Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Podejście oparte na rekombinacji Cre-Lox P do detekcji fuzji komórek in vivo

18.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3581

⸱

4 stycznia 2012

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Biomedical Engineering, Materials Science Program, Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin-Madison

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano metodę śledzenia fuzji komórek w żywych organizmach w czasie. Podejście to wykorzystuje rekombinację Cre-LoxP do indukcji ekspresji lucyferazy po fuzji komórek. Wygenerowany sygnał luminescencyjny może być wykrywany w żywych organizmach przy użyciu systemów obrazowania biofotonicznego z czułością detekcji na poziomie ˜1,000 komórek w tkankach obwodowych.

Streszczenie

Zdolność dwóch lub więcej komórek tego samego typu do fuzji była wykorzystywana u metazoa w toku ewolucji do tworzenia wielu złożonych organów, w tym mięśni szkieletowych, kości i łożyska. Współczesne badania wykazują, że fuzja komórek tego samego typu zapewnia usprawnienie funkcji. Na przykład, gdy komórki trofoblastyczne łożyska łączą się, tworząc syncytiotrofoblast, syncytiotrofoblast jest w stanie skuteczniej transportować składniki odżywcze i hormony przez barierę matczino-płodową niż niefuzyjne trofoblasty1-4. Nowsze badania wskazują, że fuzja komórek różnych typów może kierować losem komórki. Uważano niegdyś, że „reversja” lub modyfikacja losu komórki poprzez fuzję jest ograniczona do systemów hodowli komórkowych. Jednak rozwój transplantologii komórek macierzystych doprowadził do odkrycia przez nas i innych badaczy, że komórki macierzyste mogą łączyć się z komórkami somatycznymi in vivo i że fuzja ta ułatwia różnicowanie komórek macierzystych5-7. Zatem fuzja komórek jest regulowanym procesem zdolnym do promowania przeżycia i różnicowania komórek, a tym samym może mieć kluczowe znaczenie dla rozwoju, regeneracji tkanek, a nawet patogenezy chorób.

Ograniczeniem w badaniach nad fuzją komórek jest brak odpowiedniej technologii pozwalającej na 1) dokładną identyfikację produktów fuzji oraz 2) śledzenie produktów fuzji w czasie. Przedstawiamy tutaj nowatorskie podejście rozwiązujące oba te ograniczenia poprzez indukcję bioluminescencji podczas fuzji (Rycina 1); bioluminescencję można wykryć z wysoką czułością in vivo8-15. Wykorzystujemy konstrukt kodujący gen lucyferazy świetlika (Photinus pyralis) umieszczony obok kodonu stop flankowanego sekwencjami LoxP. Gdy komórki wykazujące ekspresję tego genu łączą się z komórkami wykazującymi ekspresję białka rekombinazy Cre, miejsca LoxP ulegają przecięciu, a sygnał stop zostaje wycięty, co umożliwia transkrypcję lucyferazy. Ponieważ sygnał jest indukowalny, częstotliwość występowania sygnałów fałszywie dodatnich jest bardzo niska. W przeciwieństwie do istniejących metod wykorzystujących system Cre/LoxP16, 17, wprowadziliśmy „żywy” sygnał detekcyjny, co po raz pierwszy daje możliwość śledzenia kinetyki fuzji komórek in vivo.

Aby zademonstrować tę metodę, myszy wykazujące powszechną ekspresję rekombinazy Cre posłużyły jako biorcy komórek macierzystych przetransfekowanych konstruktem do ekspresji lucyferazy w miejsce sekwencji za kodonem stop z floksowanymi sekwencjami (floxed stop codon). Komórki macierzyste przeszczepiono drogą wstrzyknięcia domięśniowego, a po transplantacji przeprowadzono analizę obrazowania intravitalnego w celu śledzenia obecności produktów fuzji w sercu i tkankach otaczających w czasie. Podejście to można zaadaptować do analizy fuzji komórek w dowolnym typie tkanki na każdym etapie rozwoju, choroby lub regeneracji tkanek u osobników dorosłych.

