W tym protokole opisana jest metoda pomiaru ponownego fałdowania białek wewnątrzkomórkowych po szoku cieplnym. Metoda ta może być stosowana do badania fałd, takich jak molekularne białka opiekuńcze i ich kofaktory lub związki, które mogą wpływać na ich aktywność. Aktywność lucyferazy świetlika jest używana jako reporter do pomiaru aktywności ponownego fałdowania białka opiekuńczego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Test ponownego fałdowania wewnątrzkomórkowego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ten protokół opisuje metodę pomiaru aktywności enzymatycznej molekularnych białek opiekuńczych w systemie komórkowym oraz możliwych efektów związków o działaniu hamującym/stymulującym. Molekularne białka opiekuńcze są białkami zaangażowanymi w regulację fałdowania białek1 i odgrywają kluczową rolę w promowaniu przetrwania komórek w przypadku stresu, takiego jak szok cieplny2, głód składników odżywczych i narażenie na chemikalia/trucizny3. Z tego powodu stwierdzono, że białka opiekuńcze są zaangażowane w takie zdarzenia, jak rozwój nowotworu, chemiooporność komórek rakowych4 oraz neurodegeneracja5. Projektowanie małych cząsteczek zdolnych do hamowania lub stymulowania aktywności tych enzymów jest zatem jedną z najlepiej zbadanych strategii terapii nowotworów7 i zaburzeń neurodegeneracyjnych9. Opisany tutaj test daje możliwość zmierzenia aktywności ponownego fałdowania określonego molekularnego białka opiekuńczego oraz zbadania wpływu związków na jego aktywność. W tej metodzie gen badanego opiekuńczego molekularnego jest transfekowany wraz z wektorem ekspresyjnym kodującym gen lucyferazy świetlika. Opisano już, że denaturowana lucyferazy świetlika może być ponownie fałdowana przez molekularne białka opiekuńcze10,11. Jako normalizacja kontroli transfekcji transfekcja jest transfekowana wektorem kodującym gen lucyferazy renilla. Wszystkie transfekcje opisane w tym protokole są wykonywane za pomocą X-treme Gene 11 (Roche) w komórkach HEK-293. W pierwszym etapie synteza białek jest hamowana przez traktowanie komórek cykloheksymidem. Następnie rozwijanie białek jest indukowane przez szok termiczny w temperaturze 45°C przez 30 minut. Po odzyskaniu w temperaturze 37°C białka są ponownie fałdowane do swojej aktywnej konformacji, a aktywność lucyferazy świetlika jest wykorzystywana jako odczyt: im więcej światła zostanie wyprodukowane, tym więcej białka odzyska pierwotną konformację. Komórki bez szoku cieplnego są ustawione jako odniesienie (100% ponownie złożonej lucyferazy).
Protokół
1. Wysiewanie komórek
- Przed rozpoczęciem ogrzać pożywkę hodowlaną, PBS 1X oraz trypsynę w łaźni wodnej w temperaturze 37˚C
- Wyjąć komórki z inkubatora i odessać pożywkę.
- Delikatnie nanieść 5 mL PBS 1X na komórki w celu ich przemycia.
- Odessać PBS 1X i nanieść 1 mL trypsyny zawierającej 0,025% EDTA.
- Delikatnie obrócić płytkę, aby zapewnić równomierny rozkład trypsyny.
- Umieścić komórki w inkubatorze w temperaturze 37˚C na 5-10 minut (w zależności od typu komórek). Okresowo sprawdzać, czy komórki odłączyły się, potrząsając płytką.
- Resuspendować komórki w 10-20 mL pożywki i zebrać je do probówki typu falcon o pojemności 50 mL.
- Policzyć komórki za pomocą licznika Beckman. Liczba komórek powinna być wystarczająca, aby zapewnić konfluencję na poziomie około 60-70%.
- Wysiać komórki na płytki i pozostawić je do osiadania na 6-8 godzin.
2. Transfekcja
- Przed transfekcją ogrzać alikwot pożywki bezsurowiczej w łaźni wodnej w temperaturze 37˚C.
