Transplantacja komórek linii zarodkowej i ksenoprzeszczepy tkanki jądra u myszy

Podsumowanie

Opisano protokoły transplantacji komórek linii płciowej oraz ksenoprzeszczepów tkanki jądra. Transplantacja komórek linii płciowej prowadzi do spermatogenezy pochodzącej od dawcy w jądrach biorcy i stanowi funkcjonalny test rekonstytucji służący do identyfikacji komórek macierzystych spermatogoniów (SSCs). Ksenoprzeszczepy tkanki jądra odtwarzają rozwój jądra oraz spermatogenezę różnych gatunków dawców u myszy biorców.

Streszczenie

Przeszczepianie komórek linii zarodkowej zostało opracowane przez dr. Ralpha Brinstera i współpracowników z University of Pennsylvania w 1994 roku^1,2. Te przełomowe badania wykazały, że mikroiniekcja komórek linii zarodkowej od płodnych myszy donora do kanalików nasiennych bezpłodnych myszy biorcy prowadzi do spermatogenezy pochodzącej od donora i produkcji plemników przez zwierzę biorcę². Wykorzystanie samców donora niosących bakteryjny gen β-galaktozydazy pozwoliło na identyfikację spermatogenezy pochodzącej od donora oraz przekazanie haplotypu donora potomstwu zwierząt biorców¹. Co zaskakujące, po przeszczepieniu do światła kanalików nasiennych, przeszczepione komórki linii zarodkowej były w stanie przemieścić się z przedziału światła do błony podstawnej, w której znajdują się spermatogonia³. Powszechnie przyjmuje się, że tylko SSC są w stanie skolonizować niszę i przywrócić spermatogenezę w jądrze biorcy. Zatem przeszczepianie komórek linii zarodkowej stanowi funkcjonalne podejście do badania niszy komórek macierzystych w jądrze oraz charakterystyki domniemanych komórek macierzystych spermatogonialnych. Do dziś przeszczepianie komórek linii zarodkowej jest wykorzystywane do wyjaśniania podstawowej biologii komórek macierzystych, wytwarzania zwierząt transgenicznych poprzez manipulacje genetyczne komórek linii zarodkowej przed przeszczepieniem^4,5, badania interakcji między komórkami Sertolego a komórkami linii zarodkowej^6,7, homingu i kolonizacji SSC^3,8, a także samoodnowy i różnicowania SSC^9,10.

Przeszczepy komórek linii zarodkowej są możliwe również u dużych gatunków¹¹. W ich przypadku głównymi zastosowaniami są zachowanie płodności, rozpowszechnianie elitycznej genetyki w populacjach zwierząt oraz generowanie zwierząt transgenicznych, ponieważ badanie spermatogenezy i biologii SSC za pomocą tej techniki jest logistycznie trudniejsze i bardziej kosztowne niż u gryzoni. Przeszczepienie komórek linii zarodkowej dużych gatunków do kanalików nasiennych myszy prowadzi do kolonizacji komórek dawcy i ekspansji spermatogonialnej, ale nie do ich pełnego różnicowania, co prawdopodobnie wynika z niekompatybilności somatycznego komponentu komórkowego biorcy z komórkami linii zarodkowej gatunków odległych filogenetycznie¹². Alternatywnym podejściem jest przeszczepienie komórek linii zarodkowej dużych gatunków wraz z otaczającym je komponentem somatycznym. W 2002 roku po raz pierwszy zgłosiliśmy, że małe fragmenty tkanki jądra niedojrzałych samców przeszczepione pod skórę grzbietową myszy z niedoborem odporności są w stanie przetrwać i przejść pełny rozwój z produkcją plemników zdolnych do zapłodnienia¹³. Od tego czasu wykazano, że ksenoprzeszczepy tkanki jądra odnoszą sukces u wielu gatunków i stały się cenną alternatywą do badania rozwoju jąder oraz spermatogenezy dużych zwierząt u myszy¹⁴.

