Potwierdzanie i odkrywanie szlaków metabolicznych poprzez znakowanie 13C aminokwasów proteinogennych

Podsumowanie

Znakowanie izotopem ¹³C jest użyteczną techniką określania centralnego metabolizmu komórkowego dla różnych typów mikroorganizmów. Po hodowli komórek ze specyficznym znakowanym substratem, pomiar GC-MS może ujawnić funkcjonalne szlaki metaboliczne na podstawie unikalnych wzorów znakowania w aminokwasach proteinogennych.

Streszczenie

Mikroby posiadają złożone szlaki metaboliczne, które można badać za pomocą metod biochemicznych i genomiki funkcjonalnej. Ważną techniką pozwalającą na badanie centralnego metabolizmu komórkowego i odkrywanie nowych enzymów jest analiza metabolizmu wspomagana ¹³C 1. Technika ta opiera się na znakowaniu izotopowym, w którym mikroby są karmione substratami znakowanymi ¹³C. Śledząc ścieżki przejścia atomów między metabolitami w sieci biochemicznej, możemy określić funkcjonalne szlaki metaboliczne i odkryć nowe enzymy.

Jako metoda uzupełniająca dla transkryptomiki i proteomiki, podejścia do analizy szlaków metabolicznych wspomaganej izotopomerami obejmują trzy główne etapy ². Po pierwsze, hodujemy komórki na substratach znakowanych ¹³C. Na tym etapie kluczowymi czynnikami są skład pożywki oraz dobór znakowanych substratów. Aby uniknąć szumów pomiarowych wynikających z obecności nieznakowanego węgla w suplementach odżywczych, wymagana jest pożywka minimalna z jednym źródłem węgla. Ponadto wybór znakowanego substratu opiera się na tym, jak skutecznie pozwoli on wyjaśnić analizowany szlak. Ponieważ nowe enzymy często wiążą się z inną stereochemią reakcji lub produktami pośrednimi, zazwyczaj substraty z pojedynczym znakowaniem węgla są bardziej informacyjne dla wykrywania nowych szlaków niż substraty znakowane jednorodnie^{3, 4}. Po drugie, analizujemy wzory znakowania aminokwasów za pomocą GC-MS. Aminokwasy występują w białkach w dużych ilościach, zatem można je uzyskać poprzez hydrolizę biomasy. Aminokwasy mogą zostać poddane derywatyzacji za pomocą N-(tert-butylo-dimetylosilylo)-N-metylotryfluoroacetamidu (TBDMS) przed rozdziałem w GC. Aminokwasy zderywatyzowane TBDMS mogą ulegać fragmentacji w MS, co prowadzi do powstania różnych zestawów fragmentów. Na podstawie stosunku masy do ładunku (m/z) aminokwasów pofragmentowanych i niepofragmentowanych możemy wywnioskować możliwe wzory znakowania głównych metabolitów, które są prekursorami aminokwasów. Po trzecie, śledzimy przejścia węgla 13C w proponowanych szlakach i na podstawie danych izotopomerowych potwierdzamy, czy szlaki te są aktywne ². Pomiar aminokwasów dostarcza informacji o znakowaniu izotopowym ośmiu kluczowych metabolitów prekursorowych w metabolizmie centralnym. Te kluczowe węzły metaboliczne mogą odzwierciedlać funkcje powiązanych z nimi głównych szlaków.

Analiza metabolizmu wspomagana izotopem ¹³C za pomocą aminokwasów proteinogennych może być szeroko stosowana do charakterystyki funkcjonalnej słabo poznanych procesów metabolicznych drobnoustrojów¹. W niniejszym protokole wykorzystamy Cyanothece 51142 jako szczep modelowy, aby zademonstrować zastosowanie znakowanych substratów węglowych w odkrywaniu nowych funkcji enzymatycznych.

