Artykuł metodologiczny

Ocena hipermutacji somatycznej w limfocytach B linii Ramos po nadekspresji lub wyciszeniu specyficznych genów

DOI:

10.3791/3573

⸱

1 listopada 2011

 , 
1Department of Immunology, Duke University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy sposób przeprowadzania infekcji retrowirusowych lub lentiwirusowych konstruktami do nadekspresji lub zawierającymi shRNA w ludzkiej linii komórek B Ramos oraz metodę pomiaru hipermutacji somatycznej w tych komórkach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Limfocyty B rozpoczynają swój rozwój z przeciwciałami o niskim powinowactwie, generowanymi poprzez rekombinację V(D)J. Jednak po wykryciu patogenu region zmienny (V) genu immunoglobuliny (Ig) ulega mutacjom około 100 000 razy częściej niż reszta genomu w procesie hipermutacji somatycznej (SHM), co prowadzi do powstania przeciwciał o wysokim powinowactwie1,2. Ponadto rekombinacja zmiany klasy (CSR) wytwarza przeciwciała o różnych funkcjach efektorowych, w zależności od rodzaju odpowiedzi immunologicznej wymaganej dla danego patogenu. Zarówno CSR, jak i SHM są inicjowane przez cytydynodeaminazę indukowaną aktywacją (AID), która deaminuje reszty cytozyny w DNA, tworząc uracyle. Uracyle te są przetwarzane przez podatne na błędy szlaki naprawcze, co ostatecznie prowadzi do mutacji i rekombinacji1-3.

Nasza obecna wiedza na temat szczegółów molekularnych SHM oraz CSR opiera się na połączeniu badań prowadzonych na myszach, komórkach pierwotnych, liniach komórkowych oraz w eksperymentach bezkomórkowych. Modele mysie pozostają złotym standardem, a genetyczne nokauty wykazały kluczową rolę wielu czynników naprawczych (np. Ung, Msh2, Msh6, Exo1 oraz polimerazy η)4-10. Jednak nie wszystkie geny nadają się do badań z wykorzystaniem nokautów. Przykładowo, nokauty kilku białek odpowiedzialnych za naprawę pęknięć dwuniciowych są letalne w okresie embrionalnym lub upośledzają rozwój limfocytów B11-14. Co więcej, specyficzna funkcja białka w procesie SHM lub CSR może być czasami maskowana przez bardziej globalne defekty wywołane nokautem. Ponadto, ponieważ eksperymenty na myszach mogą być czasochłonne, modyfikacja ekspresji poszczególnych genów w liniach komórkowych stała się coraz popularniejszym pierwszym krokiem w identyfikacji i charakteryzacji genów kandydackich15-18.

Ramos – linia komórkowa chłoniaka Burkitta, w której konstytutywnie zachodzi SHM – jest popularnym modelem komórkowym do badania SHM18-24. Jedną z zalet komórek Ramos jest to, że posiadają one wbudowaną, wygodną, półilościową miarę SHM. Komórki typu dzikiego wykazują ekspresję IgM, a w miarę powstawania mutacji, niektóre z nich prowadzą do zniesienia ekspresji IgM. Zatem analiza utraty IgM za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS) zapewnia szybki odczyt poziomu SHM. Bardziej ilościowy pomiar SHM można uzyskać poprzez bezpośrednie sekwencjonowanie genów przeciwciał.

Ponieważ komórki Ramos są trudne do transfekcji, wytwarzamy stabilne pochodne o zwiększonej lub zmniejszonej ekspresji pojedynczego genu poprzez zakażanie komórek konstruktami retrowirusowymi lub lentiwirusowymi, które zawierają odpowiednio kasetę nadekspresyjną lub krótką zapinkę RNA (shRNA). W niniejszej pracy opisujemy sposób zakażania komórek Ramos, a następnie wykorzystanie tych komórek do badania roli specyficznych genów w procesie SHM (Rycina 1).