Protokół

CZĘŚĆ A. Transplantacja komórek zarodkowych u myszy

1. Przygotowanie myszy biorców

1. Odbiorcy powinni być immunologicznie tolerancyjni na komórki jąder dawcy (poprzez dopasowanie genetyczne do dawców lub niedobór odporności).
2. Odbiorcy powinni być albo naturalnie pozbawieni spermatogenezy (np. myszy W/ W^v), albo pozbawieni endogennych komórek zarodkowych. Deplecja komórek zarodkowych może zostać osiągnięta poprzez napromieniowanie lub zastosowanie leków chemioterapeutycznych, takich jak Busulfan. W niniejszym protokole opisujemy metodę przygotowania myszy biorców z użyciem Busulfanu.
3. Odbiorców w wieku 4-6 tygodni należy traktować poprzez wstrzyknięcie Busulfanu drogą i.p. Optymalna dawka Busulfanu zależy od szczepu. W powszechnie stosowanych szczepach biorców dawka 40-50 mg/kg jest wystarczająca do usunięcia endogennych komórek zarodkowych (np. 44 mg/kg dla myszy nude, 50 mg/kg dla biorców B6/129 F1).
4. Proszek Busulfanu należy rozpuścić w DMSO, a następnie dodać taką samą objętość sterylnej wody destylowanej, aby uzyskać końcowe stężenie 4 mg/ml. Przed użyciem roztwór należy utrzymać w temperaturze 35-40°C, aby zapobiec wytrąceniu się Busulfanu. W przypadku zaobserwowania wytrącania roztwór należy odrzucić.
5. Po podaniu Busulfanu należy odczekać co najmniej miesiąc przed wykorzystaniem biorców. Biorców można wykorzystać w okresie od 1 do 3 miesięcy po leczeniu Busulfanem.

2. Przygotowanie pipet do mikroiniekcji

1. Wybierz pipety z szkła borokrzemianowego (rurki kapilarne) o średnicy zewnętrznej 1,0 mm, średnicy wewnętrznej 0,75 mm i długości 3 cali.
2. Zasylikonizuj szklane pipety za pomocą Sigmacote, przepłucz je metanolem i osusz strumieniem powietrza.
3. Wyciągnij końcówki pipet za pomocą wyciągacza do pipet. Różne urządzenia do wyciągania pipet mają różne ustawienia, dlatego należy przetestować kilka wariantów. Zazwyczaj skuteczne mogą być ustawienia zbliżone do tych, których używa się do tworzenia pipet do enukleacji.
4. Przed użyciem przełam końcówki pipet pod mikroskopem stereoskopowym, aby uzyskać średnicę końcówki wynoszącą około 50 μm.

