Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Potwierdzanie i odkrywanie szlaków metabolicznych poprzez znakowanie 13C aminokwasów proteinogennych

23.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3583

⸱

26 stycznia 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Energy, Environmental and Chemical Engineering, Washington University, 2Department of Biology, Washington University, 3Department of Energy, Environmental and Chemical Engineering and Department of Biology, Washington University

W tym artykule

Podsumowanie

Znakowanie izotopem 13C jest użyteczną techniką określania centralnego metabolizmu komórkowego dla różnych typów mikroorganizmów. Po hodowli komórek ze specyficznym znakowanym substratem, pomiar GC-MS może ujawnić funkcjonalne szlaki metaboliczne na podstawie unikalnych wzorów znakowania w aminokwasach proteinogennych.

Streszczenie

Mikroby posiadają złożone szlaki metaboliczne, które można badać za pomocą metod biochemicznych i genomiki funkcjonalnej. Ważną techniką pozwalającą na badanie centralnego metabolizmu komórkowego i odkrywanie nowych enzymów jest analiza metabolizmu wspomagana 13C 1. Technika ta opiera się na znakowaniu izotopowym, w którym mikroby są karmione substratami znakowanymi 13C. Śledząc ścieżki przejścia atomów między metabolitami w sieci biochemicznej, możemy określić funkcjonalne szlaki metaboliczne i odkryć nowe enzymy.

Jako metoda uzupełniająca dla transkryptomiki i proteomiki, podejścia do analizy szlaków metabolicznych wspomaganej izotopomerami obejmują trzy główne etapy 2. Po pierwsze, hodujemy komórki na substratach znakowanych 13C. Na tym etapie kluczowymi czynnikami są skład pożywki oraz dobór znakowanych substratów. Aby uniknąć szumów pomiarowych wynikających z obecności nieznakowanego węgla w suplementach odżywczych, wymagana jest pożywka minimalna z jednym źródłem węgla. Ponadto wybór znakowanego substratu opiera się na tym, jak skutecznie pozwoli on wyjaśnić analizowany szlak. Ponieważ nowe enzymy często wiążą się z inną stereochemią reakcji lub produktami pośrednimi, zazwyczaj substraty z pojedynczym znakowaniem węgla są bardziej informacyjne dla wykrywania nowych szlaków niż substraty znakowane jednorodnie3, 4. Po drugie, analizujemy wzory znakowania aminokwasów za pomocą GC-MS. Aminokwasy występują w białkach w dużych ilościach, zatem można je uzyskać poprzez hydrolizę biomasy. Aminokwasy mogą zostać poddane derywatyzacji za pomocą N-(tert-butylo-dimetylosilylo)-N-metylotryfluoroacetamidu (TBDMS) przed rozdziałem w GC. Aminokwasy zderywatyzowane TBDMS mogą ulegać fragmentacji w MS, co prowadzi do powstania różnych zestawów fragmentów. Na podstawie stosunku masy do ładunku (m/z) aminokwasów pofragmentowanych i niepofragmentowanych możemy wywnioskować możliwe wzory znakowania głównych metabolitów, które są prekursorami aminokwasów. Po trzecie, śledzimy przejścia węgla 13C w proponowanych szlakach i na podstawie danych izotopomerowych potwierdzamy, czy szlaki te są aktywne 2. Pomiar aminokwasów dostarcza informacji o znakowaniu izotopowym ośmiu kluczowych metabolitów prekursorowych w metabolizmie centralnym. Te kluczowe węzły metaboliczne mogą odzwierciedlać funkcje powiązanych z nimi głównych szlaków.

Analiza metabolizmu wspomagana izotopem 13C za pomocą aminokwasów proteinogennych może być szeroko stosowana do charakterystyki funkcjonalnej słabo poznanych procesów metabolicznych drobnoustrojów1. W niniejszym protokole wykorzystamy Cyanothece 51142 jako szczep modelowy, aby zademonstrować zastosowanie znakowanych substratów węglowych w odkrywaniu nowych funkcji enzymatycznych.

