Opisujemy zestaw analiz służących do badania poziomów ekspresji histonów łączących H1. Ilościowy pomiar mRNA poszczególnych genów H1 przeprowadzono za pomocą odwrotnej transkrypcji z zastosowaniem randomowych starterów, a następnie w czasie rzeczywistym za pomocą techniki PCR, natomiast do ilościowego oznaczenia białek histonów H1 wykorzystano analizę HPLC.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Analiza ekspresji podtypów histonów łączących u ssaków
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Histona łącząca H1 wiąże się z rdzeniem nukleosomu i DNA łącznikowym, ułatwiając zwijanie chromatyny w struktury wyższego rzędu. H1 jest niezbędna dla rozwoju ssaków1 i reguluje ekspresję specyficznych genów in vivo2-4. Wśród silnie konserwowanych białek histonowych rodzina histonów łączących H1 stanowi grupę najbardziej heterogenną. U ssaków występuje 11 podtypów H1, które są różnicowo regulowane podczas rozwoju oraz w różnych typach komórek. Podtypy te obejmują 5 somatycznych histonów H1 (H1a-e), histonę zastępczą H10, 4 podtypy H1 specyficzne dla komórek linii zarodkowej oraz H1x5. Obecność wielu podtypów H1, różniących się powinowactwem do wiązania DNA i zdolnością do kondensacji chromatyny6-9, zapewnia dodatkowy poziom modulacji funkcji chromatyny. Z tego względu ilościowa analiza ekspresji poszczególnych podtypów H1, zarówno na poziomie mRNA, jak i białek, jest niezbędna dla lepszego zrozumienia regulacji funkcji i struktury chromatyny wyższego rzędu.
W niniejszej pracy opisujemy zestaw testów zaprojektowanych do analizy poziomów ekspresji poszczególnych podtypów H1 (Rycina 1). Ekspresję mRNA różnych genów wariantów H1 mierzy się za pomocą zestawu wysoce czułych i ilościowych testów polimerazy w łańcuchu za pomocą odwrotnej transkrypcji (qRT-PCR), które są szybsze, dokładniejsze i wymagają znacznie mniejszej ilości próbek w porównaniu z alternatywnym podejściem, jakim jest analiza Northern blot. W przeciwieństwie do większości innych komórkowych cząsteczek mRNA, mRNA większości genów histonów, w tym większości genów H1, nie posiada długiego ogona polyA, lecz zawiera strukturę spinki do włosów w niekodującej sekwencji 3' (UTR)10. W związku z tym cDNA przygotowuje się z całkowitego RNA poprzez odwrotną transkrypcję z użyciem starterów losowych zamiast starterów oligo-dT. Testy Realtime PCR ze starterami specyficznymi dla każdego podtypu H1 (Tabela 1) są przeprowadzane w celu uzyskania wysoce ilościowego pomiaru poziomów mRNA poszczególnych podtypów H1. Ekspresja genów pomocniczych (housekeeping genes) jest analizowana jako kontrola do normalizacji.
Względną zawartość białek każdego podtypu H1 oraz histonów rdzeniowych wyznacza się za pomocą analizy wysokosprawnej chromatografii cieczowej w fazie odwróconej (RP-HPLC) wszystkich histonów wyekstrahowanych z komórek ssaków11-13. Opisana tutaj metoda HPLC oraz warunki elucji zapewniają optymalny rozdział podtypów H1 myszy. Poprzez ilościowe określenie profilu HPLC obliczamy względną proporcję poszczególnych podtypów H1 w obrębie rodziny H1, a także wyznaczamy stosunek H1 do nukleosomów w komórkach.
Protokół
1. Przygotowanie próbki i ekstrakcja RNA
- Przed ekstrakcją RNA wszystkie powierzchnie robocze i pipety należy przemyć 70% etanolem oraz potraktować roztworem do dekontaminacji RNaz, takim jak RNase Zap. Praktyka ta zmniejsza ryzyko kontaminacji RNazami i degradacji RNA. Podczas wszystkich procedur należy używać rękawiczek.