- Doprowadzić X-treme Gene 9 do temperatury pokojowej.
- Pipetować pożywkę bezsurowiczą do 2 probówek typu Eppendorf (1 probówka = 1 transfekcja).
- Dodać X-treme Gene 9 do pożywki bezsurowiczej, dbając o to, aby końcówka pipety nie dotykała plastikowej ścianki probówki Eppendorf, i inkubować przez 5 minut. W międzyczasie przygotować dwie mieszaniny DNA: w jednej probówce zmieszać plazmidy dla renilli, firefly oraz pusty wektor kontrolny, a w drugiej probówce renillę, firefly oraz chaperonę molekularną.
- Dodać mieszaninę DNA do każdej probówki Eppendorf zawierającej pożywkę bezsurowiczą z X-treme Gene 9, wymieszać w wstrząsaczu wirowym i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
- Każdą mieszaninę dodawać kroplami na odpowiednie płytki, a następnie inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37°C i 5% CO2.
3. Pasażowanie komórek
- 24 godziny po transfekcji poddaj komórki trypsynizacji zgodnie z opisem w punktach 1.4 – 1.6, a następnie rozcieńcz je do końcowej konfluencji 60-70% w płytce 6-dołkowej.
- Przygotuj jedną płytkę dla kontroli bez szoku oraz tyle płytek, ile punktów czasowych regeneracji ma zostać poddanych analizie, zgodnie z przedstawionym na Rys. 2.
4. Szok termiczny
- W celu przeprowadzenia szoku termicznego uprzednio ogrzać pożywkę z surowicą w łaźni wodnej w temperaturze 37˚C.
- Przygotować „bufor do szoku termicznego” poprzez rozcieńczenie w pożywce z surowicą cykloheksymidu do stężenia końcowego 20 µg/ml oraz MOPS do stężenia 20 mM.
- Wyjąć płytki z inkubatora i odessać pożywkę.
- Do każdego dołka dodać 1 mL „buforu do szoku termicznego” i inkubować przez 30 minut w 37˚C i 5% CO2 (płytkę referencyjną również poddać tej procedurze). Spowoduje to zatrzymanie syntezy białek de novo.
- W tym czasie włączyć łaźnię wodną i ustawić temperaturę na 45˚C.
- Po inkubacji uszczelnić pokrywy płytek wcześniej pociętym w paski Parafilmem. Płytkę referencyjną (100% sfałdowanej lucyferazy) pozostawić w inkubatorze.
- Inkubować płytki w 45˚C przez 30 minut.
- Wyjąć płytki z łaźni wodnej, usunąć Parafilm i umieścić płytki z powrotem w inkubatorze w celu regeneracji.
- W każdym wyznaczonym punkcie czasowym zebrać komórki i przemyć je w PBS 1X, wirując przy 2000Xg przez 1 minutę w 4˚C.
5. Liza komórek i pomiar aktywności lucyferazy
- Aby zapewnić efektywną lizę komórek, pellet komórkowy należy gwałtownie zamrozić w ciekłym azocie.
- Do probówki szklanej dodać 200 µl buforu do lizy pasywnej rozcieńczonego 1:5 w wodzie dwukrotnie destylowanej.
- Do płytki 96-dołkowej nanieść 30 µl lizatu komórkowego. Każda próbka jest pipetowana w trzech powtórzeniach.
- Tylko próbki referencyjne „niepoddane szokowi” (non shocked) zostaną wykorzystane do pomiaru aktywności lucyferazy renilla, ponieważ etap ten służy do sprawdzenia równomierności wydajności transfekcji.
- Przygotować roztwory do analizy. W przypadku roztworu lucyferyny rozcieńczyć lucyferynę do stężenia końcowego 0,2 mM w buforze Gly-Gly. W przypadku buforu reakcyjnego rozcieńczyć DTT i ATP do stężenia końcowego 1 mM w buforze Gly-Gly. Dla buforu reakcyjnego coelenterazyny rozcieńczyć coelenterazynę do stężenia końcowego 0,2 µM w buforze coelenterazyny. Roztwór lucyferyny oraz bufor reakcyjny coelenterazyny należy przechowywać w warunkach chroniących przed światłem.