Protokół

1. Hodowla komórkowa (Rysunek 1)

  1. Hodować komórki w pożywce minimalnej z dodatkiem mikroelementów, soli, witamin oraz specyficznie znakowanych substratów węglowych, które są najodpowiedniejsze do badania danej ścieżki metabolicznej. Do hodowli komórkowej należy używać kolb z wytrząsaniem lub bioreaktorów. Nutrienty organiczne, takie jak ekstrakt z drożdży, mogą zakłócać pomiar znakowania aminokwasów, dlatego nie mogą one znajdować się w pożywce hodowlanej.
  2. Monitorować wzrost komórek poprzez pomiar gęstości optycznej hodowli przy optymalnej długości fali (np. OD730 dla Cyanothece 51142) przy użyciu spektrofotometru UV/Vis.
  3. Komórki można początkowo hodować w pożywce nieznakowanej. Do inokulacji pożywki znakowanej (stosunek inokulacji 3% (v/v)) zaleca się użycie komórek w środkowej fazie wzrostu logarytmicznego. Hodowlę znakowaną należy następnie poddać pasażowaniu (stosunek inokulacji 3% v/v) w tej samej pożywce znakowanej, aby uniknąć wprowadzenia nieznakowanego węgla z początkowego inokulum.

2. Ekstrakcja aminokwasów

  1. Zebrać subkulturowane komórki (10mL) w środkowej fazie logarytmicznej wzrostu poprzez wirowanie (10 min, 8000×g).
  2. Resuspendować osad w 1,5mL 6M HCl i przenieść go do przezroczystej szklanej fiolki do GC z zakrętką. Zakręcić fiolki i umieścić je w piecu w temperaturze 100°C na 24 godziny, aby zhydrolizować białka biomasy do aminokwasów. Hydroliza osadów biomasy może przynieść 16 z 20 powszechnych aminokwasów (Rycina 2) 5. Cysteina i tryptofan ulegają degradacji, a glutamina i asparagina są przekształcane odpowiednio w glutaminian i asparagian.
  3. Wirować roztwór aminokwasów z prędkością 20 000×g przez 5 min w probówkach Eppendorf 2 ml, a następnie przenieść nadsącz do nowych fiolek GC. Krok ten usuwa cząstki stałe z roztworu hydrolizy.
  4. Zdjąć zakrętki z fiolek GC i całkowicie osuszyć próbki strumieniem powietrza za pomocą ewaporatora Thermo Scientific Reacti-Vap (uwaga: do osuszania próbek można również użyć liofilizatora). Krok ten można przeprowadzić w ciągu nocy.

3. Derywatyzacja aminokwasów i warunki GC-MS

Analiza aminokwasów lub metabolitów naładowanych/silnie polarnych za pomocą GC wymaga ich pochodnejzacji, aby aminokwasy stały się lotne i mogły zostać rozdzielone metodą chromatografii gazowej 2.

  1. Rozpuścić wysuszone próbki w 150 μL tetrahydrofuranu (THF) oraz 150 μL odczynnika do derywatyzacji N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide.
  2. Inkubować wszystkie próbki w inkubatorze lub łaźni wodnej w temperaturze od 65 do 80°C przez 1 godzinę. Okazjonalnie mieszać na wirówce typu vortex, aby upewnić się, że metabolity w fiolce zostały rozpuszczone.
  3. Wirować próbki z prędkością 20,000×g przez 10 min, a następnie przenieść nadsącz do nowych fiolek do GC. Nadsącz powinien być klarownym, żółtawym roztworem. Ze względu na nasycenie detektorów, dokładność pomiaru GC-MS może zostać zaburzona przez wysokie stężenie wstrzykniętych aminokwasów poddanych derywatyzacji TBDMS (próbki te często mają ciemnobrązowy kolor), dlatego przed pomiarem GC-MS należy rozcieńczyć takie próbki za pomocą THF 6.
  4. Próbki poddać analizie GC-MS (stosunek split 1:5 lub 1:10, objętość wtrysku = 1 μL, gaz nośny hel = 1.2 mL/min). Zastosować następujący program temperatury GC: utrzymywać 150°C przez 2 minuty, zwiększać temperaturę o 3°C na minutę do 280°C, zwiększać o 20°C na minutę do 300°C, a następnie utrzymywać przez 5 minut. Opóźnienie rozpuszczalnika (solvent delay) można ustawić na ok. 5 min (dla kolumny GC o długości 30 metrów). Zakres stosunku masy do ładunku (m/z) w MS można ustawić pomiędzy 60 a 500.

