Ilościowa analiza przypadkowej migracji komórek z wykorzystaniem mikroskopii wideo time-lapse

Podsumowanie

Ta metoda pozwala na monitorowanie komórek w czasie rzeczywistym oraz ilościowe pomiary różnych parametrów migracji komórkowej, takich jak prędkość, przemieszczenie i wektor prędkości. W przeciwieństwie do metod tradycyjnych, to podejście w czasie rzeczywistym nie opiera się na ilościowych pomiarach migracji w punkcie końcowym; zamiast tego umożliwia ciągłe monitorowanie i obliczanie różnych parametrów.

Streszczenie

Migracja komórek to dynamiczny proces, który jest istotny dla rozwoju zarodkowego, naprawy tkanek, funkcjonowania układu odpornościowego oraz inwazji nowotworowej ^{1, 2}. Podczas migracji kierunkowej komórki przemieszczają się szybko w odpowiedzi na zewnątrzkomórkowy sygnał chemotaktyczny lub w odpowiedzi na wewnętrzne sygnały ³ dostarczane przez podstawowy aparat ruchowy. Migracja losowa występuje, gdy komórka wykazuje niską kierunkowość wewnętrzną, co pozwala komórkom na eksplorację lokalnego środowiska.

Migracja komórek jest złożonym procesem; w początkowej fazie odpowiedzi komórka ulega polaryzacji i wysuwa wypustki w kierunku migracji ². Tradycyjne metody pomiaru migracji, takie jak test migracji w komorze Boydena, stanowią prosty sposób pomiaru chemotaksji in vitro, co pozwala na określenie migracji jako wyniku końcowego. Jednak podejście to nie umożliwia ani pomiaru poszczególnych parametrów migracji, ani wizualizacji zmian morfologicznych, jakim ulega komórka podczas migracji.

W niniejszej pracy przedstawiamy metodę umożliwiającą monitorowanie migrujących komórek w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem mikroskopii poklatkowej (video - time lapse microscopy). Ponieważ migracja i inwazja komórek są cechami charakterystycznymi nowotworów, metoda ta znajdzie zastosowanie w badaniach migracji i inwazji komórek rakowych in vitro. Losową migrację płytek krwi uznaje się za jeden z parametrów funkcji płytek ⁴, zatem metoda ta może być również pomocna w badaniu funkcji płytek krwi. Przewagą tego testu jest szybkość, niezawodność oraz powtarzalność, a ponadto nie wymaga on optymalizacji liczby komórek. Aby utrzymać fizjologicznie odpowiednie warunki dla komórek, mikroskop jest wyposażony w zasilanie CO₂ oraz termostat. Ruch komórek jest monitorowany poprzez wykonywanie zdjęć za pomocą kamery zamontowanej w mikroskopie w regularnych odstępach czasu. Migrację komórek można obliczyć, mierząc średnią prędkość oraz średnie przemieszczenie, co jest realizowane przez oprogramowanie Slidebook.

Protokół

1. Przygotowanie płytki powlekanej kolagenem

1. Rozcień kolagen do stężenia końcowego 10 μg/ml w pożywce Opti-Mem.
2. Pokryj płytki 6-dołkowe kolagenem, dodając 1,5 ml roztworu z kroku 1 do każdego dołka. Inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C.
3. Następnego dnia przemyj płytkę 2 razy 1x roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) i przechowuj je w PBS.

2. Przygotowanie i wysiew komórek na płytkę 6-dołkową

Uwaga: Należy używać podgrzanych pożywki i PBS, aby zapewnić optymalne warunki dla ruchu komórek