- Aby wyekstrahować RNA z tkanki mysiej, należy wypreparować interesujący organ z uśpionej myszy i przemyć tkankę lodowatym roztworem PBS (PBS: 0.13 M NaCl, 5 mM fosforan sodu dwuzasadowy siedmiowodny, 5 mM fosforan sodu jednowodny siedmiowodny, pH 7.4). Następnie należy bezzwłocznie przejść do ekstrakcji RNA zgodnie z krokiem 1.4. Jeśli świeża tkanka nie jest przeznaczona do natychmiastowej ekstrakcji RNA, próbki tkanki należy bezzwłocznie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego użycia.
- W przypadku ekstrakcji RNA z przylegającej kultury komórek, należy odessać medium hodowlane, przepłukać wystarczającą ilością PBS, dodać odczynnik Trizol (Invitrogen) na płytkę i przejść do kroku 1.4. W przypadku komórek hodowanych w zawiesinie, należy zebrać komórki i sfałdować je poprzez wirowanie. Po odlaniu medium należy krótko przepłukać osad PBS-em i ponownie sfałdować komórki w wirówce. Następnie należy dodać odczynnik Trizol i przejść do kroku 1.4.
- Do uzyskania wysokiej jakości RNA niezbędna jest odpowiednia ilość odczynnika Trizol. Należy użyć 1 ml odczynnika Trizol do ekstrakcji RNA z 50 - 100 mg tkanki, 5 - 10 x 106 komórek (dla kultur w zawiesinie) lub z płytki 3.5 cm (dla kultur przylegających). Tkankę należy homogenizować w odczynniku Trizol za pomocą homogenizatora Polytron PT2100 (lub równoważnego). Następnie należy przeprowadzić ekstrakcję RNA z próbek tkanek lub komórek zgodnie z instrukcją producenta odczynnika Trizol (Invitrogen).
- Stężenie RNA mierzy się za pomocą urządzenia Nanodrop 1000 (Thermo Scientific), a jakość RNA analizuje się metodą elektroforezy w żelu. Typowa wydajność wynosi od 1-10 μg RNA na mg tkanki lub 5-15 μg RNA na 1 x 106 hodowanych komórek. Aby wyeliminować potencjalną kontaminację RNA śladowymi ilościami DNA genomowego, próbki RNA traktuje się DNazą wolną od RNaz (Sigma AMP-D1) zgodnie z instrukcją producenta. Należy powtórzyć pomiar stężenia RNA i elektroforezę w żelu, aby upewnić się, że zabieg ten nie spowodował degradacji RNA. Wyekstrahowane RNA należy przechowywać w temperaturze -80 °C.
*Uwaga: RNA można również wyekstrahować za pomocą zestawu RNAeasy (Qiagen) zgodnie z instrukcją zestawu lub za pomocą zestawu DNA/RNA (Qiagen), jeśli pożądane jest uzyskanie zarówno DNA, jak i RNA.
2. Ilościowa reakcja polimerazy w łańcuchu z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR)
- Całkowite RNA jest poddawane odwrotnej transkrypcji do cDNA przy użyciu Superscript III First-strand Synthesis System (Invitrogen). Ponieważ mRNA większości genów H1 nie posiada ogonów poli-A, kluczowe jest zastosowanie losowych heksamerów zamiast oligo-dT w качестве starterów do syntezy cDNA. Jeśli jednak pożądana jest również analiza ekspresji genów o niskim poziomie wiadomości poliadenylowanych, w reakcji odwrotnej transkrypcji (RT) należy zastosować mieszaninę losowych heksamerów i oligo-dT, aby poprawić wydajność odwrotnej transkrypcji mRNA poliadenylowanego.
- Reakcję RT należy przeprowadzić zgodnie z instrukcją producenta. W skrócie:
- W probówce PCR o pojemności 0,5 ml połączyć 5 μg całkowitego RNA, 1 μl losowych heksamerów w stężeniu 50 ng/μl, 1 μl mieszaniny dNTP 10 mM, a następnie dodać H2O traktowane DEPC, aby całkowita objętość reakcji wyniosła 10 μl. Dobrze wymieszać i inkubować przez 5 minut w temperaturze 65 °C, a następnie przez 1 minutę na lodzie.
- Przygotować 10 μl mieszaniny do syntezy cDNA (cDNA Synthesis Mix): 2 μl buforu 10xRT, 4 μl MgCl2 25 mM, 2 μl DTT 0,1M, 1 μl RNaseOut (40 U/μl), 1 μl SuperScript III RT (200 U/μl) i dodać do mieszaniny RNA/starter.