3. Przygotowanie komórek donora do transplantacji

1. Wybór szczepu dawcy zależy od badanego pytania badawczego. Jeśli punktem końcowym jest kwantyfikacja spermatogenezy, należy użyć dawców z łatwo identyfikowalnym markerem genetycznym, takim jak Lac-Z (np. B6.129S7-Gt(ROSA)26Sor/J z Jackson Laboratory) lub GFP (np. C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J z Jackson Laboratory).
2. Przygotować 7 ml kolagenazy w DMEM w stężeniu 1 mg/ml, 4 ml trypsyny-EDTA (0,25% trypsyny oraz 1mM EDTA) oraz 2 ml DNazy w DMEM w stężeniu 7 mg/ml. Taka ilość wystarczy do strawienia jąder dwóch myszy dawców.
3. Pobrać jądra w warunkach aseptycznych i usunąć tunica albuginea. Delikatnie rozdzielić kanaliki nasienne za pomocą precyzyjnej pęsety, aby ułatwić trawienie enzymatyczne.
4. Przenieść kanaliki do kolagenazy, inkubować w 37 °C przez 5-10 min i często mieszać.
5. Przemyć kanaliki dwukrotnie poprzez wirowanie (200-300 g przez 3 min) i ponowne zawieszenie w PBS bez Ca²⁺⁺.
6. Ponownie zawiesić kanaliki w trypsynie-EDTA i wstrząsać, aż staną się lepkie i mętne. Monitorować trawienie kanalików w 37 °C; powinno ono nastąpić w ciągu 1-2 min.
7. Dodać DNazę i dobrze wymieszać. Inkubować przez 1-2 min.
8. Dodać 3 ml FBS, aby zatrzymać działanie enzymów.
9. Przefiltrować zawiesinę komórkową przez nylonową siatkę o rozmiarze oczek 40-70 μm w celu usunięcia fragmentów komórek i tkanki.
10. Zebrać komórki przez wirowanie przy 600 g przez 5 min i zawiesić je w niewielkiej ilości DMEM (<100 μl).
11. Policzyć komórki i dostosować objętość do pożądanego stężenia końcowego (zazwyczaj 100 x 10⁶). Przed użyciem przechowywać zawiesinę komórkową na lodzie.
12. Do każdego jądra myszy traktowanej busulfanem należy wprowadzić jedynie 10-15 μl zawiesiny komórkowej. Ze względu na potencjalne straty i wycieki, należy przygotować 30-50 μl na jedno jądro.

4. Procedura transplantacji (Rycina 1)

1. Zanestezuj zwierzęta biorące udział w badaniu zgodnie z zatwierdzonymi protokołami.
2. Ułóż zwierzę w pozycji grzbietnej i przygotuj chirurgicznie obszar brzucha. Wykonaj cięcie w linii środkowej brzucha o długości ok. 1 cm, aby odsłonić ścianę brzuszną. Unieś ścianę brzuszna za pomocą małej pęsety w obrębi białej linii, aby uniknąć przypadkowego uszkodzenia narządów brzusznych, a następnie wykonaj nacięcie o długości ok. 0,5 cm w linii środkowej ściany brzusznej, aby odsłonić jamę otrzewnej.
3. Użyj jednej pęsety irydowej do podtrzymywania ściany brzusznej, a drugiej pary pęset irydowych do zlokalizowania poduszeczek tłuszczowych przytwierdzonych do najądrza i jądra w jamie otrzewnej. Delikatnie wyciągnij poduszkę tłuszczową, aż jądro zostanie wyewagowane, a tętnica jawodząca i najądrze staną się wyraźnie widoczne. Pracuj na jednym jądrze naraz.
4. Pod poduszkę tłuszczową/jądro można włożyć cienką, sterylną ściereczkę wykonaną z autoklawowanych kart indeksowych w celu lepszej identyfikacji wizualnej (opcjonalnie). Ściereczka służy również do wchłaniania płynów.
5. Dodaj kroplę barwnika Trypan Blue do zawiesiny komórkowej, a następnie ostrożnie wprowadź zawiesinę do polietylenowej rurki połączonej z strzykawką 1 ml. Podłącz dociętą pipetę do rurki i delikatnie wprowadź zawiesinę komórkową do pipety, wywierając nacisk na tłok strzykawki.
6. Zidentyfikuj przewody odprowadzające (łączące jądro z najądrzem) i delikatnie usuń tkankę tłuszczową wokół przewodów. Postępuj ostrożnie, ponieważ przewody i otaczająca je błona są półprzezroczyste.
7. Ostrożnie wprowadź pipetę do jednego z przewodów w pęczku przewodów odprowadzających, delikatnie przesuwając ją o kilka mm w kierunku jądra.
8. Utrzymując pipetę iniekcyjną w miejscu, chwyć strzykawkę i delikatnie naciśnij tłok, aby zapewnić przepływ zawiesiny do sieci jądra (rete testis), tak aby kanaliki jawodzące zaczęły się wypełniać.
9. Szybkość iniekcji i przepływ zawiesiny komórkowej reguluje się naciskiem kciuka. Unikaj nagłych wzrostów ciśnienia; monitoruj ruch zawiesiny w kanalikach.
10. Przerwij iniekcję, gdy prawie wszystkie kanaliki powierzchniowe zostaną wypełnione, zanim jądro zacznie wykazywać objawy niedokrwienia.
11. Wprowadź jądro z powrotem do jamy brzusznej. Powtórz procedurę na przeciwległym jądrze. Zaszyj ścianę brzuszna szwem jedwabnym 6-0 i zamknij skórę metalnymi klamrami chirurgicznymi. Monitoruj myszy na podgrzewanej podkładce aż do pełnego wybudzenia.

