. The biophysical design of plant cuticles: an overview. New Phytologist. 189, 938-949 (2011).
  2. Bargel, H., Koch, K., Cerman, Z., Neinhuis, C. Structure-function relationships of the plant cuticle and cuticular waxes - a smart material? Functional Plant Biol. 33, 893-910 (2006).
  3. Jetter, R., Schäffer, S. Chemical Composition of the Prunus laurocerasus Leaf Surface. Dynamic Changes of the Epicuticular Wax Film during Leaf Development. Plant Physiol. 126, 1725-1737 (2001).
  4. Vogg, G. Tomato fruit cuticular waxes and their effects on transpiration barrier properties: functional characterization of a mutant deficient in a very-long-chain fatty acid β-ketoacyl-CoA synthase. J. Exper. Botany. 55, 1401-1410 (2004).
  5. Isaacson, T. Cutin deficiency in the tomato fruit cuticle consistently affects resistance to microbial infection and biomechanical properties, but not transpirational water loss. Plant J. 60, 363-377 (2009).
  6. Round, A. N. The Influence of Water on the Nanomechanical Behavior of the Plant Biopolyester Cutin as Studied by AFM and Solid-State NMR. Biophysical J. 79, 2761-2767 (2000).
  7. Fung, B. M., Khitrin, A. K., Ermolaev, K. An Improved Broadband Decoupling Sequence for Liquid Crystals and Solids. J. Magn. Reson. 142, 97-101 (2000).
  8. Morcombe, C. R., Zilm, K. W. Chemical shift referencing in MAS solid state NMR. J. Magn. Reson. 162, 479-486 (2003).
  9. Fang, S. J., Haplepete, S., Chen, W., Helms, C. R., Edwards, H. Analyzing atomic force microscopy images using spectral methods. J. App. Phys. 82, 5891-5898 (1997).
  10. Pollard, M., Beisson, F., Li, Y., Ohlrogge, J. B. Building lipid barriers: biosynthesis of cutin and suberin. Trends. Plant Sci. 13, 236-246 (2008).
  11. Stark, R. E. NMR studies of structure and dynamics in fruit cuticle polyesters. Solid State Nucl. Mag. 16, 37-45 (2000).
  12. Schaefer, J., Stejskal, E. O. Carbon-13 nuclear magnetic resonance of polymers spinning at the magic angle. J. Amer. Chem. Soc. 98, 1031-1032 (1976).
  13. Sachleben, J. R., Chefetz, B., Deshmukh, A., Hatcher, P. G. Solid-State NMR Characterization of Pyrene-Cuticular Matter Interactions. Envir. Sci. & Tech. 38, 4369-4376 (2004).
  14. Zlotnik-Mazori, T., Stark, R. E. Nuclear magnetic resonance studies of cutin, an insoluble plant polyester. Macromolecules. 21, 2412-2417 (1988).
  15. Stark, R. E., Garbow, J. R. Nuclear magnetic resonance relaxation studies of plant polyester dynamics. 2. Suberized potato cell wall. Macromolecules. 25, 149-154 (1992).
  16. Bennett, A. E., Rienstra, C. M., Auger, M., Lakshmi, K. V., Griffin, R. G. Heteronuclear Decoupling in Rotating Solids. J. Chem. Phys. 103, 6951-6958 (1995).
  17. Metz, G., Wu, X. L., Smith, S. O. Ramped-Amplitude Cross-Polarization in Magic-Angle-Spinning NMR. J. Magn. Reson. Ser. A. 110, 219-227 (1994).
  18. Peersen, O. B., Wu, X. L., Smith, S. O. Enhancement of CP-MAS Signals by Variable-Amplitude Cross-Polarization - Compensation for Inhomogeneous B-1 Fields. J. Magn. Reson. Ser. A. 106, 127-131 (1994).
  19. lessandrini, A., Facci, P. AFM: a versatile tool in biophysics. Measurement Sci. & Tech. 16, 10-1088 (2005).
  20. Benítez, J. J., Matas, A. J., Heredia, A. Molecular characterization of the plant biopolyester cutin by AFM and spectroscopic techniques. J. Struct. Biol. 147, 179-184 (2004).
  21. Koch, K., Neinhuis, C., Ensikat, H. J., Barthlott, W. Self assembly of epicuticular waxes on living plant surfaces imaged by atomic force microscopy (AFM). J. Exper. Bot. 55, 711-718 (2004).
  22. Muller, D. J. AFM: A Nanotool in Membrane Biology. Biochemistry. 47, 7986-7998 (2008).
  23. Last, J. A., Russell, P., Nealey, P. F., Murphy, C. J. The Applications of Atomic Force Microscopy to Vision Science. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 6083-6094 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja kutykuliekstrakcja woskuNMR w fazie sta ejmikroskopia si atomowychsekwencyjne usuwanie woskucharakterystyka kutynyowoc pomidoraobr bka enzymatycznaekstrakcja rozpuszczalnikiem

Powiązane artykuły