- Inkubować przez 10 minut w 25 °C, następnie przez 50 minut w 50 °C i zakończyć reakcję w 85 °C przez 5 minut.
- Każda reakcja zazwyczaj daje 100-250 ng/μl produktu cDNA. Produkty cDNA należy przechowywać w -20 °C lub niezwłocznie przystąpić do ilościowej PCR w czasie rzeczywistym (qPCR).
- qPCR pozwala na dokładną kwantyfikację kopii sekwencji docelowej z wysoką wydajnością i powtarzalnością14. Wybraliśmy qPCR z pomiarem za pomocą barwnika SYBR Green, który emituje sygnał fluorescencyjny tylko wtedy, gdy interpoluje się z dwuniciowym DNA (dsDNA). Chociaż metoda ta nie jest tak specyficzna jak test Taqman14, jest bardziej opłacalna, łatwiejsza do wdrożenia w laboratorium i zapewnia większą wszechstronność qPCR. Dlatego ważne jest zbadanie wykresu amplifikacji (Rysunek 2A) oraz pochodnych krzywych topnienia produktu qPCR (Rysunek 2B), aby zapewnić wydajność i specyficzność reakcji.
| Podtypy histonów | Nomenklatura histonów myszy | Nomenklatura histonów człowieka | ||
| Nazwa genu | Nr dostępowy | Nazwa genu | Nr dostępowy | |
| Histon H1a | Hist1h1a | NM_030609 | HIST1H1A (H1.1) | NM_005325 |
| Histon H1b | Hist1h1b | NM_020034 | HIST1H1B (H1.5) | NM_005322 |
| Histon H1c | Hist1h1c | NM_015786 | HIST1H1C (H1.2) | NM_005319 |
| Histon H1d | Hist1h1d | NM_145713 | HIST1H1D (H1.3) | NM_005320 |
| Histon H1e | Hist1h1e | NM_015787 | HIST1H1E (H1.4) | NM_005321 |
| Histon H1° | H1f0 | NM_008197 | H1F0 | NM_005318 |
| Histon H1oo | H1foo | NM_183811 | H1FOO | NM_153833 |
| Histon H1t | Hist1h1t | NM_010377 | HIST1H1T | NM_005323 |
| Histon H1t2 | H1fnt | NM_027304 | H1FNT | NM_181788 |
| Histon H1x | H1fx | NM_198622 | H1FX | NM_006026 |
| Histon Hils1 | Hils1 | NM_081792 | HILS1 | AY286318 |
Tabela 1. Nomenklatura podtypów histony H1 u myszy i człowieka.
- Zaprojektuj forwardowe i reverse'owe startery PCR specyficzne dla każdego genu H1 (Tabela 1). Ze względu na wysoką podobieństwo sekwencji między somatycznymi H1, szczególnie w regionie odpowiadającym centralnej domenie globularnej, kluczowe jest zapewnienie, aby startery zaprojektowane dla konkretnego podtypu H1 nie dopasowywały się do innych genów H1 i nie prowadziły do niespecyficznej amplifikacji innych podtypów H1. Należy również zauważyć, że większość genów H1 nie zawiera intronów. W związku z tym startery obejmujące introny, zazwyczaj stosowane w RT-PCR w celu uniknięcia kontaminacji genomowej, nie są dostępne. Zamiast tego próbki RNA należy wstępnie potraktować DNazą (patrz 1.5), aby wyeliminować wszelkie śladowe ilości zanieczyszczeń genomowych. Dodatkowo należy równolegle przeprowadzić RT(-)-qPCR, aby potwierdzić brak kontaminacji genomowej w próbkach cDNA.
- Zaprojektuj również startery dla wewnętrznych genów referencyjnych, których ekspresja nie zmienia się między próbkami. Często jako geny referencyjne wybiera się geny gospodarza (housekeeping genes), takie jak dehydrogenaza glikolowo-3-fosforanowa (GAPDH) oraz beta-aktyna. Sygnały qPCR genów gospodarza służą jako kontrole normalizacji.
