$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Umieszczanie komórek
- Przed rozpoczęciem należy rozgrzać pożywkę, PBS 1X i trypsynę w łaźni wodnej w temperaturze 37°C
- Wyjąć komórki z inkubatora i odessać pożywkę.
- Delikatnie nałóż 5 ml PBS 1X na komórki, aby je umyć.
- Odessać PBS 1X i nałożyć 1 ml trypsyny zawierającej 0,025% EDTA.
- Delikatnie obróć płytkę, aby uzyskać równomierne rozprowadzenie trypsyny.
- Umieść komórki w inkubatorze w temperaturze 37°C na 5-10 minut (w zależności od typu komórek). Od czasu do czasu sprawdzaj, czy komórki nie są oderwane, potrząsając płytką.
- Ponownie zawiesić komórki w 10-20 ml pożywki i zebrać je w probówce falcona o pojemności 50 ml.
- Policz komórki za pomocą licznika Beckmana. Liczba komórek powinna być wystarczająca, aby zapewnić zbieg około 60-70%.
- Umieść komórki na płytkach i pozwól im wysiać nasiona przez 6-8 godzin.
2. Transfekcja
- Przed transfekcją podgrzać porcję podłoża niezawierającego surowicy w łaźni wodnej o temperaturze 37°C.
- Doprowadź X-treme Gene 9 do temperatury pokojowej.
- Odpipetować pożywkę wolną od surowicy do 2 probówek Eppendorfa (1 tubka = 1 transfekcja).
- Odpipetować X-treme Gene 9 w pożywce wolnej od surowicy, zwracając uwagę, aby końcówka nie dotykała plastikowej ścianki eppendorfa i inkubować przez 5 minut. W międzyczasie przygotuj dwie mieszanki DNA: w jednej probówce wymieszaj ze sobą plazmidy dla renilli, świetlika i pustego wektora kontrolnego, w drugiej probówce renilli, świetlika i molekularnego białka opiekuńczego.
- Dodaj mieszaninę DNA do każdego eppendorfa zawierającego pożywkę wolną od surowicy + X-treme Gene 9, wiruj i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
- Dodawać kroplami każdą mieszankę na każdą płytkę i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37°C i 5% CO2
3. Dzielenie komórek
- 24 godziny po transfekcji trypsynizować komórki zgodnie z opisem w 1,4 – 1,6 i rozcieńczyć je do końcowego zbiegu 60-70% na płytce 6-dołkowej.
- Przygotuj jedną płytkę do kontroli bez wstrząsów i tyle płytek, ile jest punktów czasu odzyskiwania, które mają być analizowane, jak pokazano na rys. A. Rozdział 2.
4. Szok cieplny
- W przypadku szoku cieplnego wstępnie rozgrzej serum zawierające pożywkę w łaźni wodnej o temperaturze 37°C.
- Przygotować "bufor szoku cieplnego" przez rozcieńczenie w surowicy zawierającej pożywkę cykloheksymidu do końcowego stężenia 20 μg/ml i MOPS do 20 mM.
- Teraz wyjmij płytki z inkubatora i odessaj pożywkę.
- Dodać do każdej studzienki 1 ml "buforu szoku cieplnego" i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C i 5 % CO2 (włączyć również płytkę odniesienia do tej obróbki). Spowoduje to zatrzymanie syntezy białek de novo.
- W międzyczasie włącz łaźnię wodną i ustaw temperaturę na 45°C.
- Po inkubacji uszczelnić pokrywę płytek Parafilmem uprzednio pociętym w paski. Płytkę referencyjną (100% refolowanego świetlika) pozostawia się w inkubatorze.
- Inkubować płytki w temperaturze 45°C przez 30 minut.
- Wyjąć płytki z łaźni wodnej, usunąć parafilm i umieścić płytki z powrotem w inkubatorze, aby umożliwić powrót do zdrowia.