- Następnie umieścić płytkę 96-dołkową w luminometrze i uruchomić program „Wallac 1420 Workstation”.
- Zanurzyć końcówkę Pump1 w probówce typu falcon zawierającej roztwór coelenterazyny. Zamknąć pokrywkę, aby do probówki nie docierało światło.
- Z menu wybrać opcję „Dispenser maintenance” i zaznaczyć Pump1.
- Wybrać opcję „Fill”.
- Aby edytować układ płytki, wybrać w menu opcję „Explore protocol and results”. Wybrać odpowiedni protokół i kliknąć go dwukrotnie. Następnie zaznaczyć dołki, które mają zostać odczytane.
- Powrócić do „Wallac Manager” i kliknąć „Start”. Reakcja lucyferazy renilla z jej substratem, coelenterazyną, emituje światło o długości fali szczytowej 482 nm.
- Po odczycie przejść do „Dispenser maintenance”, wybrać „Empty” oraz Pump1, aby odprowadzić cały pozostały roztwór z powrotem do probówki.
- Przenieść końcówkę do probówki typu falcon zawierającej wodę i zaznaczyć „Flush”.
- Po etapie płukania opróżnić probówkę, wybierając „Empty”.
- Umieścić końcówkę Pump1 w probówce typu falcon z buforem reakcyjnym, a końcówkę Pump2 w probówce typu falcon z lucyferyną.
- Zmienić układ płytki.
- W menu „Dispenser Maintenance” wybrać „Fill” dla Pump1 oraz Pump2.
- Wybrać protokół i rozpocząć odczyt. Reakcja lucyferazy Firefly z jej substratem, lucyferyną, emituje światło o długości fali szczytowej 560 nm.
- Po zakończeniu odczytu powtórzyć procedurę Empty-Flush-Empty dla Pump1 oraz Pump2.
- Wyniki są teraz dostępne w programie „Wallac 1420 Explorer”.
- Każdy eksperyment jest powiązany z numerem analizy, nazwą użytkownika oraz datą rozpoczęcia i zakończenia.
- Wyniki można teraz wyeksportować do pliku Excel.
- Do obliczeń komórki podzielono na trzy grupy: 1. próbki referencyjne niepoddane szokowi (przyjęte jako 100% zrefoldowanej lucyferazy firefly); 2. komórki bez chaperonów molekularnych poddane szokowi termicznemu; 3. komórki z chaperonami molekularnymi poddane szokowi termicznemu.
6. Reprezentatywne wyniki
Renaturacja białek jest bezpośrednio związana z czasem regeneracji, dlatego w celu sprawdzenia, czy układ działa prawidłowo, należy przeprowadzić test, pobierając komórki w różnych punktach czasowych. Bezpośrednia korelacja między czasem a procentem renaturacji wskazuje, że eksperyment został przeprowadzony prawidłowo i że czas ten stanowi czynnik ograniczający. Należy jednak zawsze brać pod uwagę, że renaturacja po szoku termicznym jest zjawiskiem nasycalnym, w związku z czym przed rozpoczęciem jakiegokolwiek eksperymentu należy przeprowadzić właściwą analizę przebiegu czasowego.
Rycina 1.
Przegląd eksperymentu. Test refoldingu in vivo trwa od 3 do 4 dni. W dniu pierwszym komórki są wysiewane i poddawane transfekcji. Następnego dnia komórki są przesiewane do mniejszego formatu, a w dniu trzecim poddawane szokowi termicznemu. Na tym etapie możliwe jest przeprowadzenie testu lucyferazy bezpośrednio po zebraniu komórek lub zamrożenie osadu komórkowego w temperaturze -80°C i wykonanie testu w innym terminie.
Rysunek 2.