Protokół

1. Hodowla komórkowa (Rysunek 1)

1. Hodować komórki w pożywce minimalnej z mikroelementami, solami, witaminami oraz specyficznie znakowanymi podłożami węglowymi, które są najodpowiedniejsze do badania danej ścieżki metabolicznej. Do hodowli komórkowej należy użyć kolb z wytrząsaniem lub bioreaktorów. Nutrienty organiczne, takie jak ekstrakt z drożdży, mogą zakłócać pomiar znakowania aminokwasów, w związku z czym nie mogą one znajdować się w pożywce hodowlanej.
2. Monitorować wzrost komórek, mierząc gęstość optyczną hodowli przy optymalnej długości fali (np. OD₇₃₀ dla Cyanothece 51142) za pomocą spektrofotometru UV/Vis.
3. Komórki można początkowo hodować w pożywce nieznakowanej. Do inokulacji pożywki znakowanej (stosunek inokulacji 3% (v/v)) zaleca się użycie komórek w środkowej fazie wzrostu logarytmicznego. Hodowlę znakowaną należy następnie przenieść (stosunek inokulacji 3% v/v) do tej samej pożywki znakowanej, aby uniknąć wprowadzenia nieznakowanego węgla z początkowego inokulum.

2. Ekstrakcja aminokwasów

1. Zebrać subkultury komórek (10mL) w środkowej fazie wzrostu logarytmicznego poprzez wirowanie (10 min, 8000×g).
2. Resuspendować osad w 1,5mL 6M HCl i przenieść go do przezroczystej szklanej fiolki GC z nakrętką. Zakręcić fiolki i umieścić je w piecu w temperaturze 100°C na 24 godziny, aby zhydrolizować białka biomasy do aminokwasów. Hydroliza osadów biomasy może przynieść 16 z 20 powszechnych aminokwasów (Rycina 2) ⁵. Cysteina i tryptofan ulegają degradacji, a glutamina i asparagina są przekształcane odpowiednio w glutaminian i asparaginian.
3. Odwirować roztwór aminokwasów przy 20 000×g przez 5 min w probówkach Eppendorf o pojemności 2 ml, a następnie przenieść nadnad Ciochy do nowych fiolek GC. Ten etap pozwala na usunięcie cząstek stałych z roztworu hydrolizy.
4. Zdjąć zakrętki z fiolek GC i całkowicie wysuszyć próbki strumieniem powietrza przy użyciu ewaporatora Thermo Scientific Reacti-Vap (uwaga: do suszenia próbek można również użyć liofilizatora). Ten etap można przeprowadzić w ciągu nocy.

3. Deratyzacja aminokwasów i warunki GC-MS

Analiza aminokwasów lub metabolitów naładowanych/silnie polarnych za pomocą GC wymaga ich derywatyzacji, aby aminokwasy stały się lotne i mogły zostać rozdzielone metodą chromatografii gazowej ².

1. Rozpuścić wysuszone próbki w 150 μL tetrahydrofuranu (THF) i 150 μL odczynnika do derywatyzacji N-(tert-butyldimetylo-silyl)-N-metylotrifluoroacetamidu.
2. Inkubować wszystkie próbki w inkubatorze lub kąpieli wodnej w temperaturze od 65 do 80°C przez 1 godzinę. Od czasu do czasu mieszać próbki w wirówce typu vortex, aby upewnić się, że metabolity w fiolce zostały rozpuszczone.
3. Centryfugować próbki przy 20 000×g przez 10 min, a następnie przenieść nadsącz do nowych fiolek do GC. Nadsącz powinien być klarownym, żółtawym roztworem. Ze względu na nasycenie detektorów, dokładność pomiaru GC-MS może zostać zaburzona przez wysoką koncentrację wstrzykniętych aminokwasów derywatyzowanych TBDMS (próbki te często mają ciemnobrązowy kolor), dlatego przed pomiarem GC-MS należy rozcieńczyć takie próbki za pomocą THF ⁶.
4. Próbki analizować metodą GC-MS (stosując stosunek podziału 1:5 lub 1:10, objętość wtrysku = 1 μL, gaz nośny hel = 1,2 mL/min). Zastosować następujący program temperatury GC: utrzymać 150°C przez 2 minuty, zwiększać o 3°C na minutę do 280°C, następnie zwiększać o 20°C na minutę do 300°C i utrzymać tę temperaturę przez 5 minut. Opóźnienie rozpuszczalnika (solvent delay) można ustawić na ok. 5 min (dla kolumny GC o długości 30 metrów). Zakres stosunku masy do ładunku (m/z) w MS można ustawić w przedziale od 60 do 500.