1. Hoduj komórki MDA-MB-231 (inwazyjna linia komórkowa raka piersi) o niskiej gęstości w pożywce Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). W tym przykładzie zastosowano linię MDA-MB-231, jednak metodę tę można zastosować do dowolnych adherentnych linii komórkowych nowotworowych oraz nienowotworowych.
2. Przemyj komórki dwukrotnie ciepłym 1x PBS i zbierz je poprzez trypsynizację. Sprawdź komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że zostały one prawidłowo odklejone po traktowaniu trypsyną.
3. Zbierz komórki, dodając pożywkę DMEM z 10% FBS, a następnie delikatnie odwiruj je przy 1000 g przez 5 minut. Osad komórkowy delikatnie resuspenduj w pożywce DMEM z 10% FBS.
4. Rozbij osad komórkowy, delikatnie pipetując zawiesinę w górę i w dół. Ważne jest, aby w możliwie największym stopniu rozbić skupiska komórek na pojedyncze komórki.
5. Policz komórki i rozcieńcz je do końcowego stężenia 50 000 komórek/ml w pożywce DMEM z 10% FBS. Rozlej 2 ml do każdego dołka.
6. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkanek przez noc, aż do rozpoczęcia obrazowania time-lapse.
7. Aby zapewnić wystarczającą przestrzeń do migracji, wykonaj „ranę” za pomocą końcówki pipety, przemyj płytkę 1X PBS w celu usunięcia resztek (powstałych w wyniku zranienia) i dodaj DMEM z 10% FBS. Sprawdź pod mikroskopem, czy obecne są komórki pływające. Jeśli pływa duża liczba komórek, powtórz procedurę płukania. Płytka jest teraz gotowa do ustawienia w mikroskopie w celu akwizycji obrazów.

3. Konfiguracja mikroskopu i zautomatyzowane pozyskiwanie obrazów

Istnieje kilka pakietów oprogramowania do obrazowania, które sterują mikroskopem w celu zautomatyzowanej akwizycji obrazów. W niniejszym protokole wykorzystano oprogramowanie do obrazowania Slidebook 5.0, a automatyczna akwizycja jest przeprowadzana na mikroskopie Olympus (Olympus IX81), sprzężonym z kamerą EM-Hamamatsu C9100, która doskonale sprawdza się w zastosowaniach z żywymi komórkami, gdzie kluczowe są szybkość akwizycji i minimalna fototoksyczność. System obejmuje komorę kontroli środowiskowej na stoliku (Neue Live Cell) oraz zautomatyzowany kontroler stolika XY (Prior Proscan). Obrazy są pozyskiwane za pomocą obiektywu 10X UPLANFL Ph1/0.30 w trybie jasnego pola, z zastosowaniem określonego odstępu czasowego. Poniższy protokół opisuje proces akwizycji obrazów.

