Transplantacja komórek linii zarodkowej i ksenoprzeszczepy tkanki jądra u myszy

Podsumowanie

Opisano protokoły transplantacji komórek linii płciowej oraz ksenoprzeszczepów tkanki jądra. Transplantacja komórek linii płciowej prowadzi do spermatogenezy pochodzącej od dawcy w jądrach biorcy i stanowi funkcjonalny test rekonstytucji służący do identyfikacji komórek macierzystych spermatogoniów (SSCs). Ksenoprzeszczepy tkanki jądra odtwarzają rozwój jądra oraz spermatogenezę różnych gatunków dawców u myszy biorców.

Streszczenie

Przeszczepianie komórek linii zarodkowej zostało opracowane przez dr. Ralpha Brinstera i współpracowników z University of Pennsylvania w 1994 roku^1,2. Te przełomowe badania wykazały, że mikroiniekcja komórek linii zarodkowej od płodnych myszy donora do kanalików nasiennych bezpłodnych myszy biorcy prowadzi do spermatogenezy pochodzącej od donora i produkcji plemników przez zwierzę biorcę². Wykorzystanie samców donora niosących bakteryjny gen β-galaktozydazy pozwoliło na identyfikację spermatogenezy pochodzącej od donora oraz przekazanie haplotypu donora potomstwu zwierząt biorców¹. Co zaskakujące, po przeszczepieniu do światła kanalików nasiennych, przeszczepione komórki linii zarodkowej były w stanie przemieścić się z przedziału światła do błony podstawnej, w której znajdują się spermatogonia³. Powszechnie przyjmuje się, że tylko SSC są w stanie skolonizować niszę i przywrócić spermatogenezę w jądrze biorcy. Zatem przeszczepianie komórek linii zarodkowej stanowi funkcjonalne podejście do badania niszy komórek macierzystych w jądrze oraz charakterystyki domniemanych komórek macierzystych spermatogonialnych. Do dziś przeszczepianie komórek linii zarodkowej jest wykorzystywane do wyjaśniania podstawowej biologii komórek macierzystych, wytwarzania zwierząt transgenicznych poprzez manipulacje genetyczne komórek linii zarodkowej przed przeszczepieniem^4,5, badania interakcji między komórkami Sertolego a komórkami linii zarodkowej^6,7, homingu i kolonizacji SSC^3,8, a także samoodnowy i różnicowania SSC^9,10.

Przeszczepy komórek linii zarodkowej są możliwe również u dużych gatunków¹¹. W ich przypadku głównymi zastosowaniami są zachowanie płodności, rozpowszechnianie elitycznej genetyki w populacjach zwierząt oraz generowanie zwierząt transgenicznych, ponieważ badanie spermatogenezy i biologii SSC za pomocą tej techniki jest logistycznie trudniejsze i bardziej kosztowne niż u gryzoni. Przeszczepienie komórek linii zarodkowej dużych gatunków do kanalików nasiennych myszy prowadzi do kolonizacji komórek dawcy i ekspansji spermatogonialnej, ale nie do ich pełnego różnicowania, co prawdopodobnie wynika z niekompatybilności somatycznego komponentu komórkowego biorcy z komórkami linii zarodkowej gatunków odległych filogenetycznie¹². Alternatywnym podejściem jest przeszczepienie komórek linii zarodkowej dużych gatunków wraz z otaczającym je komponentem somatycznym. W 2002 roku po raz pierwszy zgłosiliśmy, że małe fragmenty tkanki jądra niedojrzałych samców przeszczepione pod skórę grzbietową myszy z niedoborem odporności są w stanie przetrwać i przejść pełny rozwój z produkcją plemników zdolnych do zapłodnienia¹³. Od tego czasu wykazano, że ksenoprzeszczepy tkanki jądra odnoszą sukces u wielu gatunków i stały się cenną alternatywą do badania rozwoju jąder oraz spermatogenezy dużych zwierząt u myszy¹⁴.

Protokół

CZĘŚĆ A. Transplantacja komórek zarodkowych u myszy

1. Przygotowanie myszy biorców

1. Odbiorcy powinni być immunologicznie tolerancyjni na komórki jąder dawcy (poprzez dopasowanie genetyczne do dawców lub niedobór odporności).
2. Odbiorcy powinni być albo naturalnie pozbawieni spermatogenezy (np. myszy W/ W^v), albo pozbawieni endogennych komórek zarodkowych. Deplecja komórek zarodkowych może zostać osiągnięta poprzez napromieniowanie lub zastosowanie leków chemioterapeutycznych, takich jak Busulfan. W niniejszym protokole opisujemy metodę przygotowania myszy biorców z użyciem Busulfanu.
3. Odbiorców ....

Dyskusja

1. Transplantacja komórek linii zarodkowej

Transplantacja komórek linii płciowej stanowi jedyny funkcjonalny test umożliwiający jednoznaczne potwierdzenie obecności komórek macierzystych spermatogonialnych (SSCs) w danej populacji komórek. Tylko SSCs mogą migrować do niszy SSC znajdującej się w błonie podstawnej, kolonizować ją i inicjować spermatogenezę pochodzącą od dawcy. Transplantacja komórek linii płciowej umożliwiła badanie i manipulowanie SSCs w sposób bezprecedensowy. Technika ta była s.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kolagenaza (typ IV)	Sigma-Aldrich	C5138
Trypsyna-EDTA	Invitrogen	25200-056
DNaseI	Sigma-Aldrich	DN25
DMEM	Invitrogen	31053-028
Barwnik trypan blue	Invitrogen	15250-061
Nylonowe sitko do odfiltrowywania komórek	BD Biosciences	352340 (40µm) 352350 (70µm)
Busulfan	Sigma-Aldrich	B2635
Cienkościenne kapilary szklane	World Precision Instruments, Inc.	TW 100-3
Polietylenowe rurki BD intramedic (PE100)	BD Biosciences	CA-63018-725
Jedwabna nić chirurgiczna Ethicon 6-0	Ethicon Inc.	706G
Klamry do ran	BD Biosciences	427631
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2
X-gal	Sigma-Aldrich	B4252
Ferrocyjanek potasu	Sigma-Aldrich	P9387
Ferrycyjanek potasu	Sigma-Aldrich	P3667
chlorek magnezu	Sigma-Aldrich	208337
deoksycholan sodu	Sigma-Aldrich	D6750
N,N-Dimetyloformamid	Sigma-Aldrich	D4551
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	18896