5. Analiza jąder biorcy

1. Odczekać 2-4 miesiące po transplantacji przed przystąpieniem do analizy.
2. Uśmiercić mysz biorcy zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt, a następnie pobrać jądro oraz najduszkę do PBS. W przypadku zastosowania transgenicznej linii dawcy Lac-Z, najduszkę można wykorzystać jako pozytywną kontrolę barwienia ze względu na endogeniczną aktywność beta-galaktozydazy.
3. W celu wykrycia komórek dawcy za pomocą barwienia Lac-Z, utrwalić jądro przez 1-2 godziny w temperaturze 4 °C w 4% paraformaldehydzie (PFA) w PBS. Płukać 3 x 30 min w temperaturze pokojowej w buforze płuczącym lacZ.
4. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w roztworze barwiącym lacZ. Jądro można barwić w całości lub po rozproszeniu kanalików.
5. Utrwalić i przechowywać w 10% neutralnej buforowanej formalinie. Jeśli wymagane są przekroje, zastosować neutral fast red jako barwnik kontrastowy.

CZĘŚĆ B. Ektopowy przeszczep ksenogeniczny u myszy

(Na podstawie Dobrinski i Rathi 2008¹⁵ oraz Rodriguez-Sosa et al. 2011¹⁶).

1. Pobieranie tkanki od dawcy

1. Pozyskać tkankę jąder poprzez kastrację lub biopsję od samca dawcy.
2. Umieścić jądra w PBS, a biopsjaty w pożywce hodowlanej, zachowując warunki sterylne.
3. Przechowywać pobraną tkankę w lodzie i przetransportować do laboratorium.

2. Przygotowanie tkanki dawcy

1. Procedurę należy przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza, aby zachować sterylność.
2. Każdy jądro należy przemyć dwa lub trzy razy w lodowatym PBS z dodatkiem antybiotyków przed przeniesieniem do naczynia hodowlanego z PBS. W przypadku biopsji fragmenty jądra należy przemyć dwa lub trzy razy lodowatą pożywką hodowlaną z antybiotykami, wirując przy 150g przez 2 min i resuspendując w świeżej lodowatej pożywce hodowlanej.
3. W przypadku całych jąder należy usunąć błonę pochwy poprzez wykonanie nacięcia wzdłuż powierzchni i wysunięcie jądra. Należy usunąć z jądra wszystkie struktury przyległe (sznur nasienny, najdusiek, tkankę łączną). Jądra należy przemyć raz w zimnym PBS i przenieść do naczynia hodowlanego z PBS.
4. Należy ostrożnie usunąć białą błonę jądra, używając ostrza skalpela i nożyczek. Jeśli jądro jest bardzo małe, błonę można usunąć, wyciskając tkankę jądra przez małe nacięcie wykonane na jednym końcu, trzymając błonę małą pęsetą na drugim końcu.
5. W zależności od wielkości jądra, całą tkankę jądra można pociąć na małe fragmenty o rozmiarze około 1 - 2 mm³ za pomocą zakrzywionej pęsety i ostrza skalpela lub najpierw wyciąć duże fragmenty tkanki jądra, a następnie pociąć je na mniejsze części. Wszystkie te czynności powinny być wykonywane w lodowatej pożywce hodowlanej, w warunkach sterylnych, w małym naczyniu hodowlanym (60 x15 mm).
6. Przygotowane fragmenty tkanki należy przenieść do lodowatej pożywki hodowlanej w małych naczyniach hodowlanych i przechowywać na lodzie do momentu przeszczepienia.

