Opisano metodę śledzenia fuzji komórek w żywych organizmach w czasie. Podejście to wykorzystuje rekombinację Cre-LoxP do indukcji ekspresji lucyferazy po fuzji komórek. Wygenerowany sygnał luminescencyjny może być wykrywany w żywych organizmach przy użyciu systemów obrazowania biofotonicznego z czułością detekcji na poziomie ˜1,000 komórek w tkankach obwodowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Podejście oparte na rekombinacji Cre-Lox P do detekcji fuzji komórek in vivo
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zdolność dwóch lub więcej komórek tego samego typu do fuzji była wykorzystywana u metazoa w toku ewolucji do tworzenia wielu złożonych organów, w tym mięśni szkieletowych, kości i łożyska. Współczesne badania wykazują, że fuzja komórek tego samego typu zapewnia usprawnienie funkcji. Na przykład, gdy komórki trofoblastyczne łożyska łączą się, tworząc syncytiotrofoblast, syncytiotrofoblast jest w stanie skuteczniej transportować składniki odżywcze i hormony przez barierę matczino-płodową niż niefuzyjne trofoblasty1-4. Nowsze badania wskazują, że fuzja komórek różnych typów może kierować losem komórki. Uważano niegdyś, że „reversja” lub modyfikacja losu komórki poprzez fuzję jest ograniczona do systemów hodowli komórkowych. Jednak rozwój transplantologii komórek macierzystych doprowadził do odkrycia przez nas i innych badaczy, że komórki macierzyste mogą łączyć się z komórkami somatycznymi in vivo i że fuzja ta ułatwia różnicowanie komórek macierzystych5-7. Zatem fuzja komórek jest regulowanym procesem zdolnym do promowania przeżycia i różnicowania komórek, a tym samym może mieć kluczowe znaczenie dla rozwoju, regeneracji tkanek, a nawet patogenezy chorób.
Ograniczeniem w badaniach nad fuzją komórek jest brak odpowiedniej technologii pozwalającej na 1) dokładną identyfikację produktów fuzji oraz 2) śledzenie produktów fuzji w czasie. Przedstawiamy tutaj nowatorskie podejście rozwiązujące oba te ograniczenia poprzez indukcję bioluminescencji podczas fuzji (Rycina 1); bioluminescencję można wykryć z wysoką czułością in vivo8-15. Wykorzystujemy konstrukt kodujący gen lucyferazy świetlika (Photinus pyralis) umieszczony obok kodonu stop flankowanego sekwencjami LoxP. Gdy komórki wykazujące ekspresję tego genu łączą się z komórkami wykazującymi ekspresję białka rekombinazy Cre, miejsca LoxP ulegają przecięciu, a sygnał stop zostaje wycięty, co umożliwia transkrypcję lucyferazy. Ponieważ sygnał jest indukowalny, częstotliwość występowania sygnałów fałszywie dodatnich jest bardzo niska. W przeciwieństwie do istniejących metod wykorzystujących system Cre/LoxP16, 17, wprowadziliśmy „żywy” sygnał detekcyjny, co po raz pierwszy daje możliwość śledzenia kinetyki fuzji komórek in vivo.
Aby zademonstrować tę metodę, myszy wykazujące powszechną ekspresję rekombinazy Cre posłużyły jako biorcy komórek macierzystych przetransfekowanych konstruktem do ekspresji lucyferazy w miejsce sekwencji za kodonem stop z floksowanymi sekwencjami (floxed stop codon). Komórki macierzyste przeszczepiono drogą wstrzyknięcia domięśniowego, a po transplantacji przeprowadzono analizę obrazowania intravitalnego w celu śledzenia obecności produktów fuzji w sercu i tkankach otaczających w czasie. Podejście to można zaadaptować do analizy fuzji komórek w dowolnym typie tkanki na każdym etapie rozwoju, choroby lub regeneracji tkanek u osobników dorosłych.
Protokół
1. Transfekcja komórek donora
- Zebrać mezenchymalne komórki macierzyste (MSC, pochodne z embrionalnych komórek macierzystych H1 uprzejmie udostępnionych przez dr. Peimana Hemattiego; alternatywnie można zastosować dowolny typ komórek dowolnego gatunku, w przypadku których przypuszcza się fuzję in vivo), gdy osiągną 70 - 80% konfluencji, stosując 1X trypsynę (Mediatech, Manassas VA) przez 5 min. Inaktywować trypsynę za pomocą pełnej pożywki α-MEM (bezzantybiotykowa, Invitrogen, Carlsbad CA)18. Centryfugować przy 300 x g przez 5 min.
- Ostrożnie odessać supernatant i resuspender osad w 1 mL 1X PBS, a następnie poli....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Metoda opisana w niniejszym opracowaniu pozwala po raz pierwszy na dyskretną identyfikację i analizę czasową fuzji komórek w organizmach, w tym u małych zwierząt. Podejście to łączy rekombinację Cre-LoxP z późniejszą biofotoniczną analizą obrazu. Metoda ta nadaje się do śledzenia nie tylko fuzji komórka-komórka, ale także fuzji wirus-komórka, co może okazać się użyteczne w monitorowaniu infekcji wirusowych. Analiza obrazu jest szybka, a jednoczesne obrazowanie wielu małych zwierząt jest możliwe. Wykrywanie fuzji .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować dr. Peimana Hemmati (Department of Medicine, University of Wisconsin-Madison) za hojne udostępnienie H1 MSCs oraz dr. Tima Hackera, dr. Gouqing Song i panią Jill Koch z University of Wisconsin Cardiovascular Physiology Core Facility za przeprowadzenie operacji u myszy. Praca ta była wspierana przez National Science Foundation w ramach Graduate Research Fellowship dla Briana Freemana oraz przez NIH R21 HL089679.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| System transfekcji Neon | Invitrogen | MPK5000 | |
| Zestaw Neon 100 μL | Invitrogen | MPK10025 | Zawiera bufor R i E |
| a-MEM w proszku | Invitrogen | 12000-022 | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Hyclone | SH30070.03 | |
| B6.C-Tg(CMV-cre)1Cgn/J | Jackson Laboratory | 006054 | |
| Trypsyna 10X | Fisher Scientific | MT-25-054-Cl | |
| L-Glutamina | Fisher Scientific | 25030-081 | |
| D-Lucyferyna | Caliper Life Sciences | 122796 | |
| System obrazowania biofotonicznego Xenogen | Caliper Life Sciences | IVIS Spectrum | |
| Wodorowęglan sodu | Sigma-Aldrich | S6014-500G | |
| Niezbędne aminokwasy | Invitrogen | 11140-050 |
Bibliografia
- Bernirschke, K. K. P. Pathology of the Human Placenta. , Springer. New York. (2000).
- Hoshina, M., Boothby, M., Boime, I. Cytological localization of chorionic gonadotropin alpha and placental lactogen mRNAs during development of the human placenta. J. Cell. Biol.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