1. Włącz mikroskop, kamerę oraz aparat do obrazowania żywych komórek. Umieść płytkę na stoliku mikroskopowym. Przykryj płytkę komorą kontroli środowiskowej Neue Live Cell, która jest podłączona do zasilania CO₂ i czujników temperatury. Ustaw termostat na 37°C, a poziom CO₂ na 5%.
2. Oprogramowanie SlideBook umożliwia w pełni zautomatyzowany wybór obiektywu i długości fali oraz łatwe przełączanie między technikami fluorescencyjnymi a jasnym polem. Aby ustawić różne parametry kontroli ostrości, otwórz oprogramowanie SlideBook > przejdź do paska menu > wybierz kontrolę ostrości (focus control), klikając > i wybierz następujące parametry:
   1. W polu „Objective box” określ obiektyw, wybierając go z rozwijanego okna. Uwzględnij, że używamy obiektywu fazowego i ręcznie wybraliśmy odpowiedni pierścień fazowy w kondensorze. W przypadku korzystania z systemu z automatycznym kondensorem, zostanie on ustawiony automatycznie przez program komputerowy. Alternatywnie, jeśli ani rewolwer obiektywów, ani kondensor nie są zautomatyzowane, każdy z nich należy ustawić ręcznie.
   2. W polu „Filter Set”:
      1. Wybierz ustawienia kierujące drogą światła do okularu lub kamery z rozwijanego pola, aby zobaczyć dostępne filtry („Live” dla okularu, „Widefield” dla kamery w naszym systemie).
      2. Wybierz odpowiedni filtr dla oświetlenia w jasnym polu (w naszej konfiguracji opcja ta jest oznaczona jako „DIC”, co reprezentuje otwartą pozycję dla drogi światła w jasnym polu).
      3. Wybierz źródło światła, klikając „Open Bright”, aby otworzyć migawkę jasnego pola.
3. Aby obejrzeć próbkę przez okular, wybierz filtr jasnego pola (pozycja „6” w naszym systemie) na rewolwerze. Po wstępnym obejrzeniu próbki przez okular w celu znalezienia odpowiednich pól i ustawienia ostrości (kroki 3.2.1 do 3.2.2.3), przesuń rewolwer filtrów, aby zmienić drogę światła na kamerę w celu przechwycenia obrazu (pozycja „1” w naszym systemie).
4. Zautomatyzowany stolik umożliwia wybór różnych współrzędnych XY w celu przechwycenia wielu interesujących pól podczas akwizycji obrazu. W oprogramowaniu SlideBook przejdź do kontroli ostrości, wybierz „XY”, wybierz różne pozycje przez okular, a następnie kliknij „set point”, aby zablokować każdą lokalizację do przechwycenia obrazu (Rysunek 1).
5. Precyzyjnie ustaw ostrość obrazu z kamery wyświetlanego na ekranie. Można to osiągnąć, korzystając z manualnych pokręteł mikroskopu lub sterowania komputerowego, które pozwala na regulację ostrości w znacznie mniejszych krokach.
6. Używając elementów sterujących w oknie „Focus Controls”, dostosuj pozycję z stolika. Dla uzyskania najlepszych wyników ustaw ostrość na płaskich wypustkach komórkowych w pobliżu miejsca kontaktu z płytką.
7. Aby ułatwić ustawianie ostrości, użyj suwaka do dostosowania czasu ekspozycji do zakresu odpowiedniego dla ostrzenia. Jeśli wybrano wiele pozycji XY, dostosuj ostrość dla każdej z nich pojedynczo: Kontrola ostrości > XY > visit point. Uwaga: wykonuje się to, aby upewnić się, że pola są prawidłowo ustawione pod kątem optymalnego ujęcia.
8. Użyj oprogramowania do ustawienia parametrów okna przechwytywania. W SlideBook otwórz funkcję przechwytywania, wybierając z paska menu. Patrz Rysunek 2. Następnie sprawdzamy następujące parametry:
   1. Sprawdź typ przechwytywania (Capture type) > jako time-lapse.
   2. Sprawdź zestaw filtrów (Filter set): Wide field: DIC (dla obrazu w jasnym polu).
   3. „Time lapse capture” to liczba punktów czasowych, które zostaną przechwycone (może ona różnić się w zależności od typu komórek). Duration to całkowity czas trwania eksperymentu. Jednostki czasu [w milisekundach (ms), sekundach (s), minutach (m) lub godzinach (h)] można wybrać z menu rozwijanego.
   4. „Interval” to opóźnienie między początkiem jednego punktu czasowego a początkiem następnego. Po wpisaniu dwóch z tych wartości, trzecie pole zostanie obliczone automatycznie.
   5. Przechwytywanie wielu pozycji XY: wybierz „multipoint list” dla więcej niż 1 pozycji XY.
   6. Nazwij plik. W podanym przykładzie nazwaliśmy go „231”.
9. Aby uniknąć nieoczekiwanego wyłączenia komputera z powodu dużej liczby obrazów, użyj opcji „spool”, aby zapisać plik. Jest ona opcjonalna, jednak wysoce zalecana. W tym celu w sekcji sterowania przechwytywaniem (capture control) > wybierz Advanced > Spool > Capture to memory and save to spool file after each time points. Przeglądaj lokalizację w celu zapisania pliku slide book (Rysunek 3). Wygenerowany film można później zaimportować z wyznaczonej lokalizacji. Kroki konfiguracji mikroskopu zostały podsumowane w pliku 3.1.

4. Przetwarzanie obrazów i analiza migracji: Obliczanie prędkości i przesunięcia

W tym przykładzie przetwarzanie obrazów jest wykonywane za pomocą oprogramowania SlideBook^{5, 6} 5.0. Do przetwarzania i analizy obrazów służą również inne programy, takie jak ImageJ⁷.