3. Kastracja myszy biorcy

1. Zanestezjować mysz zgodnie z powyższą procedurą i przygotować steryle pole operacyjne poprzez przystrzyżenie włosów (nie jest to konieczne w przypadku myszy nagi), a następnie przemycie skóry 70% Ethanol i roztworem Betadine.
2. Wykonać nacięcie skóry o długości 0,5-1 cm wzdłuż linii środkowej brzucha, aby odsłonić ścianę brzuszną.
3. Ostrożnie odsłonić jądro, tętnicę jądrową i najduszkę zgodnie z opisem w Części A, 4.2-4.3.
4. Oddzielić ogon najduszki od gubernaculum za pomocą rozczepiania tępego.
5. Podwiązać jedwabną nicią tętnicę jądrową oraz przewód nasienny wraz z naczyniem krwionośnym, a następnie przeciąć podwiązane struktury pomiędzy jądrem a wiązaniem.
6. Powtórzyć procedurę dla drugiego jądra.
7. Zeszyć ścianę brzuszną za pomocą jednego lub dwóch szwów chirurgicznych.
8. Zamknąć nacięcie skóry za pomocą jednego lub dwóch klipsów Michela.

4. Ektopowe przeszczepianie ksenogeniczne

1. Ułóż mysz w pozycji brzusznej i przygotuj jałowe pole operacyjne na grzbiecie zgodnie z powyższą procedurą.
2. W zależności od liczby planowanych przeszczepów (zazwyczaj 4-8 na mysz), wykonaj nacięcia skóry o długości ok. 0,5 cm po obu stronach linii środkowej grzbietu myszy.
3. Używając pęsety, uchwyć brzeg nacięcia skóry i wytwórz jamę podskórną, rozdzielając tkankę łączną za pomocą nożyczek.
4. Za pomocą pęsety irydowej umieść fragment tkanki jądra głęboko w jamie podskórnej, podtrzymując brzeg nacięcia skóry drugą pęsetą irydową.
5. Zamknij nacięcie skóry jednym klipsem Michela i trzymaj mysz na podkładce grzewczej do momentu rozpoczęcia wybudzania z anestezji.
6. Przenieś mysz do klatki z dodatkową izolacją i przykryciem; monitoruj zwierzę aż do pełnego wybudzenia.

5. Pobieranie ksenoprzeszczepów jąder do analizy oraz pozyskiwanie plemników

1. Poddać mysz gospodarza eutanazji zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania, a następnie wykonać nacięcie skóry wzdłuż linii środkowej pleców od ogona do karku i rozchylić skórę. Pozwala to na odsłonięcie przeszczepów, które mogą znajdować się w tkance podskórnej lub być przytwierdzone do skóry.
2. Ostrożnie usunąć przeszczepy, używając pęsety i nożyczek.
3. Zanotować liczbę odzyskanych przeszczepów, ich rozmiar oraz wagę każdego z nich.
4. Wyjąć pęcherzyki nasienne z jamy brzusznej myszy i zanotować ich wagę jako wskaźnik produkcji testosteronu przez tkankę przeszczepioną.
5. W celu analizy histologicznej
   1. Umieścić ksenoprzeszczepy w probówce z roztworem Bouina (lub innym utrwalaczem) w objętości około 10x większej niż objętość ksenoprzeszczepu i odpowiednio oznakować probówkę.
   2. Inkubować przez noc w lodówce, a następnie przemyć co najmniej 3 razy w 70% etanolu, najlepiej w odstępach 24-godzinnych.
   3. Przejść do etapu przetwarzania i zatopienia w parafinie.
6. W celu pozyskania plemników
   1. Przemyć ksenoprzeszczepy, wirując je przy 300g przez 1 min i resuspendując w pożywce hodowlanej z antybiotykami.
   2. Pokroić przeszczepy na małe kawałki i starannie rozdrobić pęsetą w naczyniu do hodowli tkanek zawierającym 3 - 5 ml pożywki hodowlanej.
   3. Przefiltrować rozdrobnioną tkankę przez sitko komórkowe o rozmiarze oczek 40 μm.