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie próbek i komórek

  1. Przeprowadź średnioskalowey przygotowanie DNA (midiprep) konstruktów do nadekspresji lub zawierających shRNA oraz retrowirusowego wektora pakującego pKat2 lub lentiwirusowych wektorów pakujących pVSV-G, pMDLg/pRRE i pRSV-Rev25. Użyj 6 μg DNA dla każdego konstruktu oraz 4 μg pKat2 (dla infekcji retrowirusowych) lub 1,5 μg DNA dla każdego z wektorów pakujących pVSV-g, pMDLg/pRRE i pRSV-Rev (dla infekcji lentiwirusowych).
  2. Przygotuj pożywki dla BOSC 23. Do transfekcji użyj zarówno niezmodyfikowanego podłoża DMEM (Dulbecco′s modified Eagle′s medium), jak i pełnego DMEM. Aby przygotować pełne DMEM, dodaj do butelki DMEM 1% bufor HEPES, 1% penicyliny-streptomycyny-glutaminy (PGS) oraz 10% surowicy z noworodka cielęcia (NCS).
  3. Przygotuj pożywki dla Ramos. Do etapu infekcji przygotuj pełne podłoże RPMI-1640 (RPMI), dodając do butelki RPMI 1% HEPES, 1% PGS i 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Do etapu wysiewu pojedynczych komórek przygotuj pożywkę „warunkowaną”, hodując komórki Ramos w pełnym RPMI przez 2 dni, odwirowując komórki przy 400 X g przez 4 minuty i filtrując nadsącz przez filtr 0,2 μm do sterylnej butelki. Podobnie jak inne pełne pożywki, pożywka warunkowana jest przechowywana w temperaturze 4°C do momentu użycia.
  4. Dzień przed transfekcją wysiej 3 x 106 komórek BOSC 23 na płytkę 100-mm w 10 mL pełnego DMEM, tak aby w dniu transfekcji komórki osiągnęły 50-60% konfluencji. Przygotuj jedną płytkę komórek dla każdego wektora, który planujesz transfekować. Ważne jest, aby komórki nie były hodowane zbyt długo; zarówno do etapu transfekcji, jak i infekcji używaj komórek o niskim numerze pasażu lub świeżo rozmrożonych, aby zapewnić wysoką efektywność infekcji.
  5. Uwzględnij kontrole w swoich eksperymentach. Dla transfekcji i infekcji stwórz kontrolę negatywną (komórki nietransfekowane lub niezinfekowane) oraz kontrolę pozytywną (wirus wykazujący ekspresję GFP i genu oporności na puromycynę). W przypadku eksperymentów z wyciszaniem shRNA, zainfekuj studzienkę kontrolą z shRNA o sekwencji losowej (scrambled) lub nieistotnej.

2. Transfekcja komórek BOSC 23

  1. Podgrzać butelki z nieuzupełnionym DMEM oraz pełnym DMEM do 37°C.
  2. Usunąć pożywkę z komórek BOSC 23 i zastąpić ją 5 mL pełnego DMEM. Przenieść komórki do inkubatora w temperaturze 37°C do czasu wykonania kroku 2.6.
  3. Podgrzać butelkę z FuGENE 6 w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie krótko wymieszać w wirówce vortex (<1 sekunda).
  4. Odmierzyć 600 μL nieuzupełnionego DMEM do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL.
  5. Rozcieńczyć 30 μL FuGENE 6 w 600 μL nieuzupełnionego DMEM, krótko wymieszać w wirówce vortex (<1 sekunda), a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Należy uważać, aby pipetować bezpośrednio do pożywki. Nie dopuścić, aby FuGENE 6 dotknął ścianek probówki.
  6. Dodać 6 μg konstruktu oraz albo 4 μg pKat2 (w przypadku infekcji retrowirusowych), albo po 1,5 μg pVSV-G, pMDLg/pRRE i pRSV-Rev (w przypadku infekcji lentiwirusowych) do mieszaniny DMEM/FuGENE 6, krótko wymieszać w wirówce vortex (<1 sekunda), a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 25 minut.
  7. Dodać mieszaninę DNA/DMEM/FuGENE 6 do komórek BOSC 23 i przenieść do inkubatora w temperaturze 37°C na 24 godziny.
  8. Po 24 godzinach dodać 5 mL pełnego DMEM do transfekowanych komórek i przenieść do inkubatora w temperaturze 37°C na kolejne 24 godziny.

3. Pozyskiwanie cząsteczek wirusa

  1. Pobrać 10 mL pożywki od transfektowanych komórek BOSC 23 za pomocą strzykawki 10 mL.
  2. Do końcówki strzykawki przymocować filtr 0,45 μm i przefiltrować pożywkę do czystej polipropylenowej probówki 15 mL.
  3. Pożywkę wirusową wykorzystać niezwłocznie lub zamrozić w alikwotach 1 mL w probówkach kriogenicznych 2 mL w temperaturze -80°C.
  4. Po pobraniu pożywki wirusowej potwierdzić za pomocą FACS, czy w komórkach kontroli pozytywnej nastąpiła efektywna transfekcja. Można to również wykonać dla wszystkich próbek, jeśli konstrukt zawiera marker fluorescencyjny (np. GFP) lub marker powierzchniowy komórki (np. Thy1).