4. Analiza danych GC-MS

1. Pomiar aminokwasów pochodnych TBDMS może być również pod wpływem dyskryminacji izotopowej podczas rozdziału w GC. Izotopy lekkie przemieszczają się w kolumnie GC nieco szybciej niż izotopy ciężkie. Aby zredukować potencjalny błąd pomiarowy, można zastosować uśrednianie widma masowego dla całego zakresu piku aminokwasu ⁶
2. Widma GC i MS metabolitów pochodnych TBDMS były raportowane wcześniej⁷. Czas retencji w GC oraz charakterystyczne piki m/z dla każdego aminokwasu przedstawiono na Rysunku 3.
3. Deriwatyzacja aminokwasów lub metabolitów centralnych wprowadza znaczne ilości naturalnie występujących izotopów, w tym ¹³C (1,13%), ¹⁸O (0,20%), ²⁹Si (4,70%) i ³⁰Si (3,09%). Szum pomiarowy wynikający z naturalnych izotopów w surowym widmie izotopomerów masy można skorygować za pomocą opublikowanego oprogramowania⁵, ⁸. Końcowe dane dotyczące znakowania izotopowego raportowane są jako ułamki masy, np. M₀, M₁, M₂, M₃ i M₄ (reprezentujące fragmenty zawierające od zera do czterech atomów węgla znakowanych ¹³C).
4. Pomiar aminokwasów może dostarczyć informacji o znakowaniu izotopowym ośmiu kluczowych metabolitów prekursorowych: 2-oksoglutaranu, 3-fosfoglicerynianu, acetyl-CoA, erytrozo-4-P, szczawiooctanu, fosfoenolopirogronianu, pirogronianu i rybozo-5-P. Wzory znakowania w tych metabolitach mogą być wykorzystane do identyfikacji kilku centralnych szlaków metabolicznych (Rysunek 2) ⁹. Wyniki eksperymentów z znakowaniem można dodatkowo potwierdzić za pomocą innych metod biochemicznych (np. RT-PCR).

5. Analiza szlaków metabolicznych z wykorzystaniem danych o znakowanych aminokwasach

Badając jedynie kilka kluczowych aminokwasów wytworzonych w dobrze zaprojektowanych eksperymentach z użyciem znacznika ¹³C, możemy wykryć kilka unikalnych szlaków lub aktywności enzymatycznych bez konieczności przeprowadzania złożonej analizy strumienia metabolicznego ¹³C dla całego metabolizmu centralnego.