CZĘŚĆ C. Reprezentatywne wyniki

1. Transplantacja komórek zarodkowych

Jeśli przeszczepiona zawiesina komórek dawcy zawiera spermatogonialne komórki macierzyste z markerem genetycznym, takim jak transgen LacZ, kolonizację SSCs dawcy w jądrze biorcy można zwizualizować za pomocą barwienia X-gal jako charakterystyczne niebieskie segmenty kanalików nasiennych 2-3 miesiące po transplantacji³ (Rycina 2A). Dobrze rozwinięta kolonia powinna posiadać długi, ciemnoniebieski odcinek całkowicie wypełnionych segmentów z dwiema lub więcej warstwami niebieskich komórek bliżej centrum oraz regiony o słabszym barwieniu na obu końcach, gdzie widoczna jest sieć pojedynczych, sparowanych lub małych grup niebieskich komórek³ (Rycina 2B). Przekrój poprzeczny ciemnoniebieskiego regionu kanalików nasiennych powinien ukazać dobrze rozwiniętą i zorganizowaną spermatogenezę z niebieskimi komórkami zarodkowymi na różnych etapach różnicowania (Rycina 2C).

2. Ksenoprzeszczep tkanki jądra

Żywotność tkanki jądr po transplantacji jest odwrotnie skorelowana ze stopniem rozwoju dawcy; najlepsze wyniki uzyskuje się przy zastosowaniu tkanki pochodzącej od noworodków płci męskiej, podczas gdy tkanka dorosłych wykazuje wysoką tendencję do degeneracji i obumierania^17-21. Generalnie sukces ksenoprzeszczepu maleje w miarę, jak tkanka dawcy przechodzi mejozę w pierwszej fali spermatogenezy. Czas do pełnego rozwoju niedojrzałej tkanki dawcy i całkowitej spermatogenezy jest specyficzny dla gatunku i często nieco krótszy w porównaniu z jądrami in situ. Liczba kanalików nasiennych z pełną spermatogenezą jest zmienna w zależności od gatunku. O ile u owiec, kóz i świń liczba ta przekracza 50%, o tyle u bydła i kotów jest ona mniejsza niż 15% ¹⁴(Rysunek 3).

Rycina 1. Procedura transplantacji komórek linii zarodkowej. Po podaniu znieczulenia ułożyć biorców w pozycji na plecach i wykonać nacięcie w linii środkowej brzucha o długości ok. 0,4 cala (A). Odsłonić jądro, odsuwając tkankę tłuszczową przytwierdzoną do najądrza i jądra, a pod tkankę tłuszczową/jądro wsunąć cienką jałową serwetkę, aby ułatwić identyfikację wizualną (B). Upozycjonować jądro i najądrze tak, aby widoczne były zatopione w tkance tłuszczowej przewody odprowadzające (C, D, E). Zidentyfikować przewody odprowadzające i delikatnie usunąć tkankę tłuszczową wokół nich. Pod przewody można wsunąć kawałek kolorowego papieru lub plastiku w celu lepszej wizualizacji (G). Uciąć lub rozgnieść końcówkę pipety, dopasowując ją do rozmiaru przewodów, a następnie pobrać zawiesinę komórek do pipety (H). Ostrożnie wprowadzić pipetę do jednego z przewodów w pęczku przewodów odprowadzających, delikatnie przesuwając ją o kilka mm w kierunku jądra (strzałka na rysunku H wskazuje kierunek wstrzykiwania i wprowadzania pipety). Przedstawiono jądro po udanym wstrzyknięciu do kanalików nasiennych (I). Ts: jądro; Ep: najądrze.