4. Zakażanie limfocytów B

  1. Na 24 godziny przed infekcją wysiać 2 mL zawiesiny komórek Ramos o zagęszczeniu 2 x 105 cells/mL w pełnej pożywce RPMI do płytki 6-dołkowej. Ponownie, należy upewnić się, że użyte komórki mają niski numer pasażu lub zostały niedawno rozmrożone, aby zapewnić wysoką wydajność infekcji.
  2. W przypadku użycia zamrożonych aliquotów wirusa, szybko rozmrozić medium wirusowe w temperaturze 37°C.
  3. Zmieszać 1 mL medium wirusowego z 3 μL polybrene o stężeniu 10 mg/mL. Końcowe stężenie polybrene powinno wynosić 10 μg/mL w całkowitej objętości 3 mL.
  4. Dodać mieszaninę wirusa i polybrene do komórek i dokładnie wymieszać za pomocą pipety. Jak wspomniano wcześniej, jeden dołek powinien służyć jako kontrola nieinfekowana; do tego dołka należy dodać 1 mL pełnej pożywki RPMI i 3 μL polybrene zamiast 1 mL wirusa. Należy również zainfekować jeden dołek dopasowaną kontrolą negatywną. Dodatkowo jeden dołek infekujemy wektorem zawierającym GFP, aby określić wydajność infekcji za pomocą FACS.
  5. Wirować płytkę 6-dołkową z prędkością 3000 X g przez 90 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Przenieść płytkę do inkubatora w temperaturze 37°C na 48 godzin.
  7. Po 48 godzinach zwirować zainfekowane komórki w 15 mL probówce polipropylenowej z prędkością 400 X g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej. Usunąć medium poprzez aspirację, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego. Resuspendować komórki w świeżej pożywce RPMI.
  8. Potwierdzić wydajność infekcji w próbce kontroli pozytywnej za pomocą FACS. Podobnie jak wcześniej, można to przeprowadzić dla wszystkich próbek, jeśli konstrukt zawiera marker fluorescencyjny (np. GFP) lub marker powierzchniowy komórki (np. Thy1).
  9. Rozpocząć selekcję komórek (jeśli dotyczy). Nasze konstrukty zawierające shRNA posiadają kasetę oporności na puromycynę. Selekcję zainfekowanych shRNA komórek Ramos przeprowadzamy przy użyciu 0,25 μg/mL puromycyny. Zauważyliśmy, że pochodne komórek Ramos wykazują czasem zmienną wrażliwość na puromycynę, dlatego wykonujemy krzywe przeżywalności (kill curves), aby zoptymalizować stężenie puromycyny dla każdej pochodnej. Należy również poddać działaniu puromycyny nieinfekowane komórki kontrolne, aby potwierdzić skuteczność selekcji.

5. Wysiew pojedynczych komórek

Pojedynczy wysiew można przeprowadzić na dwa sposoby: za pomocą sortowania FACS lub ręcznie.