- Przygotuj każdą reakcję PCR (objętość całkowita 25 μl) w następujący sposób: 12,5 μl 2x IQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) (zawierającego dNTPs, 50 U/ml iTaq DNA polymerase, 6 mM MgCl2, SYBR Green I oraz 20 nM fluoresceiny), 2 μl cDNA o stężeniu 4 ng/μl, 1,25 μl mieszaniny starterów forward/reverse o stężeniu 10 nM oraz 9,25 μl ddH2O; wymieszaj dokładnie w 96-dołkowej płytce PCR Microseal. Użyj uszczelnień adhezyjnych Microseal 'B' Adhesive Seals (Bio-rad), aby upewnić się, że pokrywa płytki jest szczelnie domknięta. Opukaj lub krótko wymieszaj płytkę PCR na wirówce typu vortex, a następnie odwiruj mieszaniny reakcyjne podczas krótkiego wirowania. Umieść płytkę w systemie detekcji PCR w czasie rzeczywistym MyIQ Single Color real-time PCR Detection System (Bio-rad) do qPCR.
- Stosujemy następujące warunki qPCR: 95 °C przez 3 minuty, a następnie 40 cykli: 95 °C przez 10 sekund, 60 °C przez 20 sekund, 72 °C przez 30 sekund. Przeanalizuj krzywe amplifikacji (Rysunek 2A) pod kątem wydajności PCR i wartości Ct (cykl progowy). Linia progowa może zostać ustawiona automatycznie przez oprogramowanie IQ5 Optical System Software Version 2.0.
- Wydajność starterów oraz optymalne stężenie cDNA można sprawdzić za pomocą analizy krzywej standardowej, w której do qPCR wykorzystuje się rozcieńczenia seryjne DNA genomowego, a wartości Ct nanosi się na wykres w funkcji logarytmu ilości matrycowego DNA. Zoptymalizowany test qPCR ze starterami o wysokiej specyficzności i wydajności da liniową krzywą standardową z współczynnikiem determinacji (R2)>0,98. Należy unikać starterów, dla których długość amplikonu przekracza 200 bp, ponieważ wykazują one tendencję do niskiej wydajności amplifikacji.
- Ponieważ SYBR Green wykrywa każdy dsDNA, kluczowe jest przeprowadzenie analizy krzywej topnienia (melting curve) po qPCR, aby upewnić się, że amplifikowano i wykryto pożądany amplikon, a nie dimery starterów lub zanieczyszczenia. Dla analizy krzywej topnienia zaprogramuj instrument qPCR tak, aby ogrzewać próbki od 55 °C do 95 °C w przyrostach 0,5 °C wraz z gromadzeniem danych. Domyślne ustawienia analizy krzywej topnienia dla instrumentu MyIQ (Bio-rad) są następujące: 95 °C przez 1 minutę, 55 °C przez 1 minutę, a następnie 81 cykli po 10 sekund przy wartości zadanej 55 °C, krzywa topnienia, wzrost temp. 0,5 °C (kamera zbiera dane w każdym cyklu).
- Ponieważ temperatura topnienia (Tm) dsDNA zależy od długości amplikonu i zawartości GC, różne amplikony będą miały różne wartości Tm. Przeanalizuj pochodne krzywych topnienia produktów qPCR, aby potwierdzić specyficzną temperaturę topnienia pożądanych amplikonów oraz brak niespecyficznych pików amplikonów (Rysunek 2B).
- Przygotuj reakcje w duplikacie lub triplikacie dla każdego testu do analizy statystycznej. Uwzględnij kontrole negatywne dla qRT-PCR, takie jak RT(-)-qPCR (qPCR z RNA jako matrycą bez odwrotnej transkrypcji) oraz qPCR bez dodania cDNA, RNA lub źródła DNA do mieszaniny PCR. RT(-)-qPCR może służyć jako kontrola potencjalnej kontaminacji DNA genomowym (RT(-) na Rysunku 2 i 3).
- Dane qPCR analizuj za pomocą oprogramowania IQ5 Optical System Software Version 2.0 (Bio-rad). Znormalizuj wartości ekspresji genów izoform H1 względem ekspresji genu gospodarza (np. GAPDH, ß-aktyna, HPRT), aby uzyskać względne poziomy ekspresji genów H1.
3. Przygotowanie histonów całkowitych
* Wszystkie procedury należy przeprowadzać w lodzie lub w temperaturze 4 °C.
