Spontaniczną aktywność rozwijających się sieci neuronalnych można mierzyć przy użyciu form estrów AM barwników wskaźnikowych wrażliwych na wapń. Zmiany wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia, wskazujące na aktywację neuronalną, są wykrywane jako przejściowe zmiany fluorescencji wskaźnika za pomocą obrazowania jedno- lub dwufotonowego. Niniejszy protokół można dostosować do różnych sieci neuronalnych zależnych od etapu rozwoju in vitro.
Artykuł metodologiczny
Funkcjonalne obrazowanie wapnia w rozwijających się sieciach korowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Charakterystycznym wzorcem aktywności w rozwijających się układach nerwowych jest spontaniczna, zsynchronizowana aktywność sieciowa. Zsynchronizowaną aktywność obserwowano w nienaruszonym rdzeniu kręgowym, pniu mózgu, siatkówce, korze mózgowej oraz w preparatach dysocjowanych kultur neuronalnych. Podczas okresów spontanicznej aktywności neurony depolaryzują, generując pojedyncze potencjały czynnościowe lub ich serie, co aktywuje wiele kanałów jonowych. Depolaryzacja aktywuje napięciowo zależne kanały wapniowe w dendrytach i kolcach dendrytycznych, które pośredniczą w napływie wapnia. Wysoko zsynchronizowaną aktywność elektryczną lokalnych sieci neuronalnych mierzono za pomocą elektrod polowych. Technika ta umożliwia wysoką częstotliwość próbkowania czasowego, ale charakteryzuje się niższą rozdzielczością przestrzenną ze względu na zintegrowany odczyt z wielu neuronów przez jedną elektrodę. Rozdzielczość pojedynczej komórki w badaniu aktywności neuronalnej jest możliwa do osiągnięcia dzięki elektrofizjologii patch-clamp na pojedynczych neuronach w celu pomiaru aktywności wyładowań. Jednak możliwość pomiarów w sieci jest ograniczona do liczby neuronów poddanych jednoczesnemu patch-clampowi, co zazwyczaj obejmuje tylko jeden lub dwa neurony. Zastosowanie wapniozależnych fluorescencyjnych barwników wskaźnikowych umożliwiło pomiar zsynchronizowanej aktywności w całej sieci komórek. Technika ta zapewnia zarówno wysoką rozdzielczość przestrzenną, jak i wystarczające próbkowanie czasowe do rejestracji spontanicznej aktywności rozwijającej się sieci.
Kluczową cechą nowo tworzących się sieci korowych i hipokampalnych podczas rozwoju prenatalnego i wczesnego postnatalnego jest spontaniczna, zsynchronizowana aktywność neuronalna (Katz & Shatz, 1996; Khaziphov & Luhmann, 2006). Uważa się, że ta skorelowana aktywność sieciowa jest niezbędna do generowania funkcjonalnych obwodów w rozwijającym się układzie nerwowym (Spitzer, 2006). Zarówno w mózgu naczelnych, jak i gryzoni, wczesne fale elektryczne i wapniowe sieci obserwuje się prenatalnie i postnatalnie in vivo oraz in vitro (Adelsberger et al., 2005; Garaschuk et al., 2000; Lamblin et al., 1999). Te wczesne wzorce aktywności, o których wiadomo, że kontrolują kilka procesów rozwojowych, w tym różnicowanie neuronalne, synaptogenezę i plastyczność (Rakic & Komuro, 1995; Spitzer et al., 2004), mają krytyczne znaczenie dla prawidłowego rozwoju i dojrzewania obwodów korowych.