Protokół

1. Transfekcja komórek donora

  1. Zebrać mezenchymalne komórki macierzyste (MSC, pochodne z embrionalnych komórek macierzystych H1 uprzejmie udostępnionych przez dr. Peimana Hemattiego; alternatywnie można zastosować dowolny typ komórek dowolnego gatunku, w przypadku których przypuszcza się fuzję in vivo), gdy osiągną 70 - 80% konfluencji, stosując 1X trypsynę (Mediatech, Manassas VA) przez 5 min. Inaktywować trypsynę za pomocą pełnej pożywki α-MEM (bezzantybiotykowa, Invitrogen, Carlsbad CA)18. Centryfugować przy 300 x g przez 5 min.
  2. Ostrożnie odessać supernatant i resuspender osad w 1 mL 1X PBS, a następnie policzyć komórki za pomocą komory licznikowej (hemacytometru).
  3. Przenieść 1,5 x 106 komórek do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mL. Centryfugować przy 300 x g przez 5 min.
  4. Ostrożnie odessać supernatant. Resuspender osad w 300 μL buforu R (Neon Transfection System, Invitrogen) i 6 μg (2 μg / 5,0 x 105 komórek) p231 pCMVe-betaAc-STOP-luc (Addgene, Cambridge, MA). Wlać 3 mL buforu E (Invitrogen) do portu dokującego elektroporatora zgodnie z protokołem producenta (Neon Transfection System, Invitrogen).
  5. Przenieść roztwór komórek z plazmidem do końcówki pipety Neon o pojemności 100 μL i przeprowadzić elektroporację z czasem impulsu 20 ms i napięciem 1500 V. Przenieść elektroporowane komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 mL zawierającej 9,7 mL pełnej pożywki α-MEM.
  6. Powtórzyć krok 1.5 dwukrotnie i połączyć przetransfekowane komórki, aby uzyskać całkowitą objętość 10 mL. Dodać 10 mL zawiesiny komórkowej (1,5 x 106 komórek) do kolby T175 zawierającej 10 mL pełnej pożywki α-MEM. Żywotność komórek po elektroporacji wynosi około 30%, co daje około 4,5 x 105 żywych komórek na kolbę T175.
  7. Wymienić pełną pożywkę α-MEM 24 godziny po transfekcji.
  8. Zebrać przetransfekowane komórki przy 70 - 80% konfluencji (~2 - 3 dni po elektroporacji). Wykonać pomiar liczby komórek za pomocą komory licznikowej i resuspender komórki w stężeniu 1,0 x 106 komórek/50 μL pełnej pożywki α-MEM. Zminimalizować czas przebywania komórek w zawiesinie, aby ograniczyć ich obumieranie przed iniekcją.

2. Iniekcja domięśniowa w mięsień sercowy

  1. Wprowadzić znieczulenie izofluranem (Phoenix Pharmaceuticals, Inc., St. Joseph, MO) u myszy transgenicznych zaprojektowanych do konstytutywnej ekspresji rekombinazy Cre w każdej komórce (B6.C-Tg(CMV-cre)1Cgn/J, Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME).
  2. Usunąć sierść z klatki piersiowej za pomocą strzyżarki lub chemicznego depilatora.
  3. Zaintubować zwierzę cewnikiem 18G (Becton Dickinson & Co, Franklin Lakes NJ) i podłączyć do respiratora dla myszy z częstotliwością 120 - 130 oddechów na minutę i objętością wyrzutową 150 μL.
  4. Wykonać nacięcie boczne w obrębie czwartej przestrzeni międzyżebrowej, przeprowadzając torakotomię.
  5. Po odsłonięciu serca wykonać dwa wstrzyknięcia po 25 μL zawiesiny komórek transfekowanych, używając strzykawki 1 mL (Temuro Medical Corporation, Somerset, NJ) i igły 28G (Becton Dickinson & Co, Franklin Lakes NJ). Aby ułatwić wstrzyknięcie domięśniowe i zapobiec nadmiernemu uszkodzeniu narządu, zagiąć końcówkę igły pod kątem ok. 90 stopni.
  6. Po wstrzyknięciu zamknąć żebra i warstwy mięśniowe za pomocą szwów wchłanialnych (np. vicryl). Skórę zszyć nicią nylonową lub jedwabną 4-0.
  7. Odczekać do wybudzenia myszy z narkozy i usunąć rurkę intubacyjną.
  8. Grupy kontrolne powinny obejmować myszy Cre otrzymujące wstrzyknięcia samego medium, myszy Cre otrzymujące tę samą koncentrację komórek nietransfekowanych oraz myszy typu dzikiego otrzymujące komórki transfekowane (alternatywnie myszy Cre otrzymujące komórki transfekowane niepodatne na fuzję).