  1. FACS: Należy użyć sortera FACS z adapterem do płytek, aby zasiać 1 komórkę na dołek w płytce 96-dołkowej wypełnionej wcześniej 100 μL pożywki składającej się z 40% RPMI, 40% pożywki warunkującej i 20% FBS. Metoda ta pozwala uzyskać znacznie więcej klonów pojedynczych komórek na płytce.
  2. Metodą ręczną: Należy policzyć komórki. Alikwot komórek należy rozcieńczyć do stężenia 10 komórek/mL w 40% RPMI, 40% pożywki warunkującej i 20% FBS. Na każdą wysiewaną płytkę należy użyć 10 mL rozcieńczonych komórek. Różne klony wykazują zmienną przeżywalność na tym etapie, dlatego warto przygotować kilka płytek o różnych stężeniach (w zakresie od 3 do 20 komórek/mL). Należy wybrać tę, która daje mniej wielokomórkowych wypustek, aby uniknąć klonów powstałych z wielu komórek. Do wysiewu 100 μL rozcieńczonych komórek do płytek 96-dołkowych należy użyć pipety wielokanałowej.
  3. Płytkę należy umieścić w inkubatorze w temperaturze 37°C na 2 tygodnie.
  4. Jeden dzień po wysiewie należy sprawdzić poszczególne dołki pod mikroskopem, aby potwierdzić obecność komórek. Pojedyncze komórki mogą być trudne do znalezienia ze względu na konieczność ustawienia ostrości na odpowiedniej głębokości. Pomocne może być ustawienie ostrości na numerach dołków nadrukowanych na dnie płytki 96-dołkowej. Komórki są łatwiejsze do znalezienia po wysiewie sorterem FACS, ponieważ większość dołków zawiera komórkę.
  5. Po 2 tygodniach rosnące kolonie mogą być ledwo widoczne gołym okiem przy oglądaniu płytek od dołu. Są one znacznie łatwiejsze do zauważenia pod mikroskopem. Kolonie mają tendencję do wzrostu wzdłuż krawędzi dołka i zazwyczaj większość kolonii na płytce rośnie wzdłuż tej samej krawędzi w różnych dołkach. Należy zaznaczyć dołki z intensywnym wzrostem komórek, przenieść komórki do płytek 24-dołkowych w 1 mL RPMI i ponownie umieścić w inkubatorze w 37°C.
  6. Komórki należy utrzymywać w zagęszczeniu od 1 x 105 do 1 x 106 komórek/mL. Pożywkę wymienia się poprzez wirowanie komórek z prędkością 400 X g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej i usunięcie pożywki w razie potrzeby. Należy zastąpić ją 1 mL świeżego RPMI.
  7. Po kilku dniach wzrostu komórki należy przenieść do płytki 6-dołkowej i kontynuować hodowlę w inkubatorze w 37°C.
  8. Po 3 tygodniach należy przeanalizować klony pod kątem utraty IgM (zgodnie z opisem poniżej).
  9. Należy kontynuować hodowlę komórek przez kolejne 2 tygodnie, a następnie ponownie przeanalizować klony w 5. tygodniu.

6. Analiza: utrata IgM (3. i 5. tydzień)

  1. Przenieś 5 x 105 komórek z każdej studni do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL i odwiruj komórki przy 400 X g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej. Wykorzystaj komórki z każdej studni kontrolnej i studni z wyciszeniem shRNA, a także jedną próbkę jako kontrolę niebarwioną.
  2. Przemyj komórki w 1 mL PBS, a następnie ponownie odwiruj przy 400 X g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.
  3. Resuspenduj w 50 μL PBS (kontrola niebarwiona) lub PBS z 1:20 rozcieńczeniem przeciwciała α-human IgM znakowanego PE. Inkubuj na lodzie przez 1 godzinę.
  4. Odwiruj komórki przy 400 X g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.
  5. Przemyj komórki dwukrotnie 1 mL PBS i odwiruj przy 400 X g przez 4 minuty za każdym razem w temperaturze pokojowej.
  6. Usuń nadosad i resuspenduj w 100 μL PBS. Przenieś zresuspendowane, zabarwione komórki do probówki do FACS.
  7. Przeanalizuj komórki za pomocą cytometru przepływowego FACS.
  8. Porównaj procent komórek IgM- w próbkach kontrolnych i komórkach z wyciszeniem shRNA. Jak wspomniano wcześniej, utrata IgM mierzona za pomocą FACS jest wiarygodną półilościową miarą SHM w komórkach Ramos.

7. Analiza: Potwierdzenie wyciszenia genu za pomocą ilościowej RT-PCR (5 tygodni)

  1. Odmiar 3 x 106 komórek z każdej studzienki i odwiruj przy 400 X g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.
  2. Wyizoluj RNA z pobranej porcji komórek. Stosujemy odczynnik TRIzol zgodnie z zaleceniami producenta.
  3. Przygotuj cDNA z wyizolowanego RNA. Stosujemy 2 μg RNA oraz zestaw Superscript II zgodnie z zaleceniami producenta.
  4. Przeprowadź ilościową reakcję PCR z wykorzystaniem cDNA w celu potwierdzenia wyciszenia genu. Jako kontrolę normalizacji stosujemy GAPDH oraz zestaw SYBR FAST qPCR w całkowitej objętości reakcji 10 μL.