W tym filmie JoVE prezentujemy metody wykorzystywane do obrazowania spontanicznej aktywności w rozwijających się sieciach korowych. Wskaźniki wrażliwe na wapń, takie jak ester Fura 2-AM, dyfundują przez błonę komórkową, gdzie wewnątrzkomórkowa aktywność esterazy rozszczepia estry AM, pozostawiając formę barwnika wskaźnikowego, która nie przenika przez błonę. Forma nieprzenikliwa wskaźnika posiada grupy kwasu karboksylowego, które są następnie w stanie wykrywać i wiązać jony wapnia wewnątrzkomórkowo. Fluorescencja barwnika wrażliwego na wapń ulega przejściowej zmianie po związaniu z wapniem. Techniki obrazowania jednofotonowego lub wielofotonowego są stosowane do pomiaru zmian w emisji fotonów przez barwnik, co wskazuje na zmianę poziomu wapnia wewnątrzkomórkowego. Ponadto wskaźniki zależne od wapnia można łączyć z innymi markerami fluorescencyjnymi w celu zbadania typów komórek w obrębie aktywnej sieci.
Protokół
1. Przygotowywanie poziomych skrawków mózgu z obszaru entorynalno-hipokampalnego
Przekroje mózgu obejmujące korę entorynalną i hipokamp są przygotowywane z wykorzystaniem przewodników anatomicznych, szczegółowo opisanych w trójwymiarowym przeglądzie tego obszaru zgodnie z publikacją Canto, Wouterlood & Witter (2008) Neural Plasticity ID 3812439.
- Przygotuj 500ml roztworu do krojenia, napowietrz go gazem carbogenowym (95% tlenu, 5% dwutlenku węgla) przez co najmniej 20 minut, a następnie zamroź 250ml do momentu powstania lodu. Na kilka minut przed krojeniem rozkrusz i wymieszaj lód z pozostałymi 250ml napowietrzanego roztworu do krojenia, który będzie wykorzystywany podczas sekcji oraz w komorze krojenia.
- Przygotuj 200ml roztworu r-ACSF (regeneracyjnego ACSF) oraz co najmniej 500ml roztworu e-ACSF (eksperymentalnego ACSF). Oba roztwory napowietrzaj stale gazem carbogenowym (95% tlenu, 5% dwutlenku węgla) przez co najmniej 20 minut przed przygotowaniem tkanki.
- Niniejszy protokół jest odpowiedni dla myszy od 0. dnia po urodzeniu do maksymalnie 3. tygodnia życia. Wykonaj dekapitację zwierzęcia zgodnie z procedurami lokalnej komisji etycznej i szybko wypreparuj mózg do szalki Petriego zawierającej lodowaty roztwór do krojenia przygotowany w Kroku 1 powyżej (patrz Tabela 1 w celu uzyskania informacji o roztworach i odczynnikach).
- Przenieś mózg na papier filtracyjny nasączony roztworem do krojenia i oddziel obie półkule za pomocą ostrej żyletki. Przenieś jedną półkulę z powrotem do lodowatego roztworu do krojenia.
- Usuń móżdżek z drugiej półkuli. Obróć mózg wzdłuż linii środkowej i odetnij górną część mózgu pod niewielkim kątem w stronę końca rostralnego.
- Obróć mózg przeciętą (grzbietową) powierzchnią do góry i przyklej go do uchwytu na tkankę w wibrotomie w pozycji odwróconej, delikatnie dociskając patyczkiem bawełnianym.
- Wytnij plastry mózgu o grubości 300 μm, stosując niską częstotliwość i prędkość w pozostałym lodowatym roztworze do krojenia przygotowanym w Kroku 1. W naszych warunkach używamy wibrotomu Thermo Fisher Scientific (Microm, HM 650V) przy ustawieniach 0,05 mm/s i 36Hz.
- Niezwłocznie po wycięciu przenieś plaster do uchwytu na plastry (zanurzonego) zawierającego napowietrzony sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF) (2,5mM Mg2+, 1,6mM Ca2+; patrz Tabela 2) w temperaturze pokojowej. Wyższa koncentracja magnezu w r-ACSF ogranicza napływ wapnia do neuronów poprzez receptory NMDA po krojeniu i w naszym doświadczeniu prowadzi to do uzyskania lepszej jakości plastrów do eksperymentów. W razie potrzeby przetnij następnie drugą półkulę mózgu.
