Funkcjonalne obrazowanie wapnia w rozwoju sieci korowych

Summary

Spontaniczna aktywność rozwijających się sieci neuronowych może być mierzona za pomocą form AM-estrowych barwników wskaźnikowych wrażliwych na wapń. Zmiany w wewnątrzkomórkowym wapniu, wskazujące na aktywację neuronów, są wykrywane jako przejściowe zmiany we wskaźnikowej fluorescencji za pomocą obrazowania jedno- lub dwufotonowego. Protokół ten można dostosować do szeregu zależnych od rozwoju sieci neuronalnych in vitro.

Abstract

Charakterystycznym wzorcem aktywności w rozwijających się układach nerwowych jest spontaniczna, zsynchronizowana aktywność sieciowa. Zsynchronizowaną aktywność zaobserwowano w nienaruszonych preparatach rdzenia kręgowego, pnia mózgu, siatkówki, kory mózgowej i zdysocjowanych kultur neuronalnych. W okresach spontanicznej aktywności neurony depolaryzują się, aby wystrzelić pojedyncze lub wybuchy potencjałów czynnościowych, aktywując wiele kanałów jonowych. Depolaryzacja aktywuje bramkowane napięciem kanały wapniowe na dendrytach i kolcach, które pośredniczą w napływie wapnia. Wysoce zsynchronizowana aktywność elektryczna została zmierzona z lokalnych sieci neuronowych za pomocą elektrod polowych. Technika ta umożliwia wysoką częstotliwość próbkowania czasowego, ale niższą rozdzielczość przestrzenną dzięki zintegrowanemu odczytowi wielu neuronów na jednej elektrodzie. Rozdzielczość aktywności neuronalnej pojedynczej komórki jest możliwa przy użyciu elektrofizjologii patch-clamp na pojedynczych neuronach do pomiaru aktywności wypalania. Jednak możliwość pomiaru z sieci jest ograniczona do liczby neuronów załatanych jednocześnie i zazwyczaj jest to tylko jeden lub dwa neurony. Zastosowanie fluorescencyjnych barwników wskaźnikowych zależnych od wapnia umożliwiło pomiar zsynchronizowanej aktywności w sieci komórek. Technika ta zapewnia zarówno wysoką rozdzielczość przestrzenną, jak i wystarczające próbkowanie czasowe do zarejestrowania spontanicznej aktywności rozwijającej się sieci.

Kluczową cechą nowo tworzących się sieci korowych i hipokampowych podczas rozwoju pre- i wczesnego postnatalnego jest spontaniczna, zsynchronizowana aktywność neuronalna (Katz & Shatz, 1996; Khaziphov & Luhmann, 2006). Uważa się, że ta skorelowana aktywność sieci jest niezbędna do generowania obwodów funkcjonalnych w rozwijającym się układzie nerwowym (Spitzer, 2006). Zarówno w mózgu naczelnych, jak i gryzoni wczesne fale sieci elektrycznej i wapniowej obserwuje się przed i po urodzeniu in vivo i in vitro (Adelsberger i wsp., 2005; Garaschuk i wsp., 2000; Lamblin i wsp., 1999). Te wczesne wzorce aktywności, o których wiadomo, że kontrolują kilka procesów rozwojowych, w tym różnicowanie neuronów, synaptogenezę i plastyczność (Rakic i Komuro, 1995; Spitzer i wsp., 2004) mają kluczowe znaczenie dla prawidłowego rozwoju i dojrzewania obwodów korowych.

W tym filmie JoVE demonstrujemy metody używane do obrazowania spontanicznej aktywności w rozwijających się sieciach korowych. Wskaźniki wrażliwe na wapń, takie jak ester Fura 2-AM, dyfundują przez błonę komórkową, gdzie wewnątrzkomórkowa aktywność esterazy rozszczepia estry AM, pozostawiając nieprzepuszczalną dla komórek formę barwnika wskaźnikowego. Nieprzepuszczalna forma wskaźnika zawiera grupy kwasów karboksylowych, które są w stanie następnie wykrywać i wiązać jony wapnia wewnątrzkomórkowo. Fluorescencja barwnika wrażliwego na wapń ulega przejściowej zmianie po związaniu z wapniem. Techniki obrazowania jedno- lub wielofotonowego służą do pomiaru zmian w fotonach emitowanych z barwnika, a tym samym wskazują na zmianę wewnątrzkomórkowego wapnia. Co więcej, te zależne od wapnia wskaźniki można łączyć z innymi markerami fluorescencyjnymi w celu zbadania typów komórek w sieci aktywnej.