Rycina 2. Reprezentatywne wyniki transplantacji komórek linii zarodkowej A) Wstrzyknięty jądro barwione X-gal. Niebieskie segmenty kanalików nasiennych reprezentują utrwalone kolonie pochodzące od transgenicznych dawców SSC (transgen LacZ). B) Większe powiększenie kolonii SSC w 3 miesiącu po transplantacji. Ciemnoniebieski obszar w centrum reprezentuje pełną spermatogenezę, a jasnoniebieskie obszary na końcach reprezentują rozrastające się rozszerzenie kolonii. C) Przekrój histologiczny ciemnoniebieskiego kanalika nasiennego (3 miesiące po transplantacji) wykazuje dobrze zorganizowaną spermatogenezę. Paski skali na rycinach B i C wynoszą odpowiednio 200 μm i 30 μm. (Ryciny zaadaptowano z Annu Rev Cell Dev Biol. 2008;24:263-86 oraz Biol Reprod. 1999 Jun;60(6):1429-36).

Rysunek 3. Ektopowe ksenoprzeszczepy niedojrzałej tkanki jąder dużych zwierząt do myszy z niedoborem odporności. Fragmenty niedojrzałego jądra dawcy (~1 mm³) przeszczepione pod skórę grzbietową myszy z niedoborem odporności (A) są w stanie przetrwać i reagować na gonadotropiny mysie. W rezultacie tkanka jądra przechodzi pełny rozwój, w tym formowanie plemników zdolnych do zapłodnienia (B). Po zebraniu ksenoprzeszczepów jądra (C) mogą one zostać wykorzystane do analizy lub w celu pozyskania plemników (D) do ICSI (E) i produkcji zarodków (F). Paski odpowiadają 50 μm (B, E i F) lub 10 μm (D). (Zmodyfikowano na podstawie Rodriguez-Sosa i Dobrinksi 2009¹⁴).

Dyskusja

1. Transplantacja komórek linii zarodkowej

Transplantacja komórek linii płciowej stanowi jedyny funkcjonalny test umożliwiający jednoznaczne potwierdzenie obecności komórek macierzystych spermatogonialnych (SSCs) w danej populacji komórek. Tylko SSCs mogą migrować do niszy SSC znajdującej się w błonie podstawnej, kolonizować ją i inicjować spermatogenezę pochodzącą od dawcy. Transplantacja komórek linii płciowej umożliwiła badanie i manipulowanie SSCs w sposób bezprecedensowy. Technika ta była s...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kolagenaza (typ IV)	Sigma-Aldrich	C5138
Trypsyna-EDTA	Invitrogen	25200-056
DNaseI	Sigma-Aldrich	DN25
DMEM	Invitrogen	31053-028
Barwnik trypan blue	Invitrogen	15250-061
Nylonowe sitko do odfiltrowywania komórek	BD Biosciences	352340 (40µm) 352350 (70µm)
Busulfan	Sigma-Aldrich	B2635
Cienkościenne kapilary szklane	World Precision Instruments, Inc.	TW 100-3
Polietylenowe rurki BD intramedic (PE100)	BD Biosciences	CA-63018-725
Jedwabna nić chirurgiczna Ethicon 6-0	Ethicon Inc.	706G
Klamry do ran	BD Biosciences	427631
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2
X-gal	Sigma-Aldrich	B4252
Ferrocyjanek potasu	Sigma-Aldrich	P9387
Ferrycyjanek potasu	Sigma-Aldrich	P3667
chlorek magnezu	Sigma-Aldrich	208337
deoksycholan sodu	Sigma-Aldrich	D6750
N,N-Dimetyloformamid	Sigma-Aldrich	D4551
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	18896