- Pozostaw plastry na jedną godzinę w celu regeneracji.
| Roztwór do plastrów (w mM) – 10 | |
| 110 | chlorek choliny |
| 25 | NaHCO₃3 |
| 11.6 | 11.6 |
| 10 | D-glukoza |
| 7 | MgCl₂2 |
| 3.1 | pirogronian sodu |
| 2.5 | KCl |
| 1.25 | NaH2PO4 |
| 0.5 | CaCl₂2 |
Tabela 1. Skład roztworu do preparowania skrawków.
| ACSF (w mM) | |
| 125 | NaCl |
| 26 | NaHCO3 |
| 10 | D-glukoza |
| 3 | KCl |
| 2.5/1.5 | MgCl2 (regeneracja/eksperyment) |
| 1.6 | CaCl2 |
| 1.25 | NaH2PO4 |
Tabela 2. Skład roztworu do regeneracji (r-ACSF) oraz roztworu eksperymentalnego (e-ACSF).
2. Przygotowanie komory barwiącej
Aby załadować komórki wskaźnikiem zależnym od wapnia lub markerem specyficznym dla komórek, skrawki należy przenieść do komory w celu przeprowadzenia procedury barwienia. Chociaż dostępne mogą być komory komercyjne, można łatwo zmontować taką komorę ze standardowego sprzętu laboratoryjnego przy bardzo niskim koszcie. Kluczowe cechy takiej komory polegają na tym, że skrawki są ogrzewane do temperatury od 30 do 35°C, inkubowane w stale natlenianym medium oraz że komora jest osłonięta przed światłem.
- Za pomocą rozgrzanego pręta wykonaj w ściance bocznej dwóch jednorazowych szalek Petri z polistyrenu (o średnicach 35 i 100 mm) mały otwór, wystarczająco duży, aby można było przez niego przełożyć odcinek rurki silikonowej (o średnicy ok. 1,5 mm).
- Przewlecz rurkę silikonową przez otwór w małej szalce Petri i uformuj pętlę przy wewnętrznej ściance małej szalki.
- Użyj superkleju, aby uszczelnić otwarty koniec rurki i przykleić pozostałą część rurki do wewnętrznej ścianki szalki Petri.
- Za pomocą igły wykonaj w równych odstępach drobne otwory w rurce znajdującej się wewnątrz małej szalki Petri.
- Wklej mniejszą szalkę Petri do większej, tak aby oba otwory były w jednej linii. Przewlecz drugi koniec rurki silikonowej przez otwór w ściance większej szalki Petri.
- W celu przygotowania szalki interfejsowej użyj insertu do kultur komórkowych z membraną półprzepuszczalną i za pomocą rozgrzanego skalpela odetnij górne 1 cm, aby uzyskać płytkie naczynie do utrzymywania skrawków podczas inkubacji.
- W pokrywce większej szalki Petri wykonaj otwór o średnicy ok. 0,5-1 cm, aby umożliwić dopływ karbogenu (95% O2, 5% CO2) do komory.
- Przygotuj plastikową strzykawkę o pojemności 5 lub 10 ml. Za pomocą rozgrzanego skalpela wykonaj skośne cięcie, aby usunąć koniec strzykawki, pozostawiając fragment rurki strzykawki z końcówką o długości kilku cm. Za pomocą superkleju przymocuj ściętą powierzchnię rurki strzykawki do pokrywki szalki Petri, nad otworem o średnicy 0,5-1 cm.
- Do końcówki strzykawki podłącz rurkę silikonową oraz konektor do rurek. Do rurki silikonowej wchodzącej do podstawy szalek Petri podłącz drugi konektor.
- Podłącz obie rurki do regulatora dopływu karbogenu (95% O2, 5% CO2). Umieść komorę barwiącą na płycie grzejnej w celu inkubacji w temperaturze 30-35°C. Upewnij się, że komora może być osłonięta przed światłem przez cały proces inkubacji. Komora barwiąca jest teraz gotowa do złożenia i wykorzystania do inkubacji skrawków.