Protocol

1. Tworzenie poziomych przekrojów mózgu śródwęchowo-hipokampowego

Wycinki mózgu śródwęchowo-hipokampowe są wykonane przy użyciu anatomicznych przewodników, szczegółowo opisanych w przeglądzie 3D regionu według Canto, Wouterlood & Witter (2008) Neural Plasticity ID 381243⁹.

1. Przygotuj 500 ml roztworu w plasterkach, natleniaj gazem karbogenicznym (95% tlenu, 5% dwutlenku węgla) przez co najmniej 20 minut, a następnie zamroź 250 ml do zamrożenia. Kilka minut przed krojeniem zmiażdż i zmiksuj plasterek lodu z pozostałymi 250 ml roztworu bulgoczących plastrów, który ma być użyty do rozbioru i krojenia w komorze krojenia.
2. Przygotować 200 ml r-ACSF (recovery ACSF) i co najmniej 500 ml roztworu e-ACSF (eksperymentalny ACSF). Oba roztwory należy w sposób ciągły natleniać gazem karbogenicznym (95% tlenu, 5% dwutlenku węgla) przez co najmniej 20 minut przed przygotowaniem tkanek.
3. Protokół ten obowiązuje u myszy od 0 dnia po urodzeniu do maksymalnie 3 tygodnia życia. Odciąć głowę zwierzęciu, zgodnie z procedurami lokalnej komisji etycznej, i szybko wyciąć mózg na szalce Petriego zawierającej lodowaty roztwór przygotowany w Kroku 1, powyżej (patrz Tabela 1 dla roztworów i odczynników).
4. Przenieś mózg na bibułę filtracyjną nasączoną roztworem plastrów i oddziel dwie półkule ostrą żyletką. Przenieś jedną półkulę z powrotem do lodowatego roztworu plastrów.
5. Usuń móżdżek z drugiej półkuli. Odwróć mózg na linię środkową i odetnij górną część mózgu pod lekkim kątem w kierunku końca rostralnego.
6. Odwróć mózg na przeciętą (grzbietową) powierzchnię i przyklej go do uchwytu na chusteczki krajalnicy do góry nogami, delikatnie popychając wacikiem.
7. Pokrój plastry mózgu o grubości 300 μm, używając niskiej częstotliwości i prędkości, w pozostałym lodowatym roztworze przygotowanym w kroku 1. W naszych warunkach używamy wibratomu Thermo Fisher Scientific (Microm, HM 650V) przy ustawieniach 0,05 mm/s i 36Hz.
8. Jak tylko plasterek zostanie pokrojony, przenieś go do uchwytu na plasterki (zanurzonego) zawierającego natleniony sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF) (2,5 mM Mg²⁺, 1,6 mM Ca²⁺; patrz Tabela 2) w temperaturze pokojowej. Wyższe stężenie magnezu w r-ACSF zmniejsza napływ wapnia do neuronów przez receptory NMDA po krojeniu i z naszego doświadczenia wynika, że prowadzi to do lepszej jakości plasterków do eksperymentów. W razie potrzeby przetnij drugą półkulę mózgową.
9. Pozostaw plastry na godzinę, aby zregenerowały się.

Roztwór plasterka (w mM) – ¹⁰ Rozdział 110 chlorek choliny 25 NaHCO₃ Rozdział 11,6 Rozdział 11,6 10 D-glukoza 7 MgCl₂ 3.1 pirogronian sodu Rozdział 2.5 Kcl Wydanie orzeczenia 1,25 NaH₂PO₄ 0,5 CaCl₂

Tabela 1. Przepis na roztwór w plasterkach.