8. Analiza: Sekwencjonowanie genomiczne (5 tygodni)

  1. Odpiąć 5 x 106 komórek z każdej studni i odwirować przy 400 X g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.
  2. Wyizolować DNA genomiczne z tych komórek. Stosujemy zestaw do oczyszczania DNA genomicznego Wizard SV zgodnie z zaleceniami producenta.
  3. Przeprowadzić amplifikację PCR DNA genomicznego dla genów Ig V19 (Tabela 1) oraz innych genów zainteresowania, używając polimerazy KAPA HiFi DNA. Stosujemy tę polimerazę ze względu na niski współczynnik błędów, jednak każda polimeraza PCR o wysokiej wierności powinna być odpowiednia.
  4. Oczyścić produkty PCR za pomocą żelowej elektroforezy na 1% żelu agarozowym, korzystając z zestawu do ekstrakcji z żelu QIAquick.
  5. Niektóre polimerazy dodają pojedynczą resztę deoxyadenozyny (A) do końców 3′ produktów PCR, podczas gdy inne tego nie robią. Te ogony 3′ A są niezbędne do etapu klonowania TOPO TA. Polimeraza KAPA HiFi nie pozostawia ogonów 3′ A. Należy przeprowadzić A-tailing produktów PCR, inkubując 25 μL oczyszczonego z żelu produktu PCR z 3 μL 10x buforu reakcyjnego Taq, 1 μL 10 mM dNTPs i 1 jednostką polimerazy Taq w temperaturze 72°C przez 30 minut.
  6. Sklonować oczyszczone z żelu produkty PCR przy użyciu zestawu TOPO TA Cloning. Przetransformować produkty z reakcji TOPO do dostarczonych kompetentnych komórek E. coli DH5α-T1R i wysiać na płytki LB/agar zawierające 100 μg/mL ampicyliny i uzupełnione o 1,6 mg X-gal zgodnie z zaleceniami producenta.
  7. Przekazać wybrane pojedyncze kolonie do sekwencjonowania.
  8. Przeprowadzić analizę sekwencji w celu określenia typów i lokalizacji mutacji.

9. Reprezentatywne wyniki:

Jak wspomniano wcześniej, stosujemy pozytywny kontrolny wektor wirusowy, który wykazuje ekspresję zarówno GFP, jak i genu oporności na puromycynę. Zazwyczaj obserwujemy 50-75% komórek GFP+ dwa dni po transfekcji. W naszych infekcjach zazwyczaj 50-70% komórek jest GFP+ dwa dni po infekcji, lecz przed selekcją. Po zakończeniu selekcji >95% komórek to komórki GFP+.

Jako przykładowe eksperymenty przedstawiamy efekty nadekspresji AID lub wyciszenia czynnika naprawczego w komórkach Ramos. W szczególności, do komórek BOSC 23 przetransfekowano retrowirusowy wektor nadekspresyjny dla AID połączony poprzez miejsce IRES z Thy1.1 wraz z retrowirusowym wektorem pakującym pKat2. Pożywka zawierająca wirusy została przefiltrowana, a następnie wykorzystana do zakażenia komórek Ramos. Zarówno komórki typu dzikiego (WT), jak i komórki nadekspresujące AID (AIDhi) wysiano pojedynczo i hodowano przez 3 tygodnie, po czym przeanalizowano ekspresję genów za pomocą qRT-PCR (Rysunek 2) oraz utratę IgM za pomocą FACS (Rysunek 3). Do barwienia FACS komórki inkubowano z rozcieńczonym 1:20 przeciwciałem α-human IgM znakowanym PE oraz rozcieńczonym 1:400 przeciwciałem α-rat CD90/mouse CD90.1 (Thy1.1) znakowanym FITC. W oddzielnym eksperymencie w komórkach BOSC 23 wytworzono lentiwirusy zawierające albo nieistotne shRNA (kontrolne), albo shRNA przeciwko czynnikowi wysokowiernej naprawy DNA, który według przewidywań chroni przed SHM, a następnie zainfekowano nimi klon AIDhi komórek Ramos. Ponownie, po 3 tygodniach w klonach pojedynczych komórek przeanalizowano ekspresję genów (Rysunek 4) oraz utratę IgM (Rysunek 5). Ponieważ przyjmuje się, że czynnik naprawczy zapewnia ochronę przed mutacjami podczas SHM, w przypadku braku tego czynnika obserwujemy wzrost utraty IgM i SHM. Gdybyśmy wyciszyli czynnik zaangażowany w generowanie mutacji związanych z SHM, zaobserwowalibyśmy zamiast tego spadek utraty IgM.