Rysunek metodologiczny 1. Przekrój komory barwiącej przedstawiający inkubację plastra (powyżej) i aplikację wskaźnika wrażliwego na wapń (pipetowany zielony barwnik, poniżej).
3. Barwienie przekrojów
Podczas wszelkich prac z wykorzystaniem barwników fluorescencyjnych należy unikać fotobleachingu, pracując przy ograniczonym oświetleniu oraz przechowując barwnik i zabarwoną tkankę w ciemności pomiędzy poszczególnymi etapami procedury.
- Umieść komorę barwiącą na płycie grzewczej (35°C), podłącz ją do źródła gazu carbogen i napełnij około 1,5 ml r-ACSF z uchwytu do skrawków.
- Wstaw naczynie interfejsowe do komory barwiącej i napełnij je 1 ml ACSF.
- Zapewnij odpowiedni dopływ carbogenu do komory barwiącej, aby ACSF delikatnie i jednostajnie bąbelkował.
- Dodaj 9 μl DMSO i 1 μl kwasu pluronikowego (roztwór zapasowy 20% w DMSO, Invitrogen) do fiolki zawierającej 50 μg Fura 2-AM. Mieszaj barwnik na wortexie przez 15 minut.
- Przenieś skrawki do naczynia interfejsowego i pipetuj barwnik do r-ACSF bezpośrednio nad obszar zainteresowania w obrębie hipokampa i kory entorynalnej, zgodnie z Rysunkiem 1 w sekcji Metodyka (powyżej), tak aby uzyskać końcowe stężenie barwnika 50mM.
- Zamknij pokrywę komory barwiącej i inkubuj barwnik przez 20–40 minut, w zależności od wieku zwierzęcia (patrz Tabela 3).
- Przenieś skrawki z powrotem do uchwytu do skrawków.
| Wiek (dni postnatalne) | Czas inkubacji (min) |
| 20 | |
| p8-p9 | 25 |
| p10-p11 | 30 |
| p12-13 | 35 |
| >p13 | 40 |
Tabela 3. Czasy inkubacji dla różnych grup wiekowych, określone empirycznie w laboratorium.
4. Inne barwniki i starsze tkanki
Być może ze względu na zwiększoną mielinizację tkanki mózgowej, skrawki pochodzące od starszych gryzoni nie pochłaniają estru Fura 2-AM tak łatwo. Aby ułatwić pobieranie tego barwnika, w przypadku mózgów myszy w stadium P13 i starszych stosuje się etap preinkubacji z użyciem Cremophor EL (Sigma)11. Cremophor jest niejonowym surfaktantem stosowanym jako substancja pomocnicza w wielu zastosowaniach farmaceutycznych. Bez tego etapu stwierdzono, że znakowanie specyficzne dla komórek jest niezwykle słabe i niespójne w całym skrawku korowym.
- Przenieś stare skrawki do płytkiej naczynia do preinkubacji wypełnionego 3ml r-ACSF i 8 μl 0,5% cremophor (Sigma) podgrzanego do 35°C przez 3 minuty.
- Przenieś skrawki do naczynia interfejsowego i przeprowadź standardową procedurę barwienia (Kroki 4-7, patrz wyżej).
Barwniki wapniowe przenikają zarówno do neuronów, jak i do komórek nieneuronalnych w preparacie skrawka. Aby zidentyfikować i odróżnić te typy komórek w obrębie sieci, do znakowania astrocytów w skrawku można użyć sulforodaminy 101 (SR101).
Barwienie skrawków sulforhodaminą 101
Wykonaj kroki 1-3 jak wcześniej (sekcja 3).
Pobierz 1 μl roztworu zapasowego sulforodaminy (Sigma) o stężeniu 10mM z przechowywania w -20°C i rozpuść w 999 μl r-ACSF, aby otrzymać roztwór o stężeniu 10 μM. Nanieś fioletowy barwnik pipetą na skrawki jak poprzednio (kroki 5-7), pozostawiając skrawki do inkubacji na 15 minut.
Mikroglej oraz komórki śródbłonka są znakowane przy użyciu barwnika FITC tomato lectin
Należy postępować zgodnie z krokami 1-3, tak jak wcześniej.