ACSF (w mM) 125 Rozdział Zawartość NaCl 26 NaHCO₃ 10 D-glukoza 3 Kcl 2,5/1,5 MgCl₂ (odzysk/eksperyment) 1.6 CaCl₂ Wydanie orzeczenia 1,25 NaH₂PO₄

Tabela 2. Przepis zarówno na rozwiązanie regeneracyjne (r-ACSF), jak i eksperymentalne (e-ACSF).

2. Przygotowanie komory barwienia

Aby załadować komórki wskaźnikiem zależnym od wapnia lub markerem specyficznym dla komórki, plastry muszą zostać przeniesione do komory w celu przeprowadzenia procedury barwienia. Chociaż komory komercyjne mogą być dostępne, jedną z nich można łatwo zmontować ze standardowego sprzętu laboratoryjnego za bardzo niewielką cenę. Kluczową cechą takiej komory jest to, że plastry są podgrzewane do temperatury od 30 do 35°C, inkubowane w stale natlenionym podłożu i że komora jest osłonięta przed światłem.

1. Za pomocą podgrzewanego pręta wykonaj mały otwór w bocznej ścianie dwóch jednorazowych styropianowych szalek Petriego (średnica 35 i 100 mm), który jest wystarczająco duży, aby umożliwić przejście odcinka silikonowej rurki (średnica około 1,5 mm).
2. Przeciągnij silikonową rurkę przez otwór w małej szalce Petriego i uformuj pętlę wewnątrz wewnętrznej ścianki małego naczynia.
3. Użyj superglue, aby uszczelnić otwarty koniec rurki i przyklej resztę rurki do wewnętrznej ścianki szalki Petriego.
4. Za pomocą igły wykonaj drobne otwory w równych odstępach w rurki wewnątrz wewnętrznej szalki Petriego.
5. Przyklej mniejszą szalkę Petriego do większej, tak aby oba otwory były wyrównane. Przeciągnij drugi koniec silikonowej rurki przez otwór w ściance większej szalki Petriego.
6. W przypadku naczynia interfejsowego weź dobrze wkładkę do hodowli komórkowej z półprzepuszczalną membraną i za pomocą podgrzanego skalpela odetnij górną część 1 cm, aby pozostawić płytkie naczynie do przechowywania plastrów podczas inkubacji.
7. Na pokrywie większej szalki Petriego należy wykonać otwór o średnicy ok. 0,5-1 cm, aby umożliwić przepływ karbogenu (95% O₂, 5% CO_{2 )} do komory.
8. Weź plastikową strzykawkę o pojemności 5 lub 10 ml. Za pomocą rozgrzanego skalpela wykonaj cięcie pod kątem, aby usunąć koniec strzykawki i przytrzymaj końcówkę rurki strzykawki o kilka cm. Za pomocą kleju superglue przymocuj przeciętą powierzchnię rurki strzykawki do pokrywki szalki Petriego, nad otworem o średnicy 0,5-1 cm.
9. Podłącz silikonową rurkę i łącznik rurki do końcówki strzykawki. Podłącz kolejne złącze rurki do silikonowej rurki wchodzącej do podstawy szalek Petriego.
10. Podłącz obie rurki do regulatora zasilania karbogenem (95%_O2, 5% CO_{2 ).} Umieść komorę barwienia na gorącej płycie do inkubacji w temperaturze 30-35°C. Upewnij się, że komora może być osłonięta przed światłem podczas całego procesu inkubacji. Komora barwienia jest teraz gotowa do montażu i użycia do inkubacji plastrów.

Metodologia Rysunek 1. Przekrój poprzeczny komory barwienia przedstawiający inkubację plastrów (powyżej) i zastosowanie wskaźnika wrażliwego na wapń (pipetowany zielony barwnik, poniżej).

3. Barwienie plastrów

Podczas każdego obchodzenia się z barwnikami fluorescencyjnymi, unikaj fotowybielania poprzez pracę przy małym oświetleniu i trzymaj barwnik i poplamioną tkankę w ciemności między obchodzeniem się.