4. Analiza danych GC-MS

  1. Pomiar aminokwasów poddanych derywatyzacji TBDMS może być również pod wpływem dyskryminacji izotopowej podczas rozdziału GC. Izotopy lekkie poruszają się w kolumnie GC nieco szybciej niż izotopy ciężkie. Aby zmniejszyć potencjalne błędy pomiarowe, można uśrednić widmo masowe dla całego zakresu piku aminokwasu 6
  2. Widma GC i MS metabolitów poddanych derywatyzacji TBDMS były raportowane wcześniej7. Czas retencji GC oraz charakterystyczne piki m/z dla każdego aminokwasu przedstawiono na Rysunku 3.
  3. Derywatyzacja aminokwasów lub metabolitów centralnych wprowadza znaczące ilości naturalnie występujących izotopów, w tym 13C (1,13%), 18O (0,20%), 29Si (4,70%) i 30Si (3,09%). Szum pomiarowy wynikający z obecności naturalnych izotopów w surowym widmie izotopomerów masy można skorygować przy użyciu opublikowanego oprogramowania5, 8. Końcowe dane dotyczące znakowania izotopowego raportowane są jako frakcje masowe, np. M0, M1, M2, M3 i M4 (reprezentujące fragmenty zawierające od zera do czterech atomów węgla znakowanego 13C).
  4. Pomiar aminokwasów może dostarczyć informacji o znakowaniu izotopowym ośmiu kluczowych metabolitów prekursorowych: 2-oksoglutaranu, 3-fosfoglicerynianu, acetylo-CoA, erytrozo-4-fosforanu, szczawiooctanu, fosfoenolopirogronianu, pirogronianu i rybozo-5-fosforanu. Wzorce znakowania w tych metabolitach mogą być wykorzystane do identyfikacji kilku centralnych szlaków metabolicznych (Rysunek 2) 9. Wyniki eksperymentów z znakowaniem można dodatkowo potwierdzić przy użyciu innych metod biochemicznych (np. RT-PCR).

5. Analiza szlaków metabolicznych z wykorzystaniem danych o znakowanych aminokwasach

Badając jedynie kilka kluczowych aminokwasów uzyskanych z dobrze zaprojektowanych eksperymentów z użyciem znacznika 13C, możemy ujawnić szereg unikalnych szlaków lub aktywności enzymatycznych bez konieczności przeprowadzania złożonej analizy strumienia metabolicznego 13C dla całego metabolizmu centralnego.

  1. Szlak Entnera-Doudoroffa: jako źródło węgla można zastosować glukozę [1-13C]. Jeśli szlak ten jest aktywny, znakowanie seryny będzie znacznie niższe niż znakowanie alaniny 10.
  2. Rozgałęziony cykl TCA: jako źródło węgla można zastosować pirogronian [1-13C]. Jeśli cykl TCA jest przerwany, asparaginian może być znakowany dwoma atomami węgla, podczas gdy glutaminian jest znakowany tylko jednym atomem węgla 11, 12.
  3. Wiązanie CO2 w cyklu Calvina-Bensona-Basshama w metabolizmie miksotroficznym: jako źródła węgla stosuje się zarówno nieznakowany CO2, jak i znakowane substraty węglowe. Jeśli cykl Calvina jest funkcjonalny, znakowanie seryny i histydyny będzie znacznie rozcieńczone w porównaniu z innymi aminokwasami. Metoda ta pozwala określić względne wiązanie CO2 w obecności organicznych źródeł węgla w pożywce 13.
  4. Oksydacyjny szlak pentozofosforanowy: jako źródło węgla można zastosować glukozę [1-13C]. Jeśli szlak ten jest aktywny, udział nieznakowanej alaniny wyniesie >50% 12.
  5. Szlak anaplerotyczny (np. PEP + CO2 à szczawiooctan): jako źródło węgla można zastosować 13CO2 i nieznakowane substraty węglowe (np. glicerol lub pirogronian). Jeśli szlak ten jest aktywny, znakowanie asparaginianu będzie znacznie wyższe w porównaniu z alaniną i seryną 13.
  6. Re-cytrynianowa syntaza: jako źródło węgla można zastosować pirogronian [1-13C]. Jeśli enzym jest aktywny, glutaminian jest znakowany w grupie β-karboksylowej 3, 4.
  7. Szlak citramalanowy: jako źródło węgla można zastosować pirogronian [1-13C], glicerol [2-13C] lub octan [1-13C]. Jeśli szlak ten jest aktywny, stopień znakowania leucyny i izoleucyny jest identyczny 14.
  8. Cykl seryno-izocytrynianowej liazazy: jako źródło węgla można zastosować pirogronian [1-13C] lub mleczan [1-13C]. Jeśli szlak ten jest aktywny, znakowany będzie atom węgla na trzeciej pozycji w serynie 15.
  9. Wykorzystanie składników odżywczych (tj. egzogennych aminokwasów): można zastosować pożywkę z całkowicie znakowanymi substratami węglowymi i nieznakowanymi aminokwasami. Jeśli komórki selektywnie wykorzystują te suplementowane nieznakowane składniki odżywcze, zaobserwowany zostanie znaczny spadek stopnia znakowania tych aminokwasów w biomasie. Metodę tę można wykorzystać do zbadania, które suplementy odżywcze są preferowane przez komórkę 16.