Pobierz 25 μl roztworu stokowego koniugatu lektyny z Lycopersicon esculentum (pomidora) z FITC (L0401, Sigma) o stężeniu 2 mg/ml do 2,5 ml r-ACSF, aby uzyskać 20 μg/ml stężenie. Nanieś barwnik pipetą na skrawki w taki sam sposób jak wcześniej (kroki 5–7), pozostawiając skrawki do inkubacji na 45 minut.
Należy zauważyć, że nie jest możliwe połączenie tego barwnika z wskaźnikiem wrażliwym na wapń, takim jak Fura 2-AM lub Oregon Green BAPTA-1 (OGB-1), które fluorescują w zielonym zakresie widma, ponieważ fotony z obu barwników będą emitowane na nakładających się długościach fal. Istnieją jednak inne barwniki wskaźnikowe dla wapnia, takie jak Calcium orange i Fura Red, które mogą być stosowane w połączeniu z odpowiednimi filtrami, lub konjugaty lektynowe Texas-Red, które można łączyć z barwnikami wskaźnikowymi dla wapnia w zielonym widmie.
5. Mocowanie skrawków do komory rejestracyjnej
Podczas obrazowania plastry muszą być stabilne pod mikroskopem. Zazwyczaj stosuje się metalową harfę do przytrzymania tkanki, jednak może ona nierównomiernie odkształcić powierzchnię plastra, co sprawia, że tylko część pola widzenia obrazowania pozostaje w ostrości. Aby tego uniknąć, plastry są mocowane do komory rejestracyjnej za pomocą Polyethylenimine (PEI).
- Przygotuj roztwór PEI (1ml roztworu polietyleniminy w 250ml buforu borowego (tabela 4)). Upewnij się, że PEI całkowicie się rozpuściło (mieszaj przez noc).
- Napełnij komory rejestracyjne roztworem PEI tak, aby dno było pokryte cieczą, co najmniej na godzinę przed planowanym nałożeniem skrawków.
- Przemyj komory rejestracyjne wodą destylowaną, a następnie r-ACSF z komory przechowawczej.
- Przenieś jeden skrawka do komory rejestracyjnej.
- Usuń r-ACSF za pomocą pipety i ustaw skrawka na środku, używając pędzelka.
- Usuń r-ACSF wokół skrawka za pomocą kawałków papieru filtracyjnego. Dla zapewnienia stabilności i adhezji ważne jest, aby wokół skrawka nie pozostał już żaden ACSF.
- Nanieś pipetą około 0,5-1ml ACSF na skrawka, w zależności od wielkości komory rejestracyjnej. ACSF powinien jedynie pokrywać powierzchnię skrawka.
- Umieść komorę rejestracyjną ze skrawkiem w dużym, nawilżonym pojemniku interfejsowym, przepływanym karbogenem, i pozostaw skrawki do regeneracji na co najmniej jedną godzinę.
| roztwór PEI | |
| 1 ml | Roztwór poli(ethyleniminy) |
| w 250 ml buforu borowego | |
| 40 mM | kwas borowy |
| 10 mM | dekahydrat tetraboranu sodu |
Tabela 4. Skład roztworu PEI.
6. Obrazowanie
Barwniki wskaźnikowe zależne od wapnia można obrazować za pomocą mikroskopii jednofotonowej lub dwufotonowej. Zastosowanie obrazowania dwufotonowego aktywuje barwnik wskaźnikowy wyłącznie w objętości ogniskowej badanego obszaru, co redukuje rozproszenie światła w tkance. Ponadto pozwala to na lepszą penetrację światła w głąb skrawka.
Do funkcjonalnego obrazowania wapnia wykorzystujemy laser szafirowy Titanium firmy Coherent sprzężony z mikroskopem Olympus z obiektywem 20x (NA 0,95) oraz systemem Trimscope firmy LaVision Biotec. System Trimscope umożliwia skanowanie klatek przy użyciu 64 wiązek jednocześnie i jest sprzężony z kamerą EM-CCD Hamamatsu C9100, co pozwala na osiągnięcie wysokiej częstotliwości skanowania klatek.
