Diagnostyka gruźlicy płuc za pomocą testu Xpert MTB/RIF

Podsumowanie

Test Xpert MTB/RIF integruje dekontaminację próbki, obsługę bezdotykową, pokładowe przetwarzanie próbki oraz ultrasensytywną hemi-zagnieżdżoną reakcję PCR w celu jednoczesnego wykrywania Mycobacterium tuberculosis oraz oporności na ryfampicynę, zarówno w odkrztuszonej plwocinie, jak i w zagęszczonych osadach z plwociny, w czasie około dwóch godzin. Badanie jest zestandaryzowane i wymaga jedynie umiarkowanej infrastruktury laboratoryjnej oraz przeszkolenia.

Streszczenie

Gruźlica (TB) wywoływana przez Mycobacterium tuberculosis (MTB) pozostaje poważnym problemem zdrowia publicznego: zakażenie dotyczy do jednej trzeciej populacji świata¹, a każdego roku na gruźlicę umiera prawie dwa miliony osób.² Powszechny dostęp do wysokiej jakości, zorientowanego na pacjenta leczenia dla wszystkich chorych na gruźlicę jest podkreślony w strategii Stop TB opracowanej przez WHO.³ Szybka detekcja MTB w próbkach z dróg oddechowych oraz terapia lekowa oparta na wiarygodnych wynikach testów oporności na leki są warunkiem wstępnym skutecznej realizacji tej strategii. Jednak w wielu regionach świata diagnostyka gruźlicy wciąż opiera się na mało czułych, słabo zestandaryzowanych metodach mikroskopii plwociny. Nieskuteczna detekcja TB oraz pojawianie się i transmisja szczepów MTB opornych na leki coraz bardziej zagrażają globalnym działaniom w zakresie kontroli gruźlicy.²

Skuteczna diagnostyka gruźlicy płuc wymaga dostępności — w skali globalnej — zestandaryzowanych, łatwych w użyciu i odpornych narzędzi diagnostycznych, które umożliwiałyby bezpośrednie wykrywanie zarówno kompleksu MTB, jak i oporności na kluczowe antybiotyki, takie jak ryfampicyna (RIF). Ten drugi wynik może służyć jako marker dla wielolekoopornych szczepów MTB (MDR TB) i odnotowano go w > 95% izolatów MDR-TB.^{4, 5} Szybka dostępność wiarygodnych wyników testów prawdopodobnie przełoży się bezpośrednio na trafne decyzje dotyczące leczenia pacjentów, co w ostateczności pozwoli wyleczyć konkretnego pacjenta i przerwać łańcuch transmisji gruźlicy w populacji.²

Test Xpert MTB/RIF firmy Cepheid (Sunnyvale, CA, USA)^{6, 7} w wyjątkowy sposób spełnia opisane powyżej wymagania. Jest to test amplifikacji kwasów nukleinowych służący do 1) wykrywania DNA kompleksu MTB w plwocinach lub zagęszczonych osadach z plwocin oraz 2) wykrywania mutacji genu rpoB związanych z opornością na RIF.⁸ Został on zaprojektowany do użytku z systemem GeneXpert Dx firmy Cepheid, który integruje i automatyzuje przygotowanie próbki, amplifikację kwasów nukleinowych oraz detekcję sekwencji docelowych z wykorzystaniem real-time PCR i PCR z odwrotną transkrypcją. System składa się z urządzenia, komputera osobistego, skanera kodów kreskowych oraz wstępnie zainstalowanego oprogramowania do przeprowadzania testów i przeglądania wyników.⁹ Wykorzystuje on jednorazowe wkłady Xpert MTB/RIF, które zawierają odczynniki do PCR i w których zachodzi proces PCR. Ponieważ wkłady są zamknięte, eliminuje to ryzyko zanieczyszczeń krzyżowych między próbkami.⁶ Obecnie stosowane metody amplifikacji kwasów nukleinowych do wykrywania MTB są złożone, pracochłonne i wymagające technicznie. Test Xpert MTB/RIF ma potencjał, aby wprowadzić standaryzowane, czułe i bardzo specyficzne testy diagnostyczne zarówno w kierunku TB, jak i lekooporności, do powszechnie dostępnych punktów opieki pacjenta (point-of-care)³, pod warunkiem, że będzie ich stać na ich zakup. W celu ułatwienia dostępu, Foundation for Innovative New Diagnostics (FIND) wynegocjowała znaczne obniżki cen. Aktualne ceny wynegocjowane przez FIND, wraz z listą krajów uprawnionych do zniżek, są dostępne w Internecie.¹⁰