1. Szlak Entnera-Doudoroffa: jako źródło węgla można zastosować glukozę [1-¹³C]. Jeśli szlak jest aktywny, stopień znakowania seryny będzie znacznie niższy niż znakowanie alaniny ¹⁰.
2. Rozgałęziony cykl TCA: jako źródło węgla można zastosować pirogronian [1-¹³C]. Jeśli cykl TCA jest przerwany, asparaginian może zostać oznakowany dwoma atomami węgla, podczas gdy glutaminian zostanie oznakowany tylko jednym atomem węgla ¹¹, ¹².
3. Fiksacja CO₂ w cyklu Calvina-Bensona-Basshama w metabolizmie miksotroficznym: jako źródła węgla wykorzystuje się zarówno nieoznakowany CO₂, jak i oznakowane substraty węglowe. Jeśli cykl Calvina jest funkcjonalny, znakowanie seryny i histydyny będzie znacznie mniejsze w porównaniu z innymi aminokwasami. Metoda ta pozwala określić względną fiksację CO₂ w obecności organicznych źródeł węgla w pożywce ¹³.
4. Oksydacyjny szlak pentozofosforanowy: jako źródło węgla można zastosować glukozę [1-¹³C]. Jeśli szlak jest aktywny, ilość nieoznakowanej alaniny będzie wynosić >50% ¹².
5. Szlak anaplerotyczny (np. PEP + CO₂ $\rightarrow$ szczawiooctan): jako źródło węgla można zastosować ¹³CO₂ i nieoznakowane substraty węglowe (np. glicerol lub pirogronian). Jeśli szlak jest aktywny, znakowanie asparaginianu będzie znacznie wyższe w porównaniu z alaniną i seryną ¹³.
6. Syntaza cytrynianowa Re: jako źródło węgla można zastosować pirogronian [1-¹³C]. Jeśli enzym jest aktywny, glutaminian zostanie oznakowany w grupie $\beta$-karboksylowej ³, ⁴.
7. Szlak citramalanowy: jako źródło węgla można zastosować pirogronian [1-¹³C], glicerol [2-¹³C] lub octan [1-¹³C]. Jeśli szlak jest aktywny, stopień znakowania leucyny i izoleucyny jest identyczny ¹⁴.
8. Cykl seryno-izocytroliazy: jako źródło węgla można zastosować pirogronian [1-¹³C] lub mleczan [1-¹³C]. Jeśli szlak jest aktywny, oznakowany zostanie trzeci atom węgla w serynie ¹⁵.
9. Wykorzystanie składników odżywczych (tj. egzogennych aminokwasów): można zastosować pożywkę z w pełni oznakowanymi substratami węglowymi i nieoznakowanymi aminokwasami. Jeśli komórki selektywnie wykorzystują te dodane nieoznakowane składniki odżywcze, zaobserwujemy znaczne rozcieńczenie znakowania tych aminokwasów w biomasie. Metodę tę można wykorzystać do zbadania, które suplementy odżywcze są preferowane przez komórkę ¹⁶.

6. Reprezentatywne wyniki

Ostatnie badania nad bioenergetyką przywróciły zainteresowanie wykorzystaniem nowych mikroorganizmów fototroficznych do produkcji bioenergii i CO2₂ rejestracji. W ostatnich latach zastosowano całkiem sporo analiz metabolizmu 13C, w tym zaawansowane analizy strumieni metabolicznych z użyciem 13C (13C-MFA), w celu zbadania metabolizmu centralnego u bakterii fototroficznych, ponieważ wiedza biochemiczna na temat centralnych szlaków metabolicznych u tych organizmów niemodelowych nie jest wystarczająco ugruntowana¹⁰, ¹¹, ^17-20W niniejszym opracowaniu przedstawiamy przykład odkrycia alternatywnej ścieżki biosyntezy izoleucyny w Cyanothece 51142 ²¹. Cyanothece Szczep 51142 nie zawiera enzymu (EC 4.3.1.19, treoninowej amoniak-liazy), który katalizuje konwersję treoniny do 2-ketomaślanu w typowym szlaku syntezy izoleucyny. Aby rozwiązać problem szlaku izoleucynowego, hodujemy Cyanothece 51142 (20 ml) w medium ASP2 ²² z 54 mM glicerolem (2-13C, >98%). Cyanothece 51142 wykorzystuje 2^nd oznaczonego glicerolu jako głównego źródła węgla. Obserwujemy, że treonina i alanina posiadają jeden oznakowany węgiel, natomiast izoleucyna jest oznakowana trzema węglami. Zatem synteza w Cyanothece 51142 nie można otrzymać drogą treoninową stosowaną przez większość organizmów (rycina 4). Z drugiej strony leucyna i izoleucyna wykazują identyczne wzory znakowania w oparciu o fragment (M-15)⁺ or fragment (M-159)⁺Na przykład dane izotopomerowe dla [M-15]⁺ (zawierające niefragmentowane aminokwasy) wykazują identyczne znakowanie dla leucyny (M0=0,01, M1=0,03, M2=0,21, M3=0,69) oraz izoleucyny (M0=0,01, M1=0,03, M2=0,24, M3=0,67). Zatem leucyna i izoleucyna muszą być syntetyzowane z tych samych prekursorów (tj. pirogronianu i acetylo-CoA). Obserwacja ta jest zgodna z przejściem znakowanego węgla w szlaku cytramalowym syntezy izoleucyny. Aby potwierdzić ten szlak, przeszukujemy bazę danych Joint Genome Institute i stwierdzamy obecność syntazy cytramalowej CimA (cce_0248) w Cyanothece.