1. Umieść komorę barwienia na płycie grzewczej (35°C), podłącz ją do źródła gazu karbogenicznego i napełnij ją około 1,5 ml r-ACSF z uchwytu na plastry.
2. Umieść naczynie interfejsu w komorze barwienia i napełnij je 1 ml ACSF.
3. Zapewnij dobry dopływ karbogenu w komorze barwienia, aby ACSF bulgotał w delikatnym, stałym tempie.
4. Dodać 9 μl DMSO i 1 μl kwasu pluronowego (20% w roztworze podstawowym DMSO, Invitrogen) do fiolki z 50 μg Fura 2-AM. Mieszaj mieszankę barwników przez 15 minut.
5. Przenieś plastry do naczynia interfejsu i pipetuj barwnik do r-ACSF bezpośrednio nad interesującym obszarem hipokampa i kory śródwęchowej, jak wskazano na rysunku metodologicznym 1 (powyżej), uzyskując końcowe stężenie barwnika 50 mM.
6. Zamknij pokrywę komory barwienia i inkubuj barwnik przez 20 - 40 minut, w zależności od wieku zwierzęcia (patrz Tabela 3).
7. Przenieś plastry z powrotem do uchwytu na plasterki.

Wiek (dni po urodzeniu) Czas inkubacji (min) < str. 8 20 P8-P9 25 P10-P11 Rozdział 30 P12-13 powiedział: 35 Rozdział >str. 13 Rozdział 40

Tabela 3. Czasy inkubacji dla różnych grup wiekowych, określone empirycznie w laboratorium.

4. Inne barwniki i starsze tkanki

Być może z powodu zwiększonej mielinizacji w tkance mózgowej, plastry starszych gryzoni nie przyjmują estru Fura 2-AM tak łatwo. Aby ułatwić wchłanianie tego barwnika, stosuje się etap preinkubacji przy użyciu Cremophor EL (Sigma) dla mózgów myszy w wieku P13 i starszych¹¹ lat. Cremophor to niejonowy środek powierzchniowo czynny stosowany jako substancja pomocnicza w wielu zastosowaniach farmaceutycznych. Bez tego kroku okazuje się, że znakowanie specyficzne dla komórki jest bardzo słabe i niespójne w całym wycinku kory mózgowej.

1. Przenieś stare plastry do płytkiego naczynia do preinkubacji wypełnionego 3 ml r-ACSF i 8 μl 0,5% cremophoru (Sigma) podgrzewanego do 35°C przez 3 minuty.
2. Przenieś plastry do naczynia interfejsu i postępuj zgodnie z normalną procedurą barwienia (kroki 4-7, patrz wyżej).

Barwniki wapniowe ładują zarówno neurony, jak i nie-neurony w przygotowaniu plastrów. Aby zidentyfikować i rozróżnić te typy komórek w sieci, sulforodamina 101 (SR101) może być użyta do znakowania astrocytów w wycinku.

Barwienie plastrów na sulforodaminę 101

Postępuj zgodnie z krokami 1-3 jak poprzednio (sekcja 3).
Pobrać 1 μl 10 mM roztworu podstawowego sulforodaminy (Sigma) z magazynu w temperaturze -20°C i rozpuścić w 999 μl r-ACSF, aby uzyskać roztwór o stężeniu 10 μM. Odpipetuj plastry fioletowym barwnikiem jak poprzednio (kroki 5-7), pozostawiając plastry do inkubacji na okres 15 minut.

Komórki mikrogleju i śródbłonka są oznaczone barwnikiem lektynowym z pomidorów FITC.

Postępuj zgodnie z krokami 1-3 jak poprzednio.
Weź 25 μl roztworu podstawowego 2 mg / ml lektyny Lycopersicon esculentum (pomidor) ze koniugatem FITC (L0401, Sigma) w 2,5 ml r-ACSF, aby uzyskać stężenie 20 μg / ml. Odpipetuj barwnik na plastry jak poprzednio (kroki 5-7), pozostawiając plastry do inkubacji na okres 45 minut.