Protokół

Standard 2 Międzynarodowych Standardów Opieki nad Chorymi na Gruźlicę stanowi, że wszyscy pacjenci z podejrzeniem gruźlicy płuc powinni dostarczyć co najmniej dwie próbki plwociny do badania bakteriologicznego. W miarę możliwości należy pobrać co najmniej jedną próbkę wczesnym rankiem, ponieważ plwocina pobrana o tej porze charakteryzuje się najwyższą wydajnością diagnostyczną.¹¹ Test Xpert MTB/RIF można stosować do próbek plwociny lub zagęszczonych osadów z plwociny przygotowanych z plwociny indukowanej lub wykrztuszonej, niezależnie od tego, czy wynik badania mikroskopowego w kierunku prątków kwasoodpornych (AFB) jest dodatni, czy ujemny.^{6, 12, 13} Test jest przeznaczony do stosowania u pacjentów z klinicznym podejrzeniem gruźlicy płuc, którzy: 1) nie otrzymali terapii przeciwgruźliczej, 2) leczyli się przez < 7 dni lub 3) nie otrzymali terapii w ciągu ostatnich 60 dni. Należy pamiętać, że testu nie powinno się stosować do monitorowania efektów leczenia farmakologicznego⁷, ponieważ bakteryjne DNA może utrzymywać się po terapii przeciwdrobnoustrojowej.

Próbki kliniczne, w tym zużyte kartridże, należy traktować jako potencjalnie zakaźne. Należy stosować odpowiednie środki ostrożności, takie jak noszenie jednorazowych rękawic ochronnych, fartuchów laboratoryjnych i okularów ochronnych, oraz przestrzegać procedur i wytycznych dotyczących bezpieczeństwa obowiązujących w danej instytucji.

1. Próbki odkrztuszonej plwociny

Uwaga: Jednorazowo należy przetwarzać tylko tyle próbek, ile dostępnych jest modułów systemu GeneXpert Dx do przeprowadzenia testu!

1. Oznakuj każdy kartridż Xpert MTB/RIF odpowiednim identyfikatorem próbki.
2. Przenieś 1,0 ml odkrztuszonej plwociny do stożkowej probówki z nakrętką, używając sterylnej pipety transferowej. Alternatywnie, całą próbkę można przetworzyć w oryginalnym, szczelnym pojemniku do pobierania plwociny.
3. Dodaj 2,0 ml odczynnika Xpert MTB/RIF Sample Reagent (2:1; v/v) do odkrztuszonej plwociny za pomocą sterylnej pipety transferowej.
4. Zakręć probówkę i energicznie potrząśnij nią 10-20 razy. Alternatywnie mieszaninę można wymieszać na wirówce typu vortex (30 s).
5. Pozostaw probówkę w pozycji pionowej przez 5 min w temperaturze pokojowej.
6. Energicznie potrząśnij probówką 10-20 razy. Alternatywnie użyj wirówki typu vortex (30 s).
7. Pozostaw probówkę w pozycji pionowej przez kolejne 10 min w temperaturze pokojowej.
8. Obejrzyj próbki: powinny być upłynnione, bez widocznych grudek plwociny.

2. Osady zagęszczone

Uwaga: Przetwarzać jednocześnie tylko tyle próbek, ile modułów systemu GeneXpert Dx jest dostępnych do przeprowadzenia testów!

1. Oznakuj każdy kartridż Xpert MTB/RIF odpowiadającym mu identyfikatorem próbki.
2. Przenieś 1.5 ml odczynnika do próbek Xpert MTB/RIF (Sample Reagent) do stożkowej probówki z nakrętką, używając sterylnej pipety transferowej.
3. Do probówki zawierającej odczynnik dodaj co najmniej 0.5 ml zagęszczonego osadu za pomocą sterylnej pipety transferowej.
4. Zakręć probówkę i energicznie wstrząśnij nią 10-20 razy. Alternatywnie można użyć wirówki typu vortex (30 s).
5. Pozostaw probówkę w pozycji pionowej na 5 min w temperaturze pokojowej.
6. Energicznie wstrząśnij probówką 10-20 razy. Alternatywnie można użyć wirówki typu vortex (30 s).
7. Pozostaw probówkę w pozycji pionowej na kolejne 10 min w temperaturze pokojowej.
8. Obejrzyj próbki: powinny być one upłynnione, bez widocznych grudek plwociny.