6. Reprezentatywne wyniki

Niedawne badania nad bioenergetyką odżywiły zainteresowanie wykorzystaniem nowych mikroorganizmów fototroficznych do produkcji bioenergii i wychwytu CO2. W ostatnich latach zastosowano całkiem sporo analiz metabolizmu 13C, w tym zaawansowane analizy strumieni metabolicznych 13C (13C-MFA), aby zbadać centralny metabolizm bakterii fototroficznych, ponieważ wiedza biochemiczna na temat centralnych szlaków metabolicznych w tych organizmach niemodelowych nie jest wystarczająco ugruntowana10, 11, 17-20. Przedstawiamy tutaj przykład odkrycia alternatywnego szlaku syntezy izoleucyny u Cyanothece 51142 21. Cyanothece 51142 nie posiada enzymu (EC 4.3.1.19, treonina amoniak-liaza), który katalizuje przekształcenie treoniny w 2-ketomaślan w typowym szlaku syntezy izoleucyny. Aby rozstrzygnąć kwestię szlaku syntezy izoleucyny, hodujemy Cyanothece 51142 (20 mL) w pożywce ASP2 22 z 54 mM glicerolu (2-13C, >98%). Cyanothece 51142 wykorzystuje glicerol znakowany w pozycji 2nd jako główne źródło węgla. Obserwujemy, że treonina i alanina mają jeden znakowany węgiel, podczas gdy izoleucyna jest znakowana trzema węgielmi. Zatem synteza w Cyanothece 51142 nie może pochodzić ze szlaku treoninowego stosowanego przez większość organizmów (Rycina 4). Z drugiej strony leucyna i izoleucyna wykazują identyczne wzory znakowania w oparciu o fragment (M-15)+ i fragment (M-159)+. Na przykład dane izotopomerowe dla [M-15]+ (zawierające niefragmentowane aminokwasy) wykazują identyczne znakowanie dla leucyny (M0=0.01, M1=0.03, M2=0.21, M3=0.69) i izoleucyny (M0=0.01, M1=0.03, M2=0.24, M3=0.67). Zatem leucyna i izoleucyna muszą być syntetyzowane z tych samych prekursorów (tj. pirogronianu i acetylo-CoA). Obserwacja ta jest zgodna z przejściem znakowanego węgla w szlaku citramalanowym syntezy izoleucyny. Aby potwierdzić ten szlak, przeszukujemy bazę danych Joint Genome Institute i stwierdzamy obecność syntazy citramalanowej CimA (cce_0248) u Cyanothece.

Schemat przepływu metabolicznego; znakowane substraty, analiza izotopomerów, rozdział GC, derywatyzacja TBDMS.
Rycina 1.  Etapy analizy szlaków z wykorzystaniem 13C.

Schemat szlaków metabolicznych z glukozą, G6P, cyklem TCA i szlakami syntezy aminokwasów.
Rycina 2.  Aminokwasy wykorzystane do określenia wzoru znakowania ich prekursorów metabolicznych. ACoA, acetylo-CoA; AKG, α-ketoglutaran; C5P, rybozo-5-fosforan; CIT, cytrynian; E4P, erytrozo-4-fosforan; G6P, glukozo-6-fosforan; OAA, szczawiooctan; PEP, fosfoenolopirogronian; PGA, 3-fosfoglicerynian; PYR, pirogronian.