Rysunek 1.  Etapy analizy ścieżek metabolicznych wspomaganej ¹³C.

Rysunek 2.  Aminokwasy wykorzystane do wyznaczenia wzoru znakowania ich prekursorów metabolicznych. ACoA, acetylo-CoA; AKG, α-ketoglutaran; C5P, rybozo-5-fosforan; CIT, cytrynian; E4P, erytrozo-4-fosforan; G6P, glukozo-6-fosforan; OAA, szczawiooctan; PEP, fosfoenolopirogronian; PGA, 3-fosfoglicerynian; PYR, pirogronian.

Rycina 3. Piki GC dla 16 aminokwasów. Aminokwasy z pochodnymi TBDMS są rozszczepiane przez MS na dwa fragmenty: (M-57)⁺, zawierający cały aminokwas, oraz (M-159)⁺, w którym brakuje grupy α-karboksylowej aminokwasu. W przypadku leucyny i izoleucyny sygnał (M-57)+ był nakładający się z innymi pikami masowymi. Sugerujemy wykorzystanie fragmentu (M-15)+ do analizy całkowitego znakowania aminokwasów. Grupa (f302)+ jest wykrywana w większości aminokwasów i zawiera jedynie pierwszy (grupa α-karboksylowa) oraz drugi węgiel w szkielecie aminokwasu. Ponieważ pik MS ten często charakteryzuje się wysokim stosunkiem szumu do sygnału, (f302)⁺ nie jest zalecany do ilościowej analizy strumieni metabolicznych⁷.

Rysunek 4.  Przejścia znakowania w szlakach izoleucyny u Cyanothece 51142 (zmodyfikowane z naszej poprzedniej pracy)²¹.

Dyskusja

Protokół ten polega na dostarczeniu komórkom znakowanego substratu i pomiarze wynikających z tego wzorów znakowania izotopowego w aminokwasach za pomocą GC-MS. Ponieważ dane MS (stosunki m/z) dostarczają jedynie ogólnej ilości znakowania jonów MS, musimy ocenić rozkłady izotopomerów aminokwasów poprzez analizę stosunków m/z zarówno dla aminokwasów niefragmentowanych (M-57)⁺, jak i fragmentowanych (tj. (M-159)⁺ oraz (f302)⁺). Ponadto możemy przeprowadzić kilka hodowli komórkowych w chemicz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
TBDMS	Sigma-Aldrich	19915	-
THF	Sigma-Aldrich	34865	-
Znakowany podłoże węglowe	Cambridge Isotope Laboratories	Zależnie od wymagań eksperymentalnych	Strona internetowa: http://www.isotope.com
Chromatograf gazowy	Agilent Technologies	Hewlett-Packard, model 7890A	-
Kolumny GC	J&W Scientific	DB5 (30m)	-
Spektrometr masowy	Agilent Technologies	5975C	-
Odparowarka Reacti-Vap	Thermo Fisher Scientific, Inc.	TS-18825	Do suszenia próbek aminokwasów