3. Załadowanie kartridża Xpert MTB/RIF

Uwaga: Test należy rozpocząć w ciągu 30 minut od dodania próbki do kartridża!

1. Sprawdź etykiety na wkładzie Xpert MTB/RIF oraz identyfikator próbki.
2. Otwórz pokrywę wkładu.
3. Za pomocą dołączonej sterylnej pipety transferowej pobierz upłynnioną próbkę, aż menisk znajdzie się powyżej linii minimalnej, a następnie przenieś próbkę do otwartego otworu wkładu Xpert MTB/RIF.

Uwaga: Dozować powoli, aby zminimalizować ryzyko powstania aerozolu!

4. Zamknij pokrywę kartridża.

4. Rozpoczęcie testu

Uwaga: Przed rozpoczęciem testu należy upewnić się, że system GeneXpert Dx jest wyposażony w oprogramowanie GX2.1, a test Xpert MTB/RIF został zaimportowany do oprogramowania! ⁹

1. Włącz komputer, a następnie włącz instrument GeneXpert Dx.
2. Na pulpicie systemu Windows dwukrotnie kliknij ikonę skrótu GeneXpert Dx.
3. Zaloguj się do oprogramowania systemu GeneXpert Dx, używając swojej nazwy użytkownika i hasła.
4. W oknie systemu GeneXpert Dx kliknij Create Test. Pojawi się okno dialogowe Scan Cartridge Barcode.
5. W polu Sample ID zeskanuj lub wpisz identyfikator próbki.
6. Zeskanuj kod kreskowy na kartridżu Xpert MTB/RIF. Pojawi się okno Create Test.
7. Kliknij Start Test i wprowadź hasło w oknie dialogowym, które się pojawi.
8. Otwórz drzwiczki modułu instrumentu z migającą zieloną lampką i umieść w nim kartridż.
9. Zamknij drzwiczki. Test rozpocznie się, a lampka przestanie migać i będzie świecić światłem ciągłym na zielono. Po zakończeniu testu lampka zgaśnie.
10. Odczekaj, aż system zwolni blokadę drzwiczek po zakończeniu analizy, następnie otwórz drzwiczki modułu i wyjmij kartridż.
11. Utylizuj zużyte kartridże w odpowiednich pojemnikach na odpady zgodnie ze standardowymi procedurami obowiązującymi w Twojej instytucji.

5. Reprezentatywne wyniki

Każdy wkład Xpert MTB/RIF zawiera odczynniki do wykrywania kompleksu MTB i oporności na RIF, a także kontrolę przetwarzania próbki (SPC), która służy do kontroli prawidłowego przetwarzania docelowych bakterii oraz monitorowania obecności inhibitorów w reakcji PCR. Kontrola sprawdzająca sondy (PCC) weryfikuje rehydratację odczynników, napełnienie probówki PCR we wkładzie, integralność sond oraz stabilność barwnika.⁹ Primery w teście Xpert MTB/RIF amplifikują fragment genu rpoB zawierający 81-parowy "rdzeń". Pięć różnie barwionych fluorogennych sond do hybrydyzacji kwasów nukleinowych, zwanych beaconami molekularnymi, analizuje cały 81-bp rdzeń.¹⁴ Każdy beacon molekularny został zaprojektowany tak, aby był na tyle specyficzny, że nie wiąże się ze swoim celem, jeśli sekwencja docelowa różni się od sekwencji rpoB typu dzikiego nawet o pojedynczą substytucję nukleotydu. Ponieważ beacony molekularne fluorescują tylko wtedy, gdy są związane ze swoimi celami, tj. sekwencją rpoB typu dzikiego, brak któregokolwiek z pięciu kolorów w teście pozwala odróżnić konserwowaną sekwencję typu dzikiego od mutacji w regionie rdzeniowym związanych z opornością na RIF.⁶

SPC powinna być dodatnia w próbce ujemnej oraz może być ujemna lub dodatnia w próbce dodatniej. Wynik testu zostanie uznany za „Nieprawidłowy” (Invalid), jeśli SPC nie zostanie wykryta w teście ujemnym. Przed rozpoczęciem reakcji PCR system GeneXpert Dx mierzy sygnał fluorescencji z sond w celu monitorowania rehydratacji kulek, napełnienia probówki reakcyjnej, integralności sond oraz stabilności barwnika. PCC zostaje zaliczona, jeśli sygnał fluorescencji z sond spełnia przypisane kryteria akceptacji. Wyniki są interpretowane przez system GeneXpert Dx na podstawie zmierzonych sygnałów fluorescencji oraz wbudowanych algorytmów obliczeniowych i wyświetlane w oknie View Results⁹, zgodnie z poniższymi informacjami:

Wykryto MTB: Wykryto docelowe DNA MTB; obie kontrole, SPC i PCC, spełniają przypisane kryteria akceptacji. Niższe wartości Ct oznaczają wyższe stężenie początkowe matrycy DNA; wyższe wartości Ct oznaczają niższe stężenie matrycy DNA. W wynikach „WYKRYTO MTB” na oddzielnej linii wyświetli się komunikat „WYKRYTO oporność na RIF” (Rysunek 1A), „NIE WYKRYTO oporności na RIF” (Rysunek 1B) lub „OPORNOŚĆ na RIF NIEZNACOZNACZNA”.

MTB nie wykryto: Nie wykryto docelowego DNA MTB; obie kontrole, SPC oraz PCC, spełniają przypisane kryteria akceptacji (Rysunek 2).

Wynik nieważny: Nie można określić obecności lub braku MTB: SPC nie spełnia kryteriów akceptacji, co oznacza, że próbka nie została prawidłowo przetworzona lub nastąpiło zahamowanie reakcji PCR (Rycina 3). Uwaga: powtórzyć badanie z dodatkowym materiałem!

Błąd: Jeden lub więcej wyników PCC zakończyło się niepowodzeniem (FAIL). Zarówno MTB, jak i SPC wyświetlają brak wyniku (NO RESULT). Uwaga: powtórzyć badanie z dodatkową próbką! Jeśli PCC zakończyło się pomyślnie (PASS), błąd jest spowodowany awarią komponentu systemu.

Rysunek 1: Wykryto docelowe DNA MTB; obie kontrole, SPC i PCC, spełniają przypisane kryteria akceptacji. Niższe wartości Ct oznaczają wyższe stężenie początkowe matrycy DNA; wyższe wartości Ct oznaczają niższe stężenie matrycy DNA. W wynikach MTB DETECTED na osobnej linii wyświetli się komunikat „RIF Resistance NOT DETECTED” (Rysunek 1A), „RIF Resistance DETECTED” (Rysunek 1B) lub „RIF Resistance INDETERMINATE”.

Rysunek 1A. Wykryto MTB; NIE wykryto oporności na RIF, co oznacza, że obecna była jedynie sekwencja nukleotydowa typu dzikiego 81-pz regionu determinującego oporność na RIF (RRDR) genu rpoB.⁶ Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększony rysunek.

Rycina 1B. WYKRYTO MTB; WYKRYTO oporność na RIF. Całkowity zanik sygnału sondy B (strzałka), która obejmuje pozycje od 513 do 517 RRDR genu rpoB .⁶ W tym przykładzie sekwencjonowanie częściowe wykazało obecność mutacji D516V w genie rpoB .⁸ Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

Rysunek 2. Nie wykryto docelowego DNA MTB; obie kontrole, SPC i PCC, spełniają przypisane kryteria akceptacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek.

Rysunek 3. Nieprawidłowy wynik testu, tj. brak możliwości określenia obecności lub braku MTB: SPC nie spełnia kryteriów akceptacji, ponieważ próbka nie została właściwie przetworzona lub wystąpiła inhibicja PCR. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Dyskusja

Test Xpert MTB/RIF integruje dekontaminację próbki, bezobsługową pracę, wbudowane przetwarzanie próbek oraz ultrasensytywną hemi-zagnieżdżoną PCR do jednoczesnego wykrywania MTB i oporności na RIF, zarówno w odkrztuszonej plwocinie, jak i w zagęszczonych osadach, w jednym, łatwym w obsłudze systemie. Wykazano, że analityczna granica wykrywalności testu wynosi 131 CFU/ml plwociny.⁶ Log-liniowa zależność między wartościami Ct a liczbą obecnych komórek MTB utrzymuje się w zakresie od 10² do 10⁷ CFU/ml plwociny. Ponieważ wszystkie klinicznie istotne stężenia MTB mieszczą się w zakresie liniowym testu, umożliwia on półilościową ocenę obciążenia bakteryjnego.⁷ Test wymaga jedynie umiarkowanej infrastruktury laboratoryjnej i przeszkolenia. Granica wykrywalności jest co najmniej o dwa rzędy wielkości niższa niż w przypadku konwencjonalnej mikroskopii.⁶ Specyficzność jest doskonała. Co więcej, jednoczesne wykrywanie MTB opornego na RIF stanowi istotną korzyść w ramach testów w punkcie opieki nad pacjentem w erze gruźlic lekoopornych.³