Zauważ, że nie jest możliwe połączenie tego barwnika ze wskaźnikiem wrażliwym na wapń, takim jak Fura 2-AM lub Oregon Green BAPTA-1 (OGB-1), który fluoryzuje w zielonym zakresie widma, ponieważ fotony z obu barwników będą emitowane na nakładających się długościach fal. Istnieją jednak inne barwniki wskaźnikowe wapnia, takie jak pomarańcza wapniowa, czerwień fura, które mogą być stosowane w połączeniu z odpowiednimi filtrami lub koniugaty lektyny Texas-Red w połączeniu z barwnikami wskaźnikowymi wapnia w zielonym spektrum.

5. Dołączanie plasterków do komory nagraniowej

Podczas obrazowania wycinki muszą być stabilne pod mikroskopem. Zwykle metalowa harfa jest umieszczana w celu przytrzymania tkanki, ale może nierównomiernie zniekształcić powierzchnię plasterka, dając tylko część pola widzenia do obrazowania w ostrości. Aby tego uniknąć, plastry są przyklejane do komory nagrywającej za pomocą polietylenotyniminy (PEI).

1. Przygotować roztwór PEI (1 ml roztworu polietylenoiminy w 250 ml buforu borowego (tabela 4)). Upewnij się, że PEI całkowicie się rozpuści (mieszaj przez noc).
2. Napełnij komory rejestracyjne roztworem PEI tak, aby dno było pokryte płynem co najmniej godzinę przed nałożeniem plastrów
3. Umyć komory nagraniowe wodą destylowaną, a następnie r-ACSF z komory trzymania.
4. Przenieś jeden plasterek do komory nagraniowej.
5. Wyjmij r-ACSF za pomocą pipety i umieść plasterek na środku za pomocą szczoteczki.
6. Usuń r-ACSF wokół plastra za pomocą kawałków bibuły filtracyjnej. Aby zapewnić stabilność i przyczepność, ważne jest, aby wokół plastra nie było już ACSF.
7. Odpipetować około 0,5-1 ml ACSF, w zależności od wielkości komory zapisu, na plasterek. ACSF powinien po prostu zakrywać powierzchnię plastru.
8. Umieść komorę nagrywającą z plastrem w dużym nawilżonym pojemniku na interfejsie, przesyconym karbogenem i pozwól plasterkom zregenerować się przez co najmniej godzinę.

rozwiązanie PEI 1ml Roztwór poli(etyleniminy) w 250 ml buforu borowego   40 mln Kwas borowy 10 mM Tetraboran sodu dekahydrat

Tabela 4. Receptura roztworu PEI.

6. Obrazowanie

Zależne od wapnia barwniki wskaźnikowe mogą być obrazowane za pomocą mikroskopii jedno- lub dwufotonowej. Zastosowanie obrazowania dwufotonowego aktywuje barwnik wskaźnikowy tylko w obrębie objętości ogniskowej obszaru zainteresowania, zmniejszając w ten sposób ilość rozpraszania światła w tkance. Co więcej, umożliwia lepszą penetrację światła w głąb plastru.

Do funkcjonalnego obrazowania wapnia używamy lasera tytanowo-szafirowego dostarczonego przez Coherent sprzężonego z mikroskopem Olympus z obiektywem 20x (NA 0,95) i systemem Trimscope firmy LaVision Biotec. System Trimscope umożliwia skanowanie klatek za pomocą 64 wiązek jednocześnie i jest sprzężony z kamerą Hamamatsu C9100 EM-CCD w celu szybkiego skanowania klatek.