- Przeprowadzić sekcję tkanki mysiej i wypłukać ją lodowatym PBS. (Jeśli ekstrakcja nie zostanie przeprowadzona natychmiast, próbki należy zamrozić gwałtownie i przechowywać zgodnie z opisem w kroku 1.2). Posiekać tkankę na kawałki za pomocą żyletki. Przenieść posiekaną tkankę do homogenizatora Dounce'a (tłuczek B). Dodać 10 ml buforu sacharozowego (0,3 M sacharozy, 15 mM NaCl, 10 mM HEPES [pH 7,9], 2 mM EDTA, 0,5 mM PMSF, tabletka Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail, dodać świeżo) na gram tkanki. Zhomogenizować tkankę, wykonując 10-15 ruchów.
- Przenieść homogenaty do probówki 15 ml, wirować przy 500 rpm przez 30 sekund (model wirówki: Eppendorf 5810R); ostrożnie przenieść nadsącz do nowej probówki (odrzucić osad z fragmentami tkanki) i wirować przy 2000 rpm przez 5 minut w celu osadzenia komórek. Przejść do kroku 3.4.
- Jeśli histony i chromatyna mają zostać wyekstrahowane z komórek hodowanych w monowarstwie, wypłukać je PBS, dodać PBS do naczynia hodowlanego, zebrać komórki za pomocą skrobaka do komórek i osadzić je przez wirowanie. W przypadku komórek hodowanych w zawiesinie, osadzić komórki przez wirowanie.
- Resuspendować osad komórkowy w 10 ml buforu sacharozowego uzupełnionego o 0,5% NP-40 (na gram tkanki wyjściowej lub 10(8) komórek). Przenieść próbkę do homogenizatora Dounce'a (tłuczek B) i homogenizować przez 10 ruchów w ciągu 20-minutowej inkubacji. Na tym etapie uzyskuje się jądra komórkowe. Ocenić jakość jąder pod mikroskopem. Osadzić jądra przez wirowanie przy 2000 rpm przez 5 minut. Odrzucić nadsącz.
- Resuspendować osad jąder w 3 ml buforu wysokosolnego (0,35 M KCl, 10 mM Tris [pH 7,2], 5 mM MgCl2, 0,5 mM PMSF – dodać świeżo przed każdym użyciem) na 1 g tkanki lub 10(8) komórek. Przenieść próbkę do małego homogenizatora Dounce'a (tłuczek B) i zhomogenizować, wykonując 5-10 ruchów.
- Rozdzielić zawiesinę do 3 probówek Eppendorfa (po 1 ml każda), inkubować na lodzie przez 20 minut, a następnie wirować przy 14 000 rpm przez 10 minut w celu osadzenia chromatyny. Odrzucić nadsącz.
- Do każdego osadu chromatyny dodać 0,8 ml 0,2 N H2SO4. Użyć tłuczka do probówek Eppendorfa, aby dokładnie rozetrzeć osad, aż zostanie on całkowicie zdysocjowany. Inkubować próbki na platformie rotacyjnej w temperaturze 4 °C przez noc. Na tym etapie obróbki kwasowej następuje ekstrakcja histonów całkowitych.
- Wirować przy 14 000 rpm przez 10 minut. Przenieść nadsącz (ekstrakty histonowe) do dwóch probówek Eppendorfa (400 μl/probówka). Odrzucić osad. Do każdej probówki dodać 2,5 objętości (1 ml) lodowatego etanolu. Przechowywać próbki w temperaturze -20 °C przez noc.
- Wirować przy 14 000 rpm przez 10 minut, aby osadzić histony całkowite, a następnie odrzucić nadsącz. Przemyć osad trzy razy 70% EtOH, pozostawić na blacie na 20-30 minut do wysuszenia na powietrzu. Przechowywać wysuszone białka w temperaturze -80 °C lub rozpuścić je w ddH2O i natychmiast przystąpić do analizy HPLC. Wysuszone białka można przechowywać w temperaturze -80 °C do 1 roku.