3. Obrazowanie biofotoniczne

  1. Od pięciu do piętnastu minut przed obrazowaniem wstrzyknij dootrzewnowo (IP) 10 μL na gram masy ciała myszy roztworu D-Luciferin o stężeniu 15 mg/mL (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA).
  2. Zindukuj u myszy znieczulenie izofluranem w stężeniu 4% podczas indukcji oraz 1 - 2% w celu podtrzymania znieczulenia.
  3. Umieść myszy w pozycji grzbietnej w komorze obrazującej z maską twarzową podającą 1 - 2% izofluranu w celu podtrzymania znieczulenia (Xenogen Biophotonic Imaging System, Hopkinton, MA). Kilka myszy można obrazować jednocześnie. Obrazuj mysz z grupy kontrolnej (sham) razem z myszami eksperymentalnymi, aby ułatwić porównanie sygnału luminescencyjnego.
  4. Używając oprogramowania Living Image (Xenogen), ustaw odpowiedni czas ekspozycji (zazwyczaj 60 sec, patrz Wyniki). Dostosuj obszar obrazu do wielkości myszy i zachowaj ten sam obszar podczas całego obrazowania, aby zapobiec zmianom czułości. Ustaw wysokość obiektu na 4,5 cm.
  5. Zarejestruj sygnał intensywności luminescencji odpowiadający myszy lub myszom w polu widzenia i zapisz niezmodyfikowane pliki obrazów. Przetwórz obrazy, aby usunąć sygnał tła odpowiadający myszy kontrolnej lub niepoddanej manipulacjom. Wartości intensywności powyżej tła odpowiadają komórkom zfuzowanym w organizmie zwierzęcia. Analizę intensywności można przeprowadzić za pomocą oprogramowania Living Image (Xenogen) lub otwartoźródłowego oprogramowania do analizy obrazu. Zazwyczaj wybiera się region zainteresowania (ROI), aby porównać dane dotyczące intensywności między zwierzętami i eksperymentami.

4. Reprezentatywne wyniki

Aby określić czułość systemu obrazowania biofotonicznego Xenogen, do mięśnia sercowego myszy C57/Bl6 (Jackson Laboratory) wprowadzono linię komórkową konstytutywnie wykazującą ekspresję lucyferazy (231-LUC-D3H1, Xenogen). Komórki wstrzyknięto w stężeniach 1 x 106, 1 x 103 lub 1 x 101 komórek. Sześć godzin po podaniu komórek myszom wstrzyknięto lucyferynę do jamy otrzewnej, a następnie wykonano obrazowanie przy użyciu systemu Xenogen. Specyficzny sygnał można było wykryć przy 1 000 komórkach (u 2 z 6 obrazowanych myszy, Ryc. 2), jednak detekcja była bardziej wiarygodna przy 10 000 komórkach (u 6 z 6 obrazowanych myszy). Co istotne, badanie to posłużyło również do ustalenia przybliżonej korelacji między liczbą komórek wykazujących ekspresję lucyferazy a intensywnością sygnału.

Aby zademonstrować użyteczność opisanego protokołu w wykrywaniu i śledzeniu fuzji komórek, MSC zostały przetransfekowane plazmidem LoxP-Stop-LoxP-Luciferase (Addgene) i podane do mięśnia sercowego myszy wykazujących ekspresję Cre. Około tydzień po podaniu komórek myszy poddano obrazowaniu z wykorzystaniem systemu Xenogen bez iniekcji D-lucyferyny. Zgodnie z oczekiwaniami, w przypadku braku substratu enzymatycznego nie wykryto sygnału intensywności (Rycina 3). Następnie D-lucyferynę wstrzyknięto dootrzewnowo, a u dwóch z czterech badanych myszy wykryto sygnał odpowiadający intensywności lucyferazy, a tym samym fuzji komórek. Podobny sygnał wykryto tydzień później (Rycina 3), co sugeruje, że produkty fuzji z udziałem MSC mogą być utrzymywać się in vivo. W tym przypadku badanie zakończono, aby umożliwić ocenę serca i tkanek otaczających, jednak można zaplanować analizy długoterminowe i częstsze obrazowanie w celu śledzenia utrzymywania się, proliferacji, a być może migracji produktów fuzji u myszy.

