Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wzmocnienie indukcji apoptozy i autofagii przez nowy syntetyczny analog C-1 7-deoksypancratystatyny w ludzkich komórkach gruczolakoraka piersi i neuroblastoma w połączeniu z tamoksyfenem

18.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3586

⸱

30 maja 2012

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Windsor, 2Chemistry Department and Centre for Biotechnology, Brock University

W tym artykule

Podsumowanie

Zsyntetyzowaliśmy nowy analog pancratystatyny o przeciwnowotworowej aktywności porównywalnej z natywną pancratystatyną; co interesujące, leczenie skojarzone z tamoksyfenem doprowadziło do drastycznego nasilenia indukcji apoptozy i autofagii poprzez celowanie w mitochondria, przy minimalnym wpływie na nienowotworowe fibroblasty. W związku z tym JCTH-4 w połączeniu z tamoksyfenem może stanowić bezpieczną terapię przeciwnowotworową.

Streszczenie

Rak piersi jest jednym z najczęstszych nowotworów u kobiet w Ameryce Północnej. Wiele obecnych metod leczenia przeciwnowotworowego, w tym promieniowanie jonizujące, indukuje apoptozę poprzez uszkodzenie DNA. Niestety, takie terapie nie są selektywne względem komórek nowotworowych i wywołują podobną toksyczność w komórkach prawidłowych. Donieśliśmy o selektywnej indukcji apoptozy w komórkach nowotworowych za pomocą naturalnego związku, pankratystatyny (PST). Niedawno, w drodze syntezy de novo, otrzymano nowy analog PST, pochodną C-1 acetoksymetylową 7-deoksypankratystatyny (JCTH-4), która wykazuje porównywalną selektywną aktywność indukowania apoptozy w kilku liniach komórek nowotworowych. Ostatnio autofagia została powiązana ze złośliwościami nowotworowymi jako mechanizm zarówno pro-przeżyciowy, jak i pro-śmierciowy w odpowiedzi na chemioterapię. Tamoksyfen (TAM) niezmiennie wykazywał indukcję pro-przeżyciowej autofagii w wielu nowotworach. W niniejszym badaniu oceniono skuteczność samego JCTH-4 oraz JCTH-4 w połączeniu z TAM w indukowaniu śmierci komórek raka piersi człowieka (MCF7) i neuroblastoma (SH-SY5Y). Sam TAM indukował autofagię, ale nie wywołał istotnej śmierci komórek, podczas gdy sam JCTH-4 spowodował znaczną indukcję apoptozy wraz z pewną indukcją autofagii. Co ciekawe, leczenie skojarzone doprowadziło do drastycznego wzrostu indukcji apoptozy i autofagii. Przy użyciu mikroskopii time-lapse monitorowaliśmy zależne od czasu zmiany morfologiczne w komórkach MCF7 poddawanych autofagii indukowanej przez TAM, apoptozie i autofagii indukowanej przez JCTH-4 oraz przyspieszonej śmierci komórek w wyniku leczenia skojarzonego. Wykazaliśmy, że związki te indukują apoptozę/autofagię poprzez celowanie w mitochondria w tych komórkach nowotworowych. Co istotne, terapie te nie wpłynęły na przeżywalność nienowotworowych fibroblastów ludzkich. Zatem wyniki te wskazują, że JCTH-4 w połączeniu z TAM mógłby być stosowany jako bezpieczna i bardzo skuteczna terapia przeciwnowotworowa przeciwko komórkom raka piersi i neuroblastoma.

Protokół

Wstęp

Apoptoza, czyli programowana śmierć komórki typu I, jest procesem fizjologicznym, który może przebiegać drogą zewnętrzną, poprzez wiązanie liganda śmierci z receptorem śmierci, lub drogą wewnętrzną. Wewnętrzna ścieżka apoptozy jest inicjowana przez stres wewnątrzkomórkowy, taki jak uszkodzenia DNA i dysfunkcja mitochondriów; prowadzi to ostatecznie do permeabilizacji mitochondriów, rozproszenia potencjału błony mitochondrialnej (MMP), uwalniania czynników apoptogennych z przestrzeni międzybłonowej mitochondriów i następującej po tym egzekucji apoptozy1.

Autofagia to proces, w którym komórka rozkłada, degraduje i recyklinguje własne komponenty wewnątrzkomórkowe przy zachowaniu integralności błony plazmatycznej; jest on wyzwalany przez różne rodzaje stresów komórkowych, w tym stres oksydacyjny, hipoksję, agregaty białkowe, niedobór składników odżywczych, niedobór czynników wzrostu oraz uszkodzone organelle2. W początkowych etapach procesu materiał cytozolowy jest pochłaniany przez autofagosomy, czyli pęcherzyki o podwójnej błonie, które łączą się z lizosomami, tworząc autolizosomy. Po fuzji z lizosomami materiały cytozolowe uprzednio pobrane przez autofagosomy są degradowane przez enzymy lizosomalne2. Silna aktywacja tej ścieżki prowadzi do rozległej