1. Umieścić komorę rejestracyjną pod mikroskopem i ustalić stabilną perfuzję z obrazowaniem e-ACSF (stosunek 1,6 Ca^{2 +} / 1,5 Mg^{2 +} (tabela 2)) podgrzaną do bardziej fizjologicznej temperatury minimum 30 °C.
2. Ustaw ostrość na obszarze zainteresowania (ROI) za pomocą oświetlenia światłem białym. Unikaj wystawiania plastra na działanie światła dłużej niż to konieczne.
3. Wybierz długość fali, pole widzenia obrazowania, częstotliwość skanowania, gęstość pikseli i dodatkowe opcje oprogramowania mające zastosowanie do sygnałów tkankowych i biologicznych, które chcesz zmierzyć. Do obrazowania sieci wapniowej za pomocą Fura 2-AM zazwyczaj wybieramy długość fali 820 nm, pole widzenia obrazowania 250x250 μm, częstotliwość skanowania linii 1200 Hz i binning 2 na 2. Daje to czas wyświetlania klatki około 100 ms, a tym samym częstotliwość obrazowania około 10 Hz.
4. Sprawdź, czy zwrot z inwestycji jest ostry, korzystając z trybu ciągłego skanowania i wybranej długości fali światła laserowego. Dostosuj ostrość i intensywność lasera, aby uniknąć nasycenia pikseli i blaknięcia obrazu.
5. Nagraj film poklatkowy przedstawiający Twój zwrot z inwestycji. Zazwyczaj nabywamy dwa filmy poklatkowe po 2000 klatek każdy.
6. Aby wykryć i zidentyfikować komórki, wykonaj stos z rozmiarem kroku 1 μm i zobrazuj +/20 μm wokół obrazowanej płaszczyzny ostrości.

7. Reprezentatywne wyniki:

Pomyślne ładowanie wskaźników wapnia, Fura 2-AM pokazano na rysunku 1 w rozwijaniu sieci kory nowej i śródwęchowej za pomocą obrazowania wielofotonowego. Część barwnika jest nadal obecna jako barwienie tła w tkance, ale soma komórkowa, a w niektórych przypadkach dendryty proksymalne są wyraźnie widoczne i oddzielone od otaczającego neuropilu. Jeśli ładowanie nie powiodło się, obserwuje się bardzo mało barwienia specyficznego dla komórek, a małe skupiska plam barwnika są często widoczne na powierzchni plastra w martwych resztkach błony.

Na tych zrzutach ekranu sieć komórek jest wyraźnie widoczna w jednej płaszczyźnie ostrości dla jednoczesnego obrazowania komórek. Użycie metalowej harfy lub niepełne przyklejenie plastra do komory nagrywania może spowodować zobrazowanie nierównej powierzchni plastru.

Rysunek 1. Fura 2-AM obciążona estrem rozwijająca sieci kory nowej (A, po lewej) i śródwęchowej (B, po prawej). Podziałka liniowa 100 μm.
Aby oddzielić neurony od astrocytów, jednoczesne zastosowanie sulforodaminy 101 z estrem Fura 2-AM umożliwia rozdzielenie typów komórek w sieci.

Rysunek 2. Znakowanie astrocytów sulforodaminą 101. Wspólne znakowanie estru Fura 2-AM i sulforodaminy 101. Długość fali wzbudzenia: 820nm. Zbieranie obrazów na PMT ze zwierciadłem dichroicznym przy 560/70 nm dla separacji długości fal. B Reprezentatywne ślady fluorescencji z neuronu (powyżej) i astrocytu (poniżej). Podziałka 60 sek., ΔF 10 (au fluo).

Rysunek 3. Barwienie lektyną Lycopersicon esculentum (pomidor) sprzężone z FITC. Znakowanie komórek mikrogleju i śródbłonka w rozwijającym się hipokampie myszy (A) i powierzchownej korze śródwęchowej (B).

Barwniki wskaźnikowe wapnia są używane do odczytywania aktywności z wielu komórek jednocześnie w rozwijających się sieciach korowych i hipokampowych.

Rysunek 4. Dynamiczne stany przejściowe wapnia w sieciach hipokampa i kory mózgowej.

Film 1: Fura 2-AM ester ładowania kory śródwęchowej myszy w drugim tygodniu po porodzie.
Kliknij tutaj, aby wyświetlić film 1.

Film 2: Fura 2-AM ładowanie estrem estrowym hipokampa myszy w pierwszym tygodniu po porodzie.
Kliknij tutaj, aby obejrzeć film 2.

Film 3: Fluo-4 obciążenie kory myszy w pierwszym tygodniu po porodzie.
Kliknij tutaj, aby obejrzeć film 3.