4. Analiza histonów łącznikowych metodą HPLC
- Resuspenduj osad histonów w zalecanej objętości ddH2O, zależnie od pojemności kolumny w fazie odwróconej oraz urządzenia HPLC. Do analizy HPLC stosujemy kolumnę C18 w fazie odwróconej 250 x 4.6 mm (Vydac) oraz urządzenie Äktapurifier UPC 900 (GE healthcare). Zazwyczaj rozpuszczamy 50-100μg całkowitej ilości histonów w 100 μl ddH20 w celu przeprowadzenia analizy.
- Wiruj przez 5 minut przy 14 000 rpm, aby usunąć nierozpuszczalne pozostałości. Do oznaczenia ilości białka wprowadzanego na kolumnę stosuje się test białkowy Bradforda. Wprowadź 50-100 μg całkowitego białka na kolumnę w fazie odwróconej w systemie HPLC. Należy unikać wprowadzania nadmiernej ilości białka, aby zapobiec zapchaniu kolumny.
- Przeprowadź frakcjonowanie histonów łącznikowych i histonów rdzeniowych z wykorzystaniem gradientu rosnącego stężenia acetonitrylu, zgodnie z Tabelą 2.
| Czas (min.) | Acetonitryl/0,1% TFA (%) | 0,1% TFA/ddH2O (%) |
| 0 | 0 | 100 |
| 1 | 5 | 95 |
| 11 | 25 | 75 |
| 26 | 30 | 70 |
| 45 | 35 | 65 |
| 66 | 40 | 60 |
| 75 | 43 | 57 |
| 126 | 55 | 45 |
| 131 | 90 | 10 |
| 136 | 5 | 95 |
Tabela 2. Zwiększający się gradient acetonitrylu w czasie.
- Odciek jest monitorowany przy 214 nm, a profile HPLC (Rycina 4) są rejestrowane i analizowane przy użyciu systemu Äktapurifier UPC 900 (GE Healthcare) z oprogramowaniem UNICORN 5.11 (GE Healthcare). Frakcje białek mogą być również zbierane za pomocą automatycznego kolektora frakcji (Frac-920 - GE) do dalszych analiz, np. SDS-PAGE i spektrometrii mas.
- Wartości A214 pików dla każdego podtypu H1 oraz H2B są normalizowane względem liczby wiązań peptydowych każdego odpowiadającego białka histonowego. Na podstawie tych znormalizowanych wartości A214 można obliczyć względną proporcję poszczególnych podtypów histonów H1 w obrębie rodziny H1, a także stosunek podtypów H1 do cząsteczek rdzenia nukleosomu (Rycina 5).
5. Reprezentatywne wyniki
Lista ssaczych podtypów H1, ogólny schemat blokowy oraz reprezentatywne wyniki analizy ekspresji poszczególnych genów histony H1 przedstawiono odpowiednio w Tabeli 1, Rysunku 1 oraz Rysunkach 2-5. Rysunek 2A przedstawia typowe krzywe amplifikacji reakcji qPCR dla H1a z wykorzystaniem cDNA przygotowanego z wątroby myszy oraz mESC, natomiast Rysunek 2B pokazuje pochodne krzywych topnienia odpowiadających amplikonów. Krzywa topnienia wykazuje pojedynczy charakterystyczny pik przy temperaturze topnienia (Tm) wynoszącej 86 °C dla amplikonu PCR H1a i nie zawiera nieswoistych pików tła, co sugeruje wysoką swoistość testu qPCR dla H1a. Ocena wykresu amplifikacji (Rysunek 2A) pokazuje, że potrójne reakcje qPCR każdej z próbek dały spójne sygnały z niemal identycznymi wartościami Ct, co sugeruje wysoką powtarzalność. Brak narastania amplikonów w reakcjach RT(-)-qPCR wskazuje, że zanieczyszczenie DNA genomicznym nie wystąpiło lub było minimalne. Wykorzystując wartości Ct genów H1 oraz genów referencyjnych, takich jak GAPDH, obliczono względne poziomy ekspresji RNA każdego genu H1. Przykłady obliczonych wyników dla genów H1° i H1a przedstawiono na Rysunku 3. Względne poziomy ekspresji mRNA dla H1a są wyższe w mESC w porównaniu z wątrobą myszy, podczas gdy ekspresja H1° jest znacznie wyższa w wątrobie niż w mESC.
Różnica w ekspresji H1a lub H1° w mESC w porównaniu z wątrobą dorosłej myszy jest widoczna również na profilach HPLC białek histonowych (Rycina 4). H1°, specyficzny dla różnicowania wariant H1, gromadzi się w dużych ilościach w tkankach dojrzałych, stanowiąc 27,2% całkowitej ilości H1 w wątrobie dorosłego osobnika (Rycina 5A). W przeciwieństwie do tego, białko H1° jest niemal nieobecne w nieróżnicujących się mESC (Rycina 4B). Z drugiej strony, H1a wykazuje wysoką ekspresję, zarówno na poziomie transkryptów mRNA, jak i białek, w mESC (Rycina 3 i 4B). Poprzez kwantyfikację pików H1 w profilu HPLC wyznaczany jest względny udział każdego indywidualnego podtypu H1 w rodzinie H1 (Rycina 5A). Ponadto wartości poszczególnych podtypów H1 (lub całkowitego H1) na nukleosom można obliczyć jako stosunek znormalizowanej wartości piku A214 odpowiednich podtypów H1 (lub sumy całkowitego H1) do połowy znormalizowanych wartości A214 dla H2B (Rycina 5B).
Rycina 1. Ogólny schemat analizy ekspresji podtypów histonów łączących u ssaków.
Rysunek 2. Reprezentatywne wyniki analizy qPCR dla H1a. (A) Wykres amplifikacji w analizie qPCR dla H1a. Oznaczono linię progową oraz wartości Ct ustalone przez oprogramowanie IQ5 Optical System Software. (B) Pochodne krzywych topnienia produktów qPCR przedstawionych na panelu (A).
Rycina 3. Analiza qRT-PCR poziomów mRNA H1a i H1° w mESC oraz wątrobie dorosłej myszy. Oś Y przedstawia względne poziomy ekspresji genów H1 w stosunku do genu referencyjnego GAPDH. qPCR z próbkami RT(-) (RNA bez odwrotnej transkrypcji) wykazuje minimalne sygnały lub ich brak.
Rycina 4. Analiza HPLC histonów wyekstrahowanych z komórek ssaków. Analiza HPLC w fazie odwróconej dla 100 μg całkowitej ilości histonów wyekstrahowanych z wątroby dorosłej myszy (A) oraz mESC (B). Oś X: czas elucji. Oś Y: mAU, milijednostki absorbancji.
Rysunek 5. Skład podtypów H1 i stosunek H1 do nukleosomu w wątrobie dorosłej myszy. Wartości A214 pola pod pikiem dla każdej izoformy H1 oraz H2B obliczono przy użyciu oprogramowania UNICORN 5.11 (GE Healthcare) i znormalizowano względem liczby wiązań peptydowych obecnych w odpowiadającym im białku histonowym. Sumę znormalizowanych wartości A214 wszystkich podtypów H1 przyjęto jako wartość dla całkowitej ilości H1. Procentowy udział każdego podtypu H1 w całkowitej ilości H1 (A), a także stosunek H1 do nukleosomu (reprezentowanego przez połowę znormalizowanych wartości A214 dla H2B) (B) w wątrobie dorosłej myszy obliczono na podstawie profilu HPLC przedstawionego na Rysunku 4A.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Zestaw analiz przedstawionych w niniejszym opracowaniu umożliwia kompleksową analizę poziomów ekspresji podtypów histonów łączących ssaków. Prawidłowo zaprojektowane testy qRT-PCR zapewniają wysoką czułość i dokładność pomiarów matryc RNA dowolnych genów histonu H1 ssaków. Kluczowym elementem testów qRT-PCR dla genów podtypów histonów łączących jest przygotowanie cDNA z wykorzystaniem odwrotnej transkrypcji opartej na randomowych starterach. mRNA większości genów histonów, w tym większości genów H1, nie posiada długiego ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta jest finansowana z grantu NIH GM085261 oraz z wyróżnienia Georgia Cancer Coalition Distinguished Scholar Award (dla Y.F.).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| RNaza Zap | Applied Biosystems | AM9780 | |
| Odczynnik Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| SuperScriptIII | Invitrogen | 18080-051 | |
| Etanol absolutny | Fisher Scientific | BP2818-4 | |
| IQ SYBR Green | Bio-Rad | 170-8880 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Deoksirybonukleaza I | Sigma-Aldrich | AMP-D1 | |