Proces edycji genów; system Cre-lox; schemat transfekcji komórek; sprzęt do obrazowania biofotonicznego.
Rysunek 1. Schemat techniki wykrywania fuzji komórkowej in vivo. Jeśli dojdzie do fuzji między komórkami myszy wykazującymi ekspresję Cre a przeszczepionymi komórkami wykazującymi ekspresję plazmidu lucyferazy z sekwencją flox, lucyferaza zostanie wyeksponowana. Lucyferazę można wykryć poprzez wstrzyknięcie substratu enzymatycznego, D-lucyferyny, do myszy, a następnie obrazowanie zwierzęcia przy użyciu systemu obrazowania biofotonicznego Xenogen (Adaptowano z 19)

Obrazowanie bioluminescencyjne myszy w badaniu nad rakiem; sygnał fluorescencyjny wskazujący na aktywność guza.
Rycina 2. Czułość wykrywania komórek wykazujących ekspresję lucyferazy w tkance serca za pomocą obrazowania biofotonowego. Linia komórkowa konstytutywnie wykazująca ekspresję lucyferazy (231-LUC-D3H1, Xenogen) została wprowadzona do przestrzeni wewnątrzmięśniowej serca myszy C57/Bl6 w różnych całkowitych liczbach komórek. Przedstawiono reprezentatywne obrazy myszy, które otrzymały 1 x 106, 1 x 103 oraz 1 x 101 komórek (od lewej do prawej); obrazowanie przeprowadzono około 6 godzin po iniekcji.

Obrazowanie fluorescencyjne myszy, analiza optyczna; układ eksperymentalny z wykresem wyników luminescencji.
Rysunek 3. Ilościowe oznaczenie luminescencji In Vivo wskazującej na fuzję komórek. MSCs zostały przetransfekowane plazmidem LoxP-Stop-LoxP-Luciferase i podane do mięśnia sercowego myszy wykazujących ekspresję Cre. Około jednego oraz dwóch tygodni po podaniu komórek, myszy Cre poddano obrazowaniu przy użyciu systemu Xenogen Biophotonic Imaging System w celu zmierzenia intensywności luminescencji wskazującej na fuzję komórek. (A) Nałożenie zdjęcia i intensywności luminescencji grupy sham oraz myszy 1-4 (od lewej do prawej) 17 dni po podaniu komórek. (B) Intensywność luminescencji grupy sham oraz myszy 1-4 (od lewej do prawej) 17 dni po podaniu komórek. Wybrano obszar zainteresowania (żółty) odpowiadający miejscu wstrzyknięcia, a poziomy intensywności określono za pomocą oprogramowania ImageJ (źródło otwarta)20. (C) Intensywność luminescencji została znormalizowana względem tego samego obszaru zainteresowania u myszy z grupy sham dla wszystkich warunków eksperymentalnych. W pierwszym tygodniu myszy 3 i 4 wykazały pozytywny sygnał luminescencji, co sugeruje spontaniczną fuzję komórki mysiej i przeszczepionej MSC. Sygnał utrzymywał się u myszy 3 w drugim tygodniu. Aby określić organospecyficzną lokalizację sygnału odpowiadającego myszy 3, odsłonięto jamę klatki piersiowej, a następnie wycięto i obrazowano główne organy. (D) Nałożenie zdjęcia i intensywności luminescencji myszy 3. Zauważalna lokalizacja sygnału intensywności w jelicie cienkim. (E) Intensywność luminescencji myszy 3. (F) Nałożenie zdjęcia i intensywności luminescencji myszy z grupy sham. (G) Intensywność luminescencji myszy z grupy sham.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Metoda opisana w niniejszym opracowaniu pozwala po raz pierwszy na dyskretną identyfikację i analizę czasową fuzji komórek w organizmach, w tym u małych zwierząt. Podejście to łączy rekombinację Cre-LoxP z późniejszą biofotoniczną analizą obrazu. Metoda ta nadaje się do śledzenia nie tylko fuzji komórka-komórka, ale także fuzji wirus-komórka, co może okazać się użyteczne w monitorowaniu infekcji wirusowych. Analiza obrazu jest szybka, a jednoczesne obrazowanie wielu małych zwierząt jest możliwe. Wykrywanie fuzji ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować dr. Peimana Hemmati (Department of Medicine, University of Wisconsin-Madison) za hojne udostępnienie H1 MSCs oraz dr. Tima Hackera, dr. Gouqing Song i panią Jill Koch z University of Wisconsin Cardiovascular Physiology Core Facility za przeprowadzenie operacji u myszy. Praca ta była wspierana przez National Science Foundation w ramach Graduate Research Fellowship dla Briana Freemana oraz przez NIH R21 HL089679.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
System transfekcji NeonInvitrogenMPK5000
Zestaw Neon 100 μLInvitrogenMPK10025Zawiera bufor R i E
a-MEM w proszkuInvitrogen12000-022
Płodowa surowica bydlęca (FBS)HycloneSH30070.03
B6.C-Tg(CMV-cre)1Cgn/JJackson Laboratory006054
Trypsyna 10XFisher ScientificMT-25-054-Cl
L-GlutaminaFisher Scientific25030-081
D-LucyferynaCaliper Life Sciences122796
System obrazowania biofotonicznego XenogenCaliper Life SciencesIVIS Spectrum
Wodorowęglan soduSigma-AldrichS6014-500G
Niezbędne aminokwasyInvitrogen11140-050