Wyniki chromatografii i spektrometrii mas; wykres czasu retencji i obfitości aminokwasów.
Rycina 3. Piki GC dla 16 aminokwasów. Aminokwasy poddane derywatyzacji TBDMS są rozbijane przez MS na dwa fragmenty: (M-57)+, zawierający cały aminokwas, oraz (M-159)+, w którym brakuje grupy α-karboksylowej aminokwasu. W przypadku leucyny i izoleucyny fragment (M-57)+ nakładał się na inne piki masowe. Sugerujemy wykorzystanie fragmentu (M-15)+ do analizy znakowania całego aminokwasu. Grupa (f302)+ jest wykrywana w większości aminokwasów i zawiera jedynie pierwszy (grupa α-karboksylowa) i drugi atom węgla w szkielecie aminokwasu. Ponieważ ten pik MS często charakteryzuje się wysokim stosunkiem szumu do sygnału, (f302)+ nie jest zalecany do ilościowej analizy strumieni metabolicznych7.

Schemat szlaku metabolicznego, od glikolizy do aminokwasów, enzym CimA; dane dotyczące znakowania izotopowego.
Rysunek 4.  Przejścia znakowania w szlakach izoleucyny u Cyanothece 51142 (zmodyfikowane z naszej poprzedniej publikacji)21.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten polega na dostarczeniu komórkom znakowanego substratu i pomiarze wynikających z tego wzorów znakowania izotopowego w aminokwasach za pomocą GC-MS. Ponieważ dane MS (stosunki m/z) dostarczają jedynie ogólnej ilości znakowania jonów MS, musimy ocenić rozkłady izotopomerów aminokwasów poprzez analizę stosunków m/z zarówno dla aminokwasów niefragmentowanych (M-57)+, jak i fragmentowanych (tj. (M-159)+ oraz (f302)+). Ponadto możemy przeprowadzić kilka hodowli komórkowych w chemicz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Badanie to zostało sfinansowane z grantu NSF Career (MCB0954016) oraz grantu DOE Bioenergy Research (DEFG0208ER64694).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
TBDMSSigma-Aldrich19915-
THFSigma-Aldrich34865-
Znakowany podłoże węgloweCambridge Isotope LaboratoriesZależnie od wymagań eksperymentalnychStrona internetowa: http://www.isotope.com
Chromatograf gazowyAgilent TechnologiesHewlett-Packard, model 7890A-
Kolumny GCJ&W ScientificDB5 (30m)-
Spektrometr masowyAgilent Technologies5975C-
Odparowarka Reacti-VapThermo Fisher Scientific, Inc.TS-18825Do suszenia próbek aminokwasów