Pasażowanie komórek. W 2. dniu komórki są przesiewane do płytki 6-dołkowej. Każda transfekcja zostanie rozcieńczona w osobnym dołku, aby wszystkie transfekcje znajdowały się na tej samej płytce. Każda płytka będzie odpowiadać określonemu czasowi regeneracji, oprócz płytki referencyjnej bez szoku.
Rycina 3.
Reprezentatywny poprawny wynik. A. Procent renormalizacji mierzony bezpośrednio za pomocą aktywności lucyferazy świetlikowej. Każdy wykres słupkowy przedstawia procent renormalizacji w nieobecności (czarne słupki) i w obecności (czerwone słupki) chaperonu molekularnego w różnych punktach czasowych regeneracji. B. Korelacja między czasem a renormalizacją w nieobecności (czarna linia) i w obecności (czerwona linia) chaperonu. Wartości r kwadrat wskazują na dobrą korelację.
Na Rys. 3A przedstawiono reprezentatywne wyniki, w których komórki zbierano 15, 30, 45, 60 i 120 minut po szoku termicznym w obecności (czerwone słupki) i w nieobecności (czarne słupki) chaperonu molekularnego. Procent zrefoldowanej lucyferazy wzrasta wraz z wydłużeniem czasu rekonwalescencji oraz po transfekcji chaperonem molekularnym. Przedstawiono korelację między refoldingiem a czasem dla grupy kontrolnej (Rys. 3B, czarna linia) oraz dla komórek transfekowanych chaperonem molekularnym (Rys. 3B, czerwona linia).
Rycina 4.
Reprezentatywny nieprawidłowy wynik. A. Procent refoldingu mierzony bezpośrednio za pomocą aktywności lucyferazy. Każdy wykres słupkowy przedstawia procent refoldingu w przypadku braku (słupki czarne) oraz obecności (słupki czerwone) chaperonu molekularnego w różnych punktach czasowych regeneracji. B. Korelacja między czasem a refoldingiem w przypadku braku oraz obecności (linia czerwona) chaperonu. Wartości r-kwadrat wskazują na słabą korelację.
Rysunek 4A. przedstawia reprezentatywny wynik niewłaściwie przeprowadzonego eksperymentu. Zarówno w grupie kontrolnej (czarne słupki), jak i w komórkach z transfekcją chaperony molekularnej (czerwone słupki) nie odnotowano wzrostu refoldingu białka w czasie. Ponadto transfekcja chaperony molekularnej nie doprowadziła do zwiększenia poziomu refoldingu. Ta słaba korelacja jest potwierdzona na Rys. 4B, gdzie wartości r-kwadrat wynoszą odpowiednio 0,6619 dla grupy kontrolnej (czarna linia) i 0,1882 dla komórek z transfekcją chaperony molekularnej (czerwona linia).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W pracy przedstawiono protokół pomiaru wewnątrzkomórkowej aktywności fałdowania molekularnych białek opiekuńczych. Cały test można przeprowadzić w ciągu 3 do 4 dni, jak pokazano na przeglądzie na ryc. 1.
Solidność i liniowość sygnału świetlnego wytwarzanego przez świetlika i lucyferazy renilla stanowią solidną podstawę dla odtwarzalności protokołu.