Zgodnie z oczekiwaniami, nasze wyniki qRT-PCR wykazują wyraźny wzrost ekspresji AID po infekcji komórek wektorem nadekspresyjnym AID (Rycina 2), podczas gdy poziomy czynnika naprawy DNA spadają w obecności ukierunkowanego shRNA przeciwko temu czynnikowi (Rycina 4). Ponieważ poszczególne klony mogą się różnić, można zaobserwować pewne zróżnicowanie poziomów ekspresji genów. Ze względu na tę zmienność konieczne jest potwierdzenie ekspresji w każdym klonie, który planuje się poddać dalszej analizie. Różne shRNA przeciwko temu samemu genowi mogą również mieć odmienny wpływ na jego ekspresję, dlatego należy przetestować kilka shRNA, aby określić, który z nich wykazuje największy efekt. Wyciszenie genu można potwierdzić również na poziomie białka za pomocą immunoblottingu. Podobnie, poszczególne klony mogą znacznie różnić się poziomem utraty IgM. Niektóre klony mogą wykazywać efekt „jackpota”, w którym mutacja IgM wystąpiła podczas jednego z najwcześniejszych podziałów komórkowych – na przykład można zaobserwować >50% utraty IgM po prostu dlatego, że jedna z komórek stała się IgM- na etapie dwukomórkowym. Wpływ tych klonów jest minimalizowany poprzez obliczenie mediany dla kilku klonów pojedynczych komórek.

Schemat procesu transfekcji; transfekcja DNA, zbiór cząstek wirusowych, infekcja, analiza qRT-PCR.
Rysunek 1. Schemat transfekcji, infekcji i analizy utraty IgM. Szczegóły znajdują się w tekście.

Wykres porównania ekspresji AID; typ dziki vs zmodyfikowany; analiza ekspresji genów; dane naukowe.
Rycina 2. Nadmierna ekspresja AID w komórkach Ramos. Komórki Ramos WT oraz AIDhi poddano klonowaniu pojedynczych komórek i hodowano przez 3 tygodnie, po czym zmierzono ekspresję AID w poszczególnych klonach za pomocą qRT-PCR. Do normalizacji wykorzystano ekspresję GAPDH. Dla WT przyjęto wartość 1. Wskazano wartość mediany. * oznacza wartość p <0.01, obliczoną za pomocą jednostronnego testu t Studenta.

Wykresy kropkowe i wykres rozrzutu z cytometrii przepływowej, ekspresja IgM vs AID-Thy1.1, analiza WT vs AID^hi.
Rycina 3. Zwiększona utrata IgM w komórkach AIDhi w porównaniu do komórek WT. Poziom powierzchniowego IgM zmierzono za pomocą FACS w 3. tygodniu, a następnie obliczono procent utraty IgM dla komórek WT i AIDhi. (A) Reprezentatywny wykres FACS klonu WT i klonu AIDhi. Wektor nadekspresji AID zawiera AID połączone z Thy1.1 poprzez miejsce IRES, dlatego ekspresja Thy1.1 służy jako wskaźnik ekspresji AID. (B) Ilościowe określenie utraty IgM w kilku klonach WT i AIDhi. Wskazano wartość mediany. * oznacza wartość p <0.01, obliczoną za pomocą jednostronnego testu t Studenta.

Porównanie ekspresji genów, kontrola vs. shRNA, wartości znormalizowane, naukowa analiza danych, wykres.
Rycina 4. Wyciszenie czynnika naprawczego w komórkach AIDhi. Komórki zainfekowano albo nieistotnym kontrolnym shRNA (control), albo badanym shRNA (shRNA), a następnie wysiano pojedyncze komórki. Po 3 tygodniach zmierzono ekspresję genów w poszczególnych klonach za pomocą qRT-PCR. Do normalizacji wykorzystano ekspresję GAPDH. Wartość WT ustawiono na 1. Wskazano wartość mediany. * oznacza wartość p <0,01, obliczoną za pomocą jednostronnego testu t Studenta.

Analiza utraty %IgM w grupie kontrolnej i shRNA; wykres punktowy wyników badania ekspresji genów.
Rycina 5. Zwiększona utrata IgM w komórkach AIDhi z obniżonym poziomem czynnika naprawczego. Poziom powierzchniowego IgM w kilku klonach zmierzono metodą FACS w 3. tygodniu, a następnie obliczono procent utraty IgM w komórkach nadal nadekspresujących AID. Wskazano wartość mediany. * oznacza wartość p <0.01, obliczoną za pomocą jednostronnego testu t Studenta.

Tabela sekwencji starterów genowych dla Cμ, V_H, V_L; użyta w badaniach amplifikacji genetycznej.
Tabela 1. Sekwencje starterów dla genów Ig19: regionu stałego Cμ, regionu V łańcucha ciężkiego (VH) oraz regionu V łańcucha lekkiego (VL).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jak omówiono wcześniej, modele linii komórkowych służące do badania dywersyfikacji przeciwciał stały się popularnym punktem wyjścia w celu identyfikacji nowych białek wpływających na poszczególne etapy tego procesu. Przedstawiamy tutaj metodę wykorzystującą infekcję wirusową do wyciszenia (knock-down) lub nadekspresji białek w linii komórkowej limfocytów B Ramos, a następnie analizę wpływu tych modyfikacji na proces SHM.