W przypadku estru Fura 2-AM, aktywacja komórkowa polegająca na indukowanym depolaryzacją napływie wapnia zmniejsza fluorescencję barwnika. W przypadku barwników takich jak Fluo-4 jest odwrotnie i depolaryzację komórek obserwuje się jako wzrost emisji fotonów. Mierzy się głównie somatyczne stany przejściowe wapnia, ale aktywność w większych dendrytach proksymalnych można również zaobserwować w niektórych preparatach, jak pokazano na filmie 2.

Odczyt aktywności sieciowej może być określony ilościowo za pomocą komercyjnych lub wewnętrznych skryptów oprogramowania. W naszym laboratorium identyfikacja komórek i aktywność sieci są mierzone i analizowane w sposób półautomatyczny przy użyciu wewnętrznego kodu dla Matlab (Mathworks).

Rysunek 5. Reprezentatywna analiza zsynchronizowanych stanów przejściowych wapnia z rozwijającej się sieci korowej. Reprezentacja 3D jednego neuronu (A) używana do automatycznego tworzenia maski neuronu (B) ze stosu z tworzywa sztucznego w celu automatycznego wykrywania neuronów. Pomiary stanów przejściowych wapnia obejmują amplitudę, częstotliwość i # aktywnych komórek, które można odczytać z danych pojedynczego neuronu (C). Synchronizację między różnymi śladami można wizualizować za pomocą wykresu rastrowego (D).

Discussion

Metody, które tutaj demonstrujemy, pokazują odpowiednie protokoły obrazowania wapniowego dynamiki sieci z identyfikowalnych komórek w rozwijających się sieciach korowych i hipokampowych u myszy, a także w mózgu szczura. Metody te zapewniają optymalną rozdzielczość przestrzenną w celu jednoczesnej wizualizacji lokalnej sieci somy komórkowej w celu pomiaru aktywności ponadprogowej. Rozdzielczość czasowa aktywności sieciowej może być zmieniana, w zależności od ustawień kamery CCD z akwizycją klatek, w celu optymalizacji pomiarów sygnału:szumu dla długotrwałych zdarzeń ponadprogowych, zwykle występujących w rozwijającym się układzie nerwowym. Protokoły te nie ograniczają się do sieci hipokampa i kory mózgowej, ale także oznaczają komórki w całym rozwijającym się układzie nerwowym. Ograniczeniem tej metody jest to, że można rejestrować tylko aktywność ponadprogową.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Roztwory
CaCl2	Sigma Aldrich	22,350-6
Chlorek choliny	Sigma	C7527
kremafora	Fluka	27963	Cremophor EL®
DMSO (dimetylosulfotlenek)	Sigma Aldrich	472301
D-glukoza	Sigma Aldrich	16325
Fura-2 AM	Invitrogen	F-1221	opakowanie specjalne
KCl	Sigma Aldrich	60130
MgCl2	Fluka	63072
NaCl	Sigma Aldrich	31434
NaHCO3	Sigma Aldrich	31437
NaH2PO4	Merck	106346
Pluronic® F-127	Invitrogen	P-3000MP	20% roztwór w
askorbinianu sodu	DMSO Sigma	A7631
pirogronian sodu	Sigma Aldrich	P2256
Lektyna z Lycopersicon esculentum (pomidor)	Sigma	L0401
Chlorek kwasowy sulforodaminy 101	Sigma	S3388
Roztwór	poli(etyleniminy)Fluka	P3143
kwas borowy	Sigma	B6768
Dekahydrat tetraboranu sodu	Sigma	B3545
PEI
Komora
Strzykawka (5 lub 10 ml)	Terumo		z luer lock
Wkładki do hodowli komórkowych na płytki 6-dołkowe, 8,0 i mikro; m, przezroczysta membrana PET	BD Falcon&handel;
szalka Petriego (35 i 100 mm)			jednorazowa, polistyrenowe
rurki i łączniki
super klej
Uchwyty
Uchwyt			zanurzony
Komora
komora rejestracyjna	, np. sondy MEA