- Umieść komorę pomiarową pod mikroskopem i ustanów stabilną perfuzję obrazującym e-ACSF (stosunek 1,6 Ca2+/1,5 Mg2+ (tabela 2)) podgrzanym do bardziej fizjologicznej temperatury minimum 30°C.
- Ustaw ostrość na obszarze zainteresowania (ROI), korzystając z oświetlenia światłem białym. Unikaj wystawiania skrawka na działanie światła dłużej niż jest to konieczne.
- Wybierz długość fali, pole widzenia obrazowania, częstotliwość skanowania, gęstość pikseli oraz dodatkowe opcje oprogramowania odpowiednie dla tkanki i sygnałów biologicznych, które chcesz zmierzyć. W przypadku obrazowania sieci wapniowej z użyciem Fura 2-AM zazwyczaj wybieramy długość fali 820 nm, pole widzenia obrazowania 250x250 μm, częstotliwość skanowania liniowego 1200 Hz oraz binning 2-na-2. Przekłada się to na czas klatki około 100 ms, a tym samym częstotliwość obrazowania około 10 Hz.
- Sprawdź, czy ROI jest w ostrości, korzystając z trybu skanowania ciągłego i wybranej długości fali światła laserowego. Dostosuj ostrość i intensywność lasera, aby uniknąć nasycenia pikseli i blaknięcia obrazu.
- Wykonaj film poklatkowy (timelapse) swojego ROI. Zazwyczaj rejestrujemy dwa filmy poklatkowe po 2000 klatek każdy.
- W celu detekcji i identyfikacji komórek wykonaj stos z-stack, stosując krok 1 μm i obrazując zakres +/- 20 μm wokół płaszczyzny ostrości.
7. Reprezentatywne wyniki:
Pomyślne ładowanie wskaźników wapnia Fura 2-AM przedstawiono na Rycynie 1 w rozwijających się sieciach kory nowej i kory entorynalnej z wykorzystaniem obrazowania wielofotonowego. Część barwnika wciąż występuje jako tło w tkance, lecz ciała komórek, a w niektórych przypadkach dendryty proksymalne, są wyraźnie widoczne i oddzielone od otaczającego neuropilu. Jeśli ładowanie nie powiodło się, obserwuje się bardzo słabe barwienie specyficzne dla komórek, a na powierzchni skrawka często widoczne są małe skupiska plamek barwnika w szczątkach martwych błon.
Na tych zrzutach ekranu sieć komórek jest wyraźnie widoczna w jednej płaszczyźnie ogniskowania, co umożliwia jednoczesne obrazowanie komórek. Użycie metalowej harfy lub niepełne przytwierdzenie skrawka do komory rejestracyjnej może spowodować nierówność powierzchni obrazowanego skrawka.
Rycina 1. Rozwijające się sieci neokortykalne (A, lewo) i entorynalne (B, prawo) obciążone estrem Fura 2-AM. Paski skali 100 μm.
Aby oddzielić neurony od astrocytów, równoczesne zastosowanie sulforhodaminy 101 i estru Fura 2-AM umożliwia rozróżnienie typów komórek w obrębie sieci.
Rysunek 2. Markowanie astrocytów sulforodaminą 101. A Podwójne markowanie estrem Fura 2-AM i sulforodaminą 101. Długość fali wzbudzenia: 820nm. Akwizycja obrazów na PMT z lustrem dichroicznym 560/70nm w celu rozdzielenia długości fal. B Reprezentatywne przebiegi fluorescencji z neuronu (powyżej) i astrocytu (poniżej). Skale: 60 sec, ΔF 10 (au fluo).
Rysunek 3. Barwienie lektyną z Lycopersicon esculentum (pomidora) sprzężoną z FITC. Znakowanie mikrogleju i komórek śródbłonka w rozwijającym się hipokampie myszy (A) oraz w powierzchownych warstwach kory entorynalnej (B).