1. Zaimportuj pliki SlideBook wygenerowane z obrazów różnych pól w różnych punktach czasowych. Przejdź do paska menu> pod obrazem> Import>Kaszeta na preparaty>wybierz żądany plik (Rysunek 4a).
2. Naszym celem jest tutaj śledzenie ruchu poszczególnych komórek. Można to przeprowadzić za pomocą śledzenia zautomatyzowanego lub indywidualnego. W przykładzie zastosowaliśmy śledzenie manualne, ponieważ ułatwia ono łatwe wykluczenie artefaktów, co jest trudniejsze w przypadku śledzenia zautomatyzowanego.
3. Otwórz plik SlideBook, w którym należy przeprowadzić śledzenie. W menu: Wybierz Maska > Protokół śledzenia cząstek > Protokół ręcznego śledzenia cząstek (Rysunek 4b). Pojawi się okno z punktami czasowymi rozpoczęcia i zakończenia (Rysunek 4c).
4. Rozpocznij śledzenie ruchu poszczególnych komórek, klikając w środek każdej z nich (jądro komórkowe). Prześledź około 10 komórek z każdego filmu; należy wybrać co najmniej trzy różne filmy z różnych obszarów, tak aby z jednego eksperymentu przeanalizowanych zostało około 30 komórek. Każdy eksperyment należy powtórzyć trzykrotnie. Aby zapewnić obiektywizm analizy, wybierz komórki z różnych lokalizacji, np. niektóre z przodu, ze środka, z narożników itd. Po zakończeniu śledzenia kliknij „OK”.
5. Migrację losową można analizować poprzez pomiar zmian prędkości, wektora prędkości lub przemieszczenia itp. Aby przeanalizować dane, w menu > wybierz maskę > śledzenie cząstek>protokół śledzenia cząstekWybierz parametry śledzenia zgodnie z poniższym opisem: (Rycina 5a):
   1. Śledź z – wybierz z listy rozwijanej parametr, który chcesz śledzić. W tym przykładzie zastosowano Środek obszaru (współrzędne środka obiektu).
   2. Kliknij „śledź i kontynuuj”. Po zakończeniu śledzenia system automatycznie przejdzie do następnego kroku.
6. Wybierz żądane statystyki dla każdej ścieżki, takie jak przemieszczenie i średnia prędkość (patrz Rycina 5b):
   1. Prędkość średnia - całkowita przebyta droga podzielona przez czas potrzebny na pokonanie tej drogi.
   2. Całkowite przemieszczenie - całkowita droga przebyta przez obiekt.
   3. Kliknij „Oblicz i kontynuuj”, aby przejść do następnego kroku, lub wybierz „Oblicz”, aby wyświetlić statystyki bez przechodzenia do następnego kroku. Zostanie wygenerowany plik, który można zapisać jako plik tekstowy, a następnie wyeksportować do programu Excel.
7. Aby śledzić obiekty przy użyciu zautomatyzowanego protokołu śledzenia, w pierwszej kolejności należy utworzyć maskę.
   1. Wybierz maskę > Segmentacja obrazu> pojawi się okno segmentu >wybieraj do momentu osiągnięcia progu, który pozwoli na oddzielenie jednego obiektu od pozostałych> kliknij zastosuj> ok (patrz Rycina 5c). Krok 4.5.1 pozostaje taki sam.
   2. Usuń obiekty mniejsze niż - Zaznacz to pole, aby selektywnie usunąć obiekty mniejsze niż określony rozmiar. Wprowadź rozmiar w polu edycji i wybierz mikrony lub piksele jako jednostkę. Funkcja ta służy do usuwania artefaktów często wywoływanych przez zanieczyszczenia.
   3. Minimalny ruch – wprowadź minimalną liczbę punktów czasowych, które muszą zostać prześledzone w celu wyznaczenia ścieżki.
   4. Maksymalny zakres ruchu - wprowadź maksymalne przesunięcie, jakiego spodziewasz się dla dowolnego obiektu pomiędzy kolejnymi punktami czasowymi.
   5. Kroki analizy danych są takie same jak w przypadku śledzenia ręcznego (patrz kroki 4.5.2 do 4.6.2).

5. Reprezentatywne wyniki

Przykład analizy migracji losowej ilościowo określonej pod kątem prędkości i przemieszczenia (Rysunek 6). Po wyeksportowaniu pliku do programu Excel dane są przedstawione za pomocą wykresu pudełkowego z wąsami. Analizę statystyczną porównującą całkowite przemieszczenie oraz średnią prędkość między grupą badawczą a kontrolną wykonano za pomocą testu Manna-Whitneya. Próbka badawcza wykazuje wzrost średniej prędkości w porównaniu z grupą kontrolną. Próbka badawcza wykazuje wzrost całkowitego przemieszczenia w porównaniu z grupą kontrolną.