- W każdym punkcie czasowym zbieraj komórki i myj je w PBS 1X, wirując w temperaturze 2000Xg przez 1 minutę w temperaturze 4°C.
5. Liza komórek i test lucyferazy
- Aby uzyskać wydajną lizę komórek, zatrzaskowo zamroź osad komórkowy w ciekłym azocie.
- Dodać 200 μl pasywnego buforu do lizy rozcieńczonego w stosunku 1:5 w podwójnie destylowanej wodzie w szklanej probówce.
- Dodać 30 μl lizatu komórkowego do płytki 96-dołkowej. Każdą próbkę pipetuje się trzykrotnie.
- Tylko "niewstrząszone" próbki referencyjne zostaną użyte do odczytania aktywności lucyferazy renilli, ponieważ ten etap służy do sprawdzenia jednakowej skuteczności transfekcji.
- Przygotuj roztwory do testu. Dla roztworu lucyferyny rozcieńczyć lucyferynę do końcowego stężenia 0,2 mM w buforze Gly-Gly. Dla buforu reakcyjnego rozcieńczyć DTT i ATP do 1mM stężenia końcowego w buforze Gly-Gly. W przypadku buforu reakcyjnego koelenterazyny należy rozcieńczyć koelenterazynę do końcowego stężenia 0,2 μM w buforze koelenterazyny. Roztwór lucyferyny i bufor reakcyjny koelenterazyny należy chronić światłem.
- Teraz umieść 96-dołkową płytkę w luminometrze i uruchom program "Wallac 1420 Workstation".
- Wprowadzić pompę Pump1 do probówki Falcon zawierającej roztwór celenterazyny. Zamknij pokrywę, aby światło nie mogło zetknąć się z rurką.
- Wybierz z menu opcję "Konserwacja dozownika" i zaznacz Pompa1.
- Wybierz opcję "Wypełnij".
- Aby edytować układ płyty, wybierz z menu opcję "Eksploruj protokół i wyniki". Wybierz protokół i kliknij go dwukrotnie. Teraz wybierz studnie do odczytania.
- Wróć do "Wallac Manager" i kliknij "Start". Reakcja między lucyferazy renilla a jej substratem coelenterazine emituje światło o szczytowej długości fali 482 nm.
- Po odczycie przejdź do "Konserwacja dozownika" i wybierz "Opróżnij" i Pompa1, aby uwolnić cały pozostały roztwór z powrotem do probówki.
- Teraz przenieś rurkę do rurki sokoła zawierającej wodę i zaznacz "Flush".
- Po etapie płukania opróżnij probówkę, wybierając opcję "Opróżnij".
- Umieść probówkę z Pompy1 w probówce sokoła z buforem reakcyjnym, a probówkę z Pompy2 w probówce sokoła lucyferyny.
- Zmień układ blachy.
- Wybierz "Napełnienie" dla Pompy1 i Pompy2 z menu "Konserwacja dozownika".
- Wybierz protokół i rozpocznij odczyt. Reakcja między lucyferazy świetlika a jej substratem lucyferyną emituje światło o szczytowej długości fali 560 nm.
- Pod koniec odczytu powtórz procedurę Opróżnij-Spłukuj-Pusty dla Pompy1 i Pompy2.
- Wyniki są teraz dostępne w "Wallac 1420 Explorer".
- Każdy eksperyment jest powiązany z numerem testu, nazwą użytkownika, datą rozpoczęcia i zakończenia.
- Wyniki można teraz eksportować jako plik Excel.
- Do obliczeń komórki dzieli się na trzy grupy: 1. niewstrząsowe próbki referencyjne (ustawione jako 100% ponownie złożonej lucyferazy świetlika); 2. Komórki bez molekularnego białka opiekuńczego i poddane szokowi cieplnemu; 3. Komórki z molekularnym chaperonem i szokiem termicznym.