Barwniki wskaźnikowe wapnia są wykorzystywane do odczytu aktywności z wielu komórek jednocześnie w rozwijających się sieciach korowych i hipokampalnych.
Rycina 4. Dynamiczne przejścia wapniowe w sieciach hipokampalnych i korowych.
Film 1: Obciążanie kory entorynalnej myszy esterem Fura 2-AM podczas drugiego tygodnia po urodzeniu.
Kliknij tutaj, aby obejrzeć film 1.
Film 2: Obciążanie hipokampa myszy estrem Fura 2-AM w pierwszym tygodniu po urodzeniu.
Kliknij tutaj, aby wyświetlić film 2.
Film 3: Obciążanie Fluo-4 kory mózgu myszy w pierwszym tygodniu po urodzeniu.
Kliknij tutaj, aby obejrzeć film 3.
W przypadku estru Fura 2-AM aktywacja komórki obejmująca indukowany depolaryzacją napływ wapnia powoduje spadek fluorescencji barwnika. W przypadku barwników takich jak Fluo-4 zachodzi proces odwrotny, a depolaryzację komórki obserwuje się jako wzrost emisji fotonów. Pomiarami obejmuje się głównie przejściowe stężenia wapnia w somie, jednak w niektórych preparatach można zaobserwować aktywność w większych dendrytach proksymalnych, co pokazano w Filmie 2.
Odczyt aktywności sieci można ilościowo określić przy użyciu komercyjnych skryptów oprogramowania lub skryptów opracowanych wewnętrznie. W naszym laboratorium identyfikacja komórek oraz aktywność sieci są mierzone i analizowane w sposób półautomatyczny przy użyciu własnego kodu dla programu Matlab (Mathworks).
Rycina 5. Reprezentatywna analiza zsynchronizowanych przejściowych zmian poziomu wapnia w rozwijającej się sieci korowej. Reprezentacja 3D jednego neuronu (A) wykorzystana do automatycznego utworzenia maski neuronu (B) z serii obrazów z-stack w celu zautomatyzowanej detekcji neuronów. Pomiary przejściowych zmian poziomu wapnia obejmują amplitudę, częstotliwość oraz liczbę aktywnych komórek, które można odczytać z danych pojedynczego neuronu (C). Synchronizację pomiędzy różnymi śladami można zwizualizować za pomocą wykresu rastrowego (D).
Dyskusja
Metody, które tutaj demonstrujemy, przedstawiają odpowiednie protokoły obrazowania wapnia w celu badania dynamiki sieci w identyfikowalnych komórkach w rozwijających się sieciach korowych i hipokampalnych w mózgu myszy, a także szczura. Metody te zapewniają optymalną rozdzielczość przestrzenną do jednoczesnej wizualizacji lokalnej sieci som komórkowych w celu pomiaru aktywności ponadprogowej. Rozdzielczość czasowa aktywności sieci może być zmieniana, w zależności od ustawień akwizycji klatek kamery CCD, aby zoptymalizować pomiary stosunku sygnału do szumu dla długotrwałych zdarzeń ponadprogowych, typowych dla rozwijającego się układu nerwowego. Protokoły te nie ograniczają się do sieci hipokampalnych i korowych, lecz pozwalają na znakowanie komórek w całym rozwijającym się układzie nerwowym. Ograniczeniem tej metody jest fakt, że można zarejestrować wyłącznie aktywność ponadprogową.
Oświadczenia
LaVision Biotec GmBH (Bielefeld, Niemcy) sfinansowała opłaty za przedłożenie tego artykułu.