Krytycznym etapem testu jest wybór skutecznego odczynnika do transfekcji, aby zapewnić nadekspresję...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Danilo Maddalo jest laureatem stypendium badawczego jako Young Investigator Group (YIG) z Instytutu Technologii w Karlsruhe.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
Do tego eksperymentu użyto luminometru z Luminometru Perkin Elmer '1420 Luminescence Counter' Vector Light′ | |||
Renilla: Pompa 1, 100 μ l iniekcja | |||
Bufor reakcyjny: Pump1, 70 μ l wstrzyknięcie | |||
Lucyferyna: Pump2, 30μ l wtrysk | |||
Dla przygotuj te roztwory podstawowe w wodzie podwójnie destylowanej: | |||
| |||
GLY-GLY-buffer: | |||
| |||
Na 1 litr użyj 3,3 g glicyloglicyny, 15 ml roztworu 1M MgSO4 i 8 ml 0,5 M roztworu EGTA. Rozpuścić w wodzie, dostosować pH do 7,8 i doprowadzić do całkowitej objętości 1 litra. | |||
Bufor reakcyjny dla Renilla/C– bufor lenterazine: | |||
| |||
Na 1 litr użyj 13,4ml roztworu 1M KH2PO4, 86,6ml 1M K2HPO4, 100 ml 5M roztworu NaCl i 2 ml 0,5M roztworu EDTA. | |||
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X) | GIBCO | 41966029 | |
| Płodowa surowica bydlęca Gold | PAA | A15-151 | |
| X-treme Gen 9 Odczynnik do transfekcji DNA | Roche | 06365809001 | |
| PBS Dulbecco's Fosforan buforowany Saline 1X | GIBCO | 14190-094 | |
| MOPS 3-(N-Morfolino)Kwas propanosulfonowy | SIGMA-ALDRICH | M1254 | |
| Cykloheksymid | SIGMA-ALDRICH | C7698 | |
| Pasywny bufor do lizy 5X | Promega | E194A | |
Glycylglycin EGTA MgSO4 (MgSO4*7H2O) | SIGMA-ALDRICH Roth Roth | Roth G7278 3054.2 P027.1 | |
KH2PO4 K2HPO4 (K2HPO4*3H2O) NaCl EDTA | Roth Roth Roth Roth | 3904.1 6878.2 3957.1 8043.1 | |
| Luciferin Firefly | Biosynth | L8200 | |
| C– lenterazyna | Biosynth | C7000 | |
| DTT (Ditiothreitol) | Roth | 6908.2 | |
| ATP (trifosforan adenozyny) | Roche | 10519987001 |
Bibliografia
- Bukau, B., Weissman, J., Horwich, A. Molecular chaperones and protein quality control. Cell. 125, 443-443 (2006).
- Ritossa, F. Discovery of the heat shock response. Cell Stress Chaperones. 1, 97-97 (1996).
- Hendrick, J. P., Hartl, F. U. Molecular chaperone functions of heat-shock proteins. Annu. Rev. Biochem. 62, 349-349 (1993).
- Fuqua, S. A. Heat shock proteins and drug resistance. Breast. Cancer. Res. Treat. 32, 67-67 (1994).
- Guzhova, I., Margulis, B. Hsp70 chaperone as a survival factor in cell pathology. Int. Rev. Cytol. 254, 101-101 (2006).
- Whitesell, L., Lindquist, S. L. HSP90 and the chaperoning of cancer. Nat. Rev. Cancer. 5, 761-761 (2005).
- Konstantinopoulos, P. A., Papavassiliou, A. G. 17-AAG: mechanisms of antitumour activity. Expert. Opin. Investig. Drugs. 14, 1471-1471 (2005).
- Galluzzi, L., Giordanetto, F., Kroemer, G. Targeting HSP70 for cancer therapy. Mol. Cell. 36, 176-176 (2009).
- Ozacmak, V. H., Barut, F., Ozacmak, H. S. Melatonin provides neuroprotection by reducing oxidative stress and HSP70 expression during chronic cerebral hypoperfusion in ovariectomized rats. J. Pineal. Res. 47, 156-156 (2009).
- Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. DnaK, DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage. EMBO. J. 12, 4137-41 (1993).
- Thulasiraman, V., Matts, R. L. Effect of geldanamycin on the kinetics of chaperone-mediated renaturation of firefly luciferase in rabbit reticulocyte lysate. Biochemistry. 35, 13443-13443 (1996).
- Howarth, J. L. Hsp40 molecules that target to the ubiquitin-proteasome system decrease inclusion formation in models of polyglutamine disease. Mol. Ther. 15, 1110-1110 (2007).
- Nollen, E. A. Bag1 functions in vivo as a negative regulator of Hsp70 chaperone activity. Mol. Cell. Biol. 20, 1083-1083 (2000).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