Do tej pory dostępne są jedynie ograniczone opublikowane dane dotyczące wydajności tego testu w diagnostyce gruźlicy płuc w warunkach klinicznych.^{12; 13} Ogólna czułość kliniczna testu Xpert MTB/RIF w wykrywaniu MTB w plwocinie pacjentów z podejrzeniem gruźlicy płuc wyniosła 97,6% w porównaniu do metody hodowli jako referencyjnej. Były to wyniki prospektywnego badania wieloośrodkowego, w którym uczestniczyło pięć ośrodków (Lima, Peru; Baku, Azerbejdżan; Kapsztad i Durban, RPA; Bombaj, Indie) i łącznie 1462 pacjentów. Ogólne prawdopodobieństwo przedtestowe wystąpienia gruźlicy potwierdzonej hodowlą w badanej populacji wyniosło 50,7%. Czułość wyniosła 99,8% dla przypadków dodatnich w badaniu mikroskopowym i hodowli oraz 90,2% dla przypadków ujemnych w badaniu mikroskopowym, a dodatnich w hodowli. Wśród pacjentów z HIV z gruźlicą płuc czułość testu MTB/RIF wyniosła 93,9%, w porównaniu do 98,4% u pacjentów HIV-ujemnych.¹² W warunkach niskiej zapadalności na gruźlicę ogólna zgodność w wykrywaniu MTB wyniosła 89% w porównaniu do hodowli; czułość wyniosła odpowiednio 98% dla próbek dodatnich w badaniu mikroskopowym i 72% dla próbek ujemnych w badaniu mikroskopowym, natomiast swoistość była doskonała.¹³ Nie stwierdzono istotnej różnicy w czułości pomiędzy testami przeprowadzonymi na nieobrobionej plwocinie a tymi na osadach zagęszczonych.¹² W tym samym badaniu test MTB/RIF prawidłowo wykrył oporność na RIF u 209 z 211 pacjentów (czułość 99,1%) oraz u wszystkich 506 pacjentów z wrażliwością na RIF (swoistość 100%), przy uwzględnieniu wyników sekwencjonowania.¹² Autorzy stwierdzili, że wydajność zarówno w wykrywaniu przypadków, jak i w rozróżnianiu oporności na RIF była podobna we wszystkich ośrodkach, co sugeruje, że wyniki te są prawdopodobnie szeroko stosowalne.¹² Ponadto, zagęszczone osady z innych próbek z dróg oddechowych niż plwocina, takich jak płukanie pęcherzykowo-oskrzelowe i wydzielina oskrzelowa, zostały przetestowane z porównywalną czułością i swoistością.¹³ Pojawiają się dane dotyczące wydajności testu przy diagnozowaniu gruźlicy pozapłucnej.¹⁵

Globalna kontrola gruźlicy pilnie wymaga skutecznych narzędzi umożliwiających szybką diagnostykę nowych przypadków TB oraz wykrywanie szczepów MTB opornych na RIF w powszechnie dostępnych punktach opieki nad pacjentem (point-of-care).³ Obecne metody amplifikacji kwasów nukleinowych stosowane do wykrywania MTB są złożone, pracochłonne i wymagające pod względem technicznym. Test Xpert MTB/RIF ma potencjał, aby wprowadzić do tych placówek zestandaryzowane, czułe i bardzo specyficzne testy diagnostyczne zarówno w kierunku TB, jak i lekooporności, pod warunkiem, że będzie je stać na ich zakup. Aby ułatwić dostęp, fundacja Foundation for Innovative New Diagnostics (FIND) wynegocjowała znaczne obniżki cen testu Xpert MTB/RIF. Aktualne ceny wynegocjowane przez FIND, wraz z listą krajów uprawnionych do zniżek, są dostępne w sieci.¹⁰

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Test Xpert MTB/RIF	Cepheid	GXMTB/RIF-10
Pipety transferowe	Sarstedt Ltd	86.1172.001
Probówki stożkowe, 15 ml, 120 x 17 mm, PS	Sarstedt Ltd	62.553.542