W badaniach tych wykorzystujemy zarówno komórki Ramos WT, jak i Ramos AID...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wektory pMSCV-AID-I-Thy1.1 oraz pKat2 zostały udostępnione przez D. G. Schatz, natomiast wektory pVSV-G, pRSV-Rev oraz pMDLg/pRRE zostały udostępnione przez B. R. Cullen.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sugerowane odczynniki – większość z nich można zastąpić podobnymi produktami innych dostawców.
przezroczyste płytki 6-dołkowe traktowane TCCorning3516
strzykawki 10 mL BD Luer-LokBD Biosciences309604
przezroczyste płytki 24-dołkowe traktowane TCCorning3526
przezroczyste 96-dołkowe mikropłytki polistyrenowe o płaskim dnie z modyfikacją TCCorning3596
szalki hodowlane 100 mm traktowane TCCorning430167
filtry strzykawkowe Acrodisc, 0,45 μmPall Corporation4604
AgarTEKnova, Inc.A7777
AgarozaGeneMateE-3120-500
AmpicylinaSigma-AldrichA0166100 mg/mL w wodzie
cytometr przepływowy BD FACSCanto IIBD Bioscienceslub podobny
Probówki polistyrenowe z okrągłym dnem BD FalconBD Biosciences352054do FACS
komórki BOSC 23ATCCCRL-11270
Tlenek węgla2 inkubator z możliwością utrzymania temperatury 37°C°C
DMEM (podłoże Dulbecco)′zmodyfikowane podłoże Eagle′pożywka s)Sigma-AldrichD6429
FBS (płodowa surowica bydlęca)Gemini Bio Products100-106
FITC αprzeciwciało przeciwko szczurzemu CD90/mysiemu CD90.1 BioLegend202503FITC α-Thy1.1
Odczyn do transfekcji FuGENE 6Grupa Roche11814443001
roztwór buforu HEPESInvitrogen15630-080
KAPA HiFi DNA polimerazaKAPA BiosystemsKK2101
Pożywka LB (lysogeny broth - Luria) w proszkuDifco Laboratories240230
bakteryjny stok glicerolowy shRNA MISSION TRCSigma-Aldrichwektory shRNA
NCS (surowica noworodka cielęcia)Gemini Bio Products100-504
PBS (roztwór buforu fosforanowego)Invitrogen70011rozcieńczone do stężenia 1x w wodzie
PE α-ludzkie przeciwciało IgMBioLegend314508
PGS (roztwór penicyliny-streptomycyny-glutaminy)Gemini Bio Products400-110
Polybrene (bromek heksadymetryny)Sigma-Aldrich10768910 mg/ml w wodzie
Zestaw do midipreparacji plazmidów PureYieldPromega Corp.A2495
PuromycynaSigma-AldrichP8833250 μg/mL w wodzie
zestaw do oczyszczania DNA z żelu QIAquickQiagen28706
komórki Ramos (RA 1)ATCCCRL-1596
pożywka RPMI-1640 Sigma-AldrichR8758
SuperScript IIInvitrogen18064-022
zestaw SYBR FAST qPCRKAPA BiosystemsKK4601
Polimeraza DNA TaqInvitrogen18038-042
zestaw do klonowania TOPO TAInvitrogenK4520-01
TRIzolInvitrogen15596-026
System do oczyszczania genomicznego DNA Wizard SVPromega Corp.A2361
X-Gal [5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktopyranozyd]Hodowla komórekC-568740 mg/mL w DMSO