6. Reprezentatywne wyniki
Ponowne fałdowanie białek jest bezpośrednio związane z czasem regeneracji, dlatego aby sprawdzić, czy system działa poprawnie, należy przeprowadzić test, który zbiera komórki w różnych punktach czasowych. Bezpośrednia korelacja czasu/procentu ponownego fałdowania wskazuje, że eksperyment został prawidłowo przeprowadzony i dlatego stanowi czynnik ograniczający. Należy jednak zawsze brać pod uwagę, że ponowne składanie po szoku cieplnym jest wydarzeniem nasycającym i dlatego przed rozpoczęciem jakiegokolwiek eksperymentu należy przeprowadzić odpowiednią analizę przebiegu w czasie.
Rysunek 1.
Omówienie eksperymentu. Test ponownego składania in vivo wymaga od 3 do 4 dni. W dniu 1 komórki są wysiewane i transfekowane. Następnego dnia komórki są dzielone na mniejszy format, a w dniu 3 są poddawane szokowi cieplnemu. W tym momencie możliwe jest wykonanie testu lucyferazy zaraz po pobraniu komórek lub zapisanie osadu komórkowego w temperaturze -80°C i wykonanie testu w innym momencie
Rysunek 2.
Dzielenie komórek. W dniu 2 komórki dzieli się na płytkę 6-dołkową. Każda transfekcja zostanie rozcieńczona w studzience, aby cała transfekcja znalazła się na tej samej płytce. Każda tabliczka będzie odpowiadać określonemu czasowi rekonwalescencji plus nieuszkodzona płyta odniesienia.
Rysunek 3.
Reprezentatywny dobry wynik. A. Procent ponownego fałdowania mierzony bezpośrednio przez aktywność lucyferazy świetlika. Każdy wykres słupkowy przedstawia procent ponownego fałdowania pod nieobecność (czarne paski) i w obecności (czerwone paski) molekularnego białka opiekuńczego w różnych punktach czasowych odzyskiwania. B. Korelacja między czasem a ponownym fałdowaniem pod nieobecność (linia) i w obecności (czerwona linia) opiekuna. Wartości r kwadrat wskazują na dobrą korelację.
Na Rys.3A pokazane są reprezentatywne wyniki, gdzie komórki zostały zebrane 15, 30, 45, 60 i 120 minut po szoku cieplnym pod nieobecność (czarne paski) i w obecności (czerwone paski) molekularnego białka opiekuńczego. Odsetek ponownie sfałdowanej lucyferazy wzrasta wraz z wydłużonym czasem rekonwalescencji i transfekcją molekularnego białka opiekuńczego. Pokazano korelację między ponownym fałdowaniem a czasem dla kontroli (ryc. 3B, linia) i molekularnych komórek opiekuńczych transfekowanych (ryc. 3B, czerwona linia).
Rysunek 4.
Reprezentatywny zły wynik. A. Procent ponownego fałdowania mierzony bezpośrednio przez aktywność lucyferazy. Każdy wykres słupkowy przedstawia procent ponownego fałdowania pod nieobecność (czarne paski) i w obecności (czerwone paski) molekularnego białka opiekuńczego w różnych punktach czasowych odzyskiwania. B. Korelacja między czasem a ponownym fałdowaniem pod nieobecność i w obecności (czerwona linia) opiekuna. Wartości r kwadrat wskazują na złą korelację.
Rysunek 4A. pokazuje reprezentatywny wynik eksperymentu, który nie został prawidłowo przeprowadzony. Zarówno komórki kontrolne (czarne paski), jak i molekularne komórki transfekowane chaperonem (czerwone paski) nie wykazywały wzrostu ponownego fałdowania białek w czasie. Ponadto transfekcja molekularnego białka opiekuńczego nie spowodowała wzrostu ponownego fałdowania. Ta słaba korelacja została potwierdzona na ryc. 4B, pokazując wartość r kwadrat wynoszącą odpowiednio 0,6619 i 0,1882 dla komórek kontrolnych (linia) i molekularnych komórek opiekuńczych transfekowanych (czerwona linia).