Podziękowania
Prace laboratoryjne były wspierane przez Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO) (917.10.372) dla RMM. JD jest związany z programem EU FP7 BrainTrain (www.brain-train.nl). Dziękujemy Pieterowi Laurens-Baljonowi i Sabine Schmitz (oboje z CNCR, VU University Amsterdam) za obrazy przebiegów wieloelektrodowej macierzy FP oraz hodowli neuronalnych wykorzystanych w sekwencji wideo.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Odczynniki | |||
| CaCl2 | Sigma Aldrich | 22,350-6 | |
| Chlorek choliny | Sigma | C7527 | |
| cremaphor | Fluka | 27963 | Cremophor EL® |
| DMSO (Dimetylosulfooksyd) | Sigma Aldrich | 472301 | |
| D-glukoza | Sigma Aldrich | 16325 | |
| Fura-2 AM | Invitrogen | F-1221 | specjalne opakowanie |
| KCl | Sigma Aldrich | 60130 | |
| MgCl2 | Fluka | 63072 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 31434 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | 31437 | |
| NaH2PO4 | Merck | 106346 | |
| Pluronic® F-127 | Invitrogen | P-3000MP | roztwór 20% w DMSO |
| askorbinian sodu | Sigma | A7631 | |
| pirowinian sodu | Sigma Aldrich | P2256 | |
| Lektyna z Lycopersicon esculentum (pomidor) | Sigma | L0401 | |
| Chlorek kwasu sulforodaminy 101 | Sigma | S3388 | |
| Roztwór poli(etyleniminy) | Fluka | P3143 | |
| kwas borowy | Sigma | B6768 | |
| Tetraboran sodu dekahydrat | Sigma | B3545 | |
| PEI | |||
| Komora barwiąca | |||
| Strzykawka (5 lub 10 ml) | Terumo | z końcówką Luer Lock | |
| Wkładki do hodowli komórkowych do płytek 6-dołkowych, 8,0 µm, przezroczysta membrana PET | BD Falcon™ | 353093 | |
| Szalka Petriego (35 i 100 mm) | jednorazowa, polistyrenowa | ||
| przewody i złączki | |||
| super glue | |||
| Uchwyty i Komory | |||
| Uchwyt do skrawków | zanurzalny | ||
| Komora barwiąca | komora interfejsowa | ||
| komora rejestracyjna | np. sondy MEA | ||
| Układ obrazowania | |||
| Tytanowy laser szafirowy (Chameleon) | Coherent | ||
| Trim Scope | LaVision | 64 wiązki | |
| Mikroskop | Leica | obiektyw z wysoką NA |
Bibliografia
- Katz, L. C., Shatz, C. J. Synaptic activity and the construction of cortical circuits. Science. 274, 1133-1138 (1996).
- Khazipov, R., Luhmann, H. J. Early patterns of electrical activity in the developing cerebral cortex of humans and rodents. Trends in Neurosciences. 29, 414-418 (2006).
- Spitzer, N. C. Electrical activity in early neuronal development. Nature. 444, 707-712 (2006).
- Adelsberger, H., Garaschuk, O., Konnerth, A. Cortical calcium waves in resting newborn mice. Nat. Neurosci. 8, 988-990 (2005).
- Garaschuk, O., Linn, J., Eilers, J., Konnerth, A. Large-scale oscillatory calcium waves in the immature cortex. Nat. Neurosci. 3, 452-459 (2000).
- Lamblin, Electroencephalography of the premature and term newborn. Maturational aspects and glossary. Neurophysiol. Clin. 29, 123-219 (1999).
- Rakic, P., Komuro, H. The role of receptor/channel activity in neuronal cell migration. J. Neurobiol. 26, 299-315 (1995).
- Spitzer, N. C., Root, C. M., Borodinsky, L. N. Orchestrating neuronal differentiation: patterns of Ca2+ spikes specify transmitter choice. Trends. Neurosci. 27, 415-421 (2004).
- Canto, C. B., Wouterlood, F. G., Witter, M. P. What does the anatomical organization of the entorhinal cortex tell us. Neural. Plast. , 381243-381243 (2008).
- Bureau, I., Shepherd, G. M., Svoboda, K. Precise development of functional and anatomical columns in the neocortex. Neuron. 42, 789-801 (2004).
- Ikegaya, Y., Le Bon-Jego, M., Yuste, R. Large-scale imaging of cortical network activity with calcium indicators. Neuroscience research. 52, 132-138 (2005).
Przedruki i uprawnienia