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Di Noia, J. M., Neuberger, M. S. Molecular mechanisms of antibody somatic hypermutation. Annu. Rev. Biochem. 76, 1-22 (2007).
  2. Peled, J. U. The biochemistry of somatic hypermutation. Annu. Rev. Immunol. 26, 481-511 (2008).
  3. Longerich, S., Basu, U., Alt, F., Storb, U. AID in somatic hypermutation and class switch recombination. Curr. Opin. Immunol. 18, 164-174 (2006).
  4. Bardwell, P. D. Altered somatic hypermutation and reduced class-switch recombination in exonuclease 1-mutant mice. Nat. Immunol. 5, 224-229 (2004).
  5. Martomo, S. A., Yang, W. W., Gearhart, P. J. A role for Msh6 but not Msh3 in somatic hypermutation and class switch recombination. J. Exp. Med. 200, 61-68 (2004).
  6. Phung, Q. H. Increased hypermutation at G and C nucleotides in immunoglobulin variable genes from mice deficient in the MSH2 mismatch repair protein. J. Exp. Med. 187, 1745-1751 (1998).
  7. Rada, C., Ehrenstein, M. R., Neuberger, M. S., Milstein, C. Hot spot focusing of somatic hypermutation in MSH2-deficient mice suggests two stages of mutational targeting. Immunity. 9, 135-141 (1998).
  8. Rada, C. Immunoglobulin isotype switching is inhibited and somatic hypermutation perturbed in UNG-deficient mice. Curr. Biol. 12, 1748-1755 (2002).
  9. Delbos, F., Aoufouchi, S., Faili, A., Weill, J. C., Reynaud, C. A. DNA polymerase eta is the sole contributor of A/T modifications during immunoglobulin gene hypermutation in the mouse. J. Exp. Med. 204, 17-23 (2007).
  10. Masuda, K. DNA polymerase eta is a limiting factor for A:T mutations in Ig genes and contributes to antibody affinity maturation. Eur. J. Immunol. 38, 2796-2805 (2008).
  11. Lim, D. S., Hasty, P. A mutation in mouse rad51 results in an early embryonic lethal that is suppressed by a mutation in p53. Mol. Cell. Biol. 16, 7133-7143 (1996).
  12. Xiao, Y., Weaver, D. T. Conditional gene targeted deletion by Cre recombinase demonstrates the requirement for the double-strand break repair Mre11 protein in murine embryonic stem cells. Nucleic. Acids. Res. 25, 2985-2991 (1997).
  13. Zhu, J., Petersen, S., Tessarollo, L., Nussenzweig, A. Targeted disruption of the Nijmegen breakage syndrome gene NBS1 leads to early embryonic lethality in mice. Curr. Biol. 11, 105-109 (2001).
  14. Luo, G. Disruption of mRad50 causes embryonic stem cell lethality, abnormal embryonic development, and sensitivity to ionizing radiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7376-7381 (1999).
  15. Pavri, R. Activation-induced cytidine deaminase targets DNA at sites of RNA polymerase II stalling by interaction with Spt5. Cell. 143, 122-133 (2010).
  16. Lee-Theilen, M., Matthews, A. J., Kelly, D., Zheng, S., Chaudhuri, J. CtIP promotes microhomology-mediated alternative end joining during class-switch recombination. Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 75-79 (2011).
  17. Basu, U. The RNA exosome targets the AID cytidine deaminase to both strands of transcribed duplex DNA substrates. Cell. 144, 353-363 (2011).
  18. Yabuki, M., Fujii, M. M., Maizels, N. The MRE11-RAD50-NBS1 complex accelerates somatic hypermutation and gene conversion of immunoglobulin variable regions. Nat. Immunol. 6, 730-736 (2005).
  19. Sale, J. E., Neuberger, M. S. TdT-accessible breaks are scattered over the immunoglobulin V domain in a constitutively hypermutating B cell line. Immunity. 9, 859-869 (1998).
  20. Cumbers, S. J. Generation and iterative affinity maturation of antibodies in vitro using hypermutating B-cell lines. Nat. Biotechnol. 20, 1129-1134 (2002).
  21. Papavasiliou, F. N., Schatz, D. G. Cell-cycle-regulated DNA double-stranded breaks in somatic hypermutation of immunoglobulin genes. Nature. 408, 216-221 (2000).
  22. Parsa, J. Y. AID mutates a non-immunoglobulin transgene independent of chromosomal position. Mol. Immunol. 44, 567-575 (2007).
  23. Zhang, W. Clonal instability of V region hypermutation in the Ramos Burkitt's lymphoma cell line. Int. Immunol. 13, 1175-1184 (2001).
  24. Ukai, A. Induction of a:T mutations is dependent on cellular environment but independent of mutation frequency and target gene location. J. Immunol. 181, 7835-7842 (2008).
  25. Dull, T. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).
  26. Nakamura, M. High frequency class switching of an IgM+ B lymphoma clone CH12F3 to IgA+ cells. Int. Immunol. 8, 193-201 (1996).
  27. Muramatsu, M. Specific expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells. J. Biol. Chem. 274, 18470-18476 (1999).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

nadekspresja genuwyciszanie genuinfekcja wirusowacytometria przep ywowaanaliza utraty IgMkonstrukty retrowirusowekonstrukty lentiwirusoweekspresja AID

Powiązane artykuły