Film z próby kontrolnej i badawczej: komórki kontrolne MDA-MB-231 oraz komórki badawcze MDA-MB-231 wysiano na kolagen i inkubowano przez noc. Mikroskopię wideo w odstępach czasu wykonano za pomocą mikroskopu Olympus połączonego z kamerą EM-Hamamatsu. Obrazy rejestrowano w odstępach 1 godziny przez łącznie 18 godzin podczas migracji losowej. Proszę zapoznać się z Filmem 1 i Filmem 2 przedstawiającymi migrację losową dla próbek kontrolnych i badawczych.

Konfiguracja mikroskopu:

Rysunek 1. Konfigurowanie wielu punktów przechwytywania obrazu.

Rysunek 2. Kroki przedstawiające sterowanie akwizycją. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Rysunek 3. Sposób zapisywania wielu obrazów.

Przetwarzanie obrazów i analiza migracji.

Rysunek 4a. Kroki importowania obrazu do analizy danych.

Rysunek 4b. Kroki analizy danych przy użyciu protokołu śledzenia cząstek.

Rycina 4c. Okno przedstawiające długość ścieżek śledzonych cząstek.

Etapy analizy danych.

Rycina 5a. Kroki przedstawiające parametry protokołu śledzenia cząsteczek.

Rysunek 5b. Wybór statystyk ścieżek do analizy.

Rycina 5c. Kroki tworzenia maski dla protokołu automatycznego śledzenia.

Rycina 6. Średnia prędkość (Rycina 6a) oraz przemieszczenie (Rycina 6b) przedstawione na wykresie pudełkowym. Próbka badawcza wykazuje wzrost prędkości i przemieszczenia w porównaniu z grupą kontrolną.

Filmy

Film 1. Migracja komórek kontrolnych. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.

Film 2. Migracja komórek testowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić film.

Komórki kontrolne MDA-MB-231 oraz testowe MDA-MB-231 wysiano rzadko na kolagenie na jedną noc. Mikroskopię wideo z odstępem czasu (time-lapse) przeprowadzono za pomocą mikroskopu Olympus połączonego z kamerą EM-Hamamatsu. Obrazy pobierano w odstępach 1h przez 18 godzin podczas migracji przypadkowej. Prosimy o zapoznanie się z filmami z migracji przypadkowej dla grupy kontrolnej i testowej.

Dyskusja

Test migracji losowej w czasie rzeczywistym umożliwia dokładną i czułą analizę parametrów migracji komórek, takich jak prędkość i przemieszczenie. Metoda ta nie ogranicza się do pomiaru wartości końcowej, dzięki czemu jest bardziej ilościowa. Ponieważ komórki są monitorowane w zwykłej pożywce DMEM z surowicą, zmniejsza to szkodliwy wpływ długotrwałej inkubacji w pożywkach bezzurowiczych. Wykazano, że migracja komórek zależy od tworzenia i zrywania kontaktów komórkowych z podłożem⁸, w związku z czym metoda ta m...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH30243.01
płytki surowicy wołowej	Gemini Bio Products	100-106
Opti-Mem	Invitrogen	31985-070
Kolagen	BD Biosciences	354231
Mikroskop z komorą do hodowli żywych komórek &Automatyczny sterownik stolika XY	Olympus Corporation	Olympus 1X81
Komora do kontroli parametrów środowiskowych	Nowy	Nowa komora do hodowli żywych komórek	Nasze urządzenie posiada specjalnie wykonaną prostokątną szklaną płytkę górną, która zapewnia odpowiednią optykę przy dostępie od góry komory. Prostokątny kształt umożliwia zastosowanie płytek wielodołkowych wykorzystywanych w wielu z naszych eksperymentów.
Zautomatyzowany stół XY	Wcześniejsze badania naukowe	Wcześniejszy Proscan	Umożliwia to precyzyjny powrót do wielokrotnie wybranych pozycji XY podczas mikroskopii poklatkowej.
Kamera		Kamera EM Hamamatsu C9100
Oprogramowanie	Zazwyczaj nabywane u dostawców mikroskopów, takich jak Olympus	Książka preparatów 5