Bibliografia

  1. Bernirschke, K. K. P. Pathology of the Human Placenta. , Springer. New York. (2000).
  2. Hoshina, M., Boothby, M., Boime, I. Cytological localization of chorionic gonadotropin alpha and placental lactogen mRNAs during development of the human placenta. J. Cell. Biol. 93, 190-198 (1982).
  3. Johansen, M., Redman, C. W., Wilkins, T., Sargent, I. L. Trophoblast deportation in human pregnancy--its relevance for pre-eclampsia. Placenta. 20, 531-539 (1999).
  4. Redman, C. W., Sargent, I. L. Placental debris, oxidative stress and pre-eclampsia. Placenta. 21, 597-602 (2000).
  5. Ogle, B. M. Spontaneous fusion of cells between species yields transdifferentiation and retroviral transfer in vivo. FASEB. J. 18, 548-550 (2004).
  6. Nygren, J. M. Bone marrow-derived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not transdifferentiation. Nat. Med. 10, 494-501 (2004).
  7. Nygren, J. M. Myeloid and lymphoid contribution to non-haematopoietic lineages through irradiation-induced heterotypic cell fusion. Nat. Cell. Biol. 10, 584-592 (2008).
  8. Kutschka, I. Adenoviral human BCL-2 transgene expression attenuates early donor cell death after cardiomyoblast transplantation into ischemic rat hearts. Circulation. 114, I174-I180 (2006).
  9. Min, J. J. In vivo bioluminescence imaging of cord blood derived mesenchymal stem cell transplantation into rat myocardium. Ann. Nucl. Med. 20, 165-170 (2006).
  10. Malstrom, S. E., Tornavaca, O., Meseguer, A., Purchio, A. F., West, D. B. The characterization and hormonal regulation of kidney androgen-regulated protein (Kap)-luciferase transgenic mice. Toxicol. Sci. 79, 266-277 (2004).
  11. Weir, L. R. Biophotonic imaging in HO-1.luc transgenic mice: real-time demonstration of gender-specific chloroform induced renal toxicity. Mutat. Res. 574, 67-75 (2005).
  12. Rajashekara, G., Glover, D. A., Banai, M., O'Callaghan, D., Splitter, G. A. Attenuated bioluminescent Brucella melitensis mutants GR019 (virB4), GR024 (galE), and GR026 (BMEI1090-BMEI1091) confer protection in mice. Infect. Immun. 74, 2925-2936 (1090).
  13. Kadurugamuwa, J. L. Noninvasive biophotonic imaging for monitoring of catheter-associated urinary tract infections and therapy in mice. Infect. Immun. 73, 3878-3887 (2005).
  14. Ryan, P. L., Youngblood, R. C., Harvill, J., Willard, S. T. Photonic monitoring in real time of vascular endothelial growth factor receptor 2 gene expression under relaxin-induced conditions in a novel murine wound model. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1041, 398-414 (2005).
  15. Zhu, L. Non-invasive imaging of GFAP expression after neuronal damage in mice. Neurosci. Lett. 367, 210-212 (2004).
  16. Noiseux, N. Mesenchymal stem cells overexpressing Akt dramatically repair infarcted myocardium and improve cardiac function despite infrequent cellular fusion or differentiation. Mol. Ther. 14, 840-850 (2006).
  17. Ajiki, T. Composite tissue transplantation in rats: fusion of donor muscle to the recipient site. Transplant Proc. 37, 208-209 (2005).
  18. Trivedi, P., Hematti, P. Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells. Exp. Hematol. 36, 350-359 (2008).
  19. Ogle, B. M., Cascalho, M., Platt, J. L. Biological implications of cell fusion. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 567-575 (2005).
  20. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Rekombinacja Cre-LoxPdetekcja bioluminescencyjnatransplantacja komórek macierzystychwstrzyknięcie domięśnioweobrazowanie intravitalnereporter lucyferazyfloksowany kodon stopkonstytutywna ekspresja Creindukcyjna luminescencja
Podejście oparte na rekombinacji Cre-Lox P do detekcji fuzji komórek in vivo
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.