Analiza ilościowa losowej migracji komórek za pomocą poklatkowej mikroskopii wideo

Summary

Ta metoda pozwala na monitorowanie komórek w czasie rzeczywistym i ilościowe pomiary różnych parametrów migracji komórek, takich jak prędkość, przemieszczenie i prędkość. W przeciwieństwie do tradycyjnych metod, to podejście w czasie rzeczywistym nie opiera się na ilościowych pomiarach migracji w punktach końcowych; Zamiast tego umożliwia ciągłe monitorowanie i obliczanie różnych parametrów.

Abstract

Migracja komórek to dynamiczny proces, który jest ważny dla rozwoju embrionalnego, naprawy tkanek, funkcjonowania układu odpornościowego i inwazji nowotworów ^{1, 2}. Podczas migracji kierunkowej komórki poruszają się szybko w odpowiedzi na zewnątrzkomórkowy sygnał chemotaktyczny lub w odpowiedzi na wewnętrzne sygnały ³ dostarczane przez podstawową maszynerię ruchliwości. Migracja losowa zachodzi, gdy komórka ma niską wewnętrzną kierunkowość, co pozwala komórkom na eksplorację lokalnego środowiska.

Migracja komórek to złożony proces, w początkowej odpowiedzi komórka ulega polaryzacji i rozciąga wypukłości w kierunku migracji ². Tradycyjne metody pomiaru migracji, takie jak test migracji w komorze Boydena, są łatwą metodą pomiaru chemotaksji in vitro, która umożliwia pomiar migracji jako wyniku końcowego. Podejście to nie pozwala jednak ani na pomiar indywidualnych parametrów migracji, ani na wizualizację zmian morfologicznych, jakim ulega komórka podczas migracji.

Tutaj prezentujemy metodę, która pozwala nam monitorować migrujące komórki w czasie rzeczywistym za pomocą wideo - mikroskopii poklatkowej. Ponieważ migracja i inwazja komórek są cechami charakterystycznymi raka, metoda ta będzie miała zastosowanie w badaniu migracji i inwazji komórek rakowych in vitro. Losowa migracja płytek krwi została uznana za jeden z parametrów funkcji płytek krwi ⁴, stąd metoda ta może być również pomocna w badaniu funkcji płytek krwi. Ten test ma tę zaletę, że jest szybki, niezawodny, powtarzalny i nie wymaga optymalizacji liczby komórek. W celu utrzymania fizjologicznie odpowiednich warunków dla komórek, mikroskop jest wyposażony w termostat zasilający CO₂ i temperaturowy. Ruch komórek jest monitorowany poprzez wykonywanie zdjęć za pomocą kamery zamontowanej na mikroskopie w regularnych odstępach czasu. Migrację komórek można obliczyć, mierząc średnią prędkość i średnie przemieszczenie, które jest obliczane przez oprogramowanie Slidebook.

Protocol

1. Przygotowanie płytki pokrytej kolagenem

1. Rozcieńczyć kolagen do końcowego stężenia 10 μg/ml w pożywce Opti-Mem.
2. Pokryj 6-dołkowe płytki kolagenem, dodając 1,5 ml z kroku 1 do każdego dołka. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
3. Następnego dnia przemyć płytkę 2 razy 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i przechowywać je w PBS.

2. Przygotowanie komórek i wysiew na płytce 6-dołkowej

Uwaga: Użyj ciepłych nośników i PBS, aby zapewnić optymalne warunki do ruchu komórek

1. Hoduj MDA-MB-231 (inwazyjna linia komórkowa raka piersi) z rzadka....

Discussion

Test migracji losowej w czasie rzeczywistym umożliwia dokładną i czułą analizę parametrów migracji komórek, takich jak prędkość i przemieszczenie. Ta metoda nie ogranicza się do wartości pomiaru punktu końcowego, stąd jest bardziej ilościowa. Ponieważ komórki są monitorowane w normalnym pożywce DMEM za pomocą surowicy; Zmniejsza szkodliwy wpływ dłuższej inkubacji w pożywkach wolnych od surowicy. Wykazano, że migracja komórek zależy od formatowania i zrywania kontaktów komórek z podłożem⁸, dlatego metoda ta moż.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH30243.01
FBS	Gemini Bio Products	100-106
Opti-Mem	Invitrogen	31985-070
Kolagen	BD Biosciences	354231
komorą na żywe komórki i Zautomatyzowany kontroler stopnia XY	Olympus Corporation	Olympus 1X81
Komora kontroli środowiska	Neue Neue	Neue Live Cell Chamber	Nasza ma specjalnie zbudowaną prostokątną szklaną płytkę górną dla odpowiedniej optyki przez górną część komory. Prostokątny kształt mieści płytki wielodołkowe używane w wielu naszych eksperymentach.
Zautomatyzowany stolik XY	Prior Scientific	Prior Proscan	Umożliwia to precyzyjny powrót do zwielokrotnienia wybranych pozycji XY podczas mikroskopii poklatkowej.
Kamera		Hamamatsu EM Camera C9100
Oprogramowanie	Zazwyczaj kupowane za pośrednictwem dostawcy mikroskopów, takiego jak Olympus	Slide Book 5