Bibliografia

  1. Zamboni, N., Sauer, U. Novel biological insights through metabolomics and 13C-flux analysis. Curr. Opin. Microbiol. 12, 553-558 (2009).
  2. Tang, Y. J. Advances in analysis of microbial metabolic fluxes via 13C isotopic labeling. Mass. Spectrom. Rev. 28, 362-375 (2009).
  3. Tang, Y. J. Investigation of carbon metabolism in Dehalococcoides ethenogenes strain 195 via isotopic and transcriptomic analysisa. J. Bacteriol. 191, 5224-5231 (2009).
  4. Tang, Y. J. Pathway confirmation and flux analysis of central metabolic pathways in Desulfovibrio vulgaris Hildenborough using GC-MS and FT-ICR mass spectrometry. Journal of Bacteriology. 189, 940-949 (2007).
  5. Dauner, M., Sauer, U. GC-MS analysis of amino acids rapidly provides rich information for isotopomer balancing. Biotechnology Progress. 16, 642-649 (2000).
  6. Wittmann, C. Fluxome analysis using GC-MS. Microbial Cell Factories. 6, 6-6 (2007).
  7. Antoniewicz, M. R., Kelleher, J. K., Stephanopoulos, G. Accurate assessment of amino acid mass isotopomer distributions for metabolic flux analysis. Anal. Chem. 79, 7554-7559 (2007).
  8. Wahl, S. A., Dauner, M., Wiechert, W. New tools for mass isotopomer data evaluation in 13C flux analysis: mass isotope correction, data consistency checking, and precursor relationships. Biotechnology and Bioengineering. 85, 259-268 (2004).
  9. Shaikh, A., Tang, Y. J., Mukhopadhyay, A., Keasling, J. D. Isotopomer distributions in amino acids from a highly expressed protein as a proxy for those from total protein. Analytical Chemistry. 80, 886-890 (2008).
  10. Tang, K. -H., Feng, X., Tang, Y. J., Blankenship, R. E. Carbohydrate metabolism and carbon fixation in Roseobacter denitrificans OCh114. PLoS One. 4, e7233-e7233 (2009).
  11. Tang, K. -H. Carbon flow of Heliobacterium modesticaldum is more related to Firmicutes than to the green sulfur bacteria. J. Biol. Chem. 285, 35104-35112 (2010).
  12. Feng, X. Characterization of the Central Metabolic Pathways in Thermoanaerobacter sp. X514 via Isotopomer-Assisted Metabolite Analysis. Appl. Environ. Microbiol. 75, 5001-5008 (2009).
  13. Feng, X. Mixotrophic and photoheterotrophic metabolisms in Cyanothece sp. ATCC 51142 under continuous light. Microbiology. 156, 2566-2574 (2010).
  14. Tang, Y. J. Flux analysis of central metabolic pathways in Geobacter metallireducens during reduction of soluble Fe(III)-NTA. Appl. Environ. Microbiol. 73, 3859-3864 (2007).
  15. Tang, Y. J., Meadows, A. L., Kirby, J., Keasling, J. D. Anaerobic central metabolic pathways in Shewanella oneidensis MR-1 reinterpreted in the light of isotopic metabolite labeling. Journal of Bacteriology. 189, 894-901 (2007).
  16. Zhuang, W. Q. Selective utilization of exogenous amino acids by Dehalococcoides ethenogenes strain 195 and the enhancement resulted to dechloronation activity. Appl. Environ. Microbiol. , Forthcoming (2011).
  17. Feng, X., Tang, K. -H., Blankenship, R. E., Tang, Y. J. Metabolic flux analysis of the mixotrophic metabolisms in the green sulfur bacterium Chlorobaculum tepidum. J. Biol. Chem. 285, 35104-35112 (2010).
  18. McKinlay, J. B., Harwood, C. S. Carbon dioxide fixation as a central redox cofactor recycling mechanism in bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, (2010).
  19. McKinlay, J. B., Harwood, C. S. Calvin cycle flux, pathway constraints, and substrate oxidation state together determine the H2 biofuel yield in photoheterotrophic bacteria. MBio. 2, (2011).
  20. Erb, T. J. Synthesis of C5-dicarboxylic acids from C2-units involving crotonyl-CoA carboxylase/reductase: The ethylmalonyl-CoA pathway. PNAS. 104, 10631-10636 (2007).
  21. Wu, B. Alternative isoleucine synthesis pathway in cyanobacterial species. Microbiology. 156, 596-602 (2010).
  22. Reddy, K. J., Haskell, J. B., Sherman, D. M., Sherman, L. A. Unicellular, aerobic nitrogen-fixing cyanobacteria of the genus Cyanothece. J. Bacteriol. 175, 1284-1292 (1993).
  23. Shastri, A. A., Morgan, J. A. A transient isotopic labeling methodology for 13C metabolic flux analysis of photoautotrophic microorganisms. Phytochemistry. 68, 2302-2312 (2007).
  24. Tang, Y. J. Invariability of central metabolic flux distribution in Shewanella oneidensis MR-1 under environmental or genetic perturbations. Biotechnol Prog. 25, 1254-1259 (2009).
  25. Zamboni, N., Fendt, S. M., Ruhl, M., Sauer, U. 13C-based metabolic flux analysis. Nature Protocols. 4, 878-892 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Znakowanie 13Canaliza szlak w metabolicznychanaliza GC MSpochodnowienie aminokwas wledzenie izotopomer wCyanothece 51142hydroliza bia ekpochodnowienie TBDMSledzenie przej w glowychodkrywanie enzym w
Potwierdzanie i odkrywanie szlaków metabolicznych poprzez znakowanie 13C aminokwasów proteinogennych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.