| płytka PCR z 96 dołkami z uszczelką Microseal | Bio-Rad | MSP-9605 | |
| Mikrouszczelnienie ’B’ Uszczelnienia adhezyjne | Bio-Rad | MSB-1001 | |
| Sacharoza | Acros Organics | AC40594 | |
| fosforan sodu dwuzasadowy siedmiowodny (Na2HPO (histochemia i patologia organizmów)4·7H2O) | Fisher Scientific | BP332 | |
| Chlorek sodu (NaCl) | American Bioanalytical | AB01915 | |
| Siedmiowodny fosforan sodu(I) dwuwodorowy (NaH2PO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP-330 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| Kompletna tabletka z mini koktajlem inhibitorów proteinaz | Grupa Roche | 11836153001 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E-5134 | |
| Fluorek fenylometanosulfonylowy (PMSF) | American Bioanalytical | AB01620 | |
| Nonidet-40 (NP-40) | American Bioanalytical | AB01425 | |
| Chlorek potasu (KCl) | Fisher Scientific | BP366 | |
| Tris [aminometanol hydroksymetylowy] | American Bioanalytical | AB02000 | |
| Chlorek magnezu (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214 | |
| Kwas siarkowy (H2SO4) | VWR international | VW3648-3 | |
| Wodorotlenek amonu (NH4OH) | Acros Organics | AC42330 | |
| Metoda Bradforda do oznaczania stężenia białek | Bio-Rad | 500-0001 | |
| Acetonitryl | EMD Millipore | AX0145-1 | |
| Kwas trifluorooctowy (TFA) | JT Baker | 9470-01 |
Bibliografia
- Fan, Y. H1 linker histones are essential for mouse development and affect nucleosome spacing in vivo. Mol. Cell Biol. 23, 4559-4572 (2003).
- Woodcock, C. L., Skoultchi, A. I., Fan, Y. Role of linker histone in chromatin structure and function: H1 stoichiometry and nucleosome repeat length. Chromosome Res. 14, 17-25 (2006).
- Shen, X., Gorovsky, M. A. Linker histone H1 regulates specific gene expression but not global transcription in vivo. Cell. 86, 475-483 (1996).
- Alami, R. Mammalian linker-histone subtypes differentially affect gene expression in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 5920-5925 (2003).
- Happel, N., Doenecke, D. Histone H1 and its isoforms: contribution to chromatin structure and function. Gene. 431, 1-12 (2009).
- Clausell, J., Happel, N., Hale, T. K., Doenecke, D., Beato, M. Histone H1 subtypes differentially modulate chromatin condensation without preventing ATP-dependent remodeling by SWI/SNF or NURF. PLoS One. 4, 0007243-0007243 (2009).
- Khadake, J. R., Rao, M. R. DNA- chromatin-condensing properties of rat testes H1a and H1t compared to those of rat liver H1bdec; H1t is a poor condenser of chromatin. Biochemistry. 34, 15792-15801 (1995).
- Orrego, M. Differential affinity of mammalian histone H1 somatic subtypes for DNA and chromatin. BMC Biol. 5, 22-22 (2007).
- Th'ng, J. P., Sung, R., Ye, M., Hendzel, M. J. H1 family histones in the nucleus. Control of binding and localization by the C-terminal domain. J. Biol. Chem. 280, 27809-27814 (2005).
- Wang, Z. F., Sirotkin, A. M., Buchold, G. M., Skoultchi, A. I., Marzluff, W. F. The mouse histone H1 genes: gene organization and differential regulation. J. Mol. Biol. 271, 124-138 (1997).
- Brown, D. T., Sittman, D. B. Identification through overexpression and tagging of the variant type of the mouse H1e and H1c genes. J. Biol. Chem. 268, 713-718 (1993).
- Fan, Y., Sirotkin, A., Russell, R. G., Ayala, J., Skoultchi, A. I. Individual somatic H1 subtypes are dispensable for mouse development even in mice lacking the H1(0) replacement subtype. Mol. Cell. Biol. 21, 7933-7943 (2001).
- Fan, Y., Skoultchi, A. I. Genetic analysis of H1 linker histone subtypes and their functions in mice. Methods Enzymol. 377, 85-107 (2004).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6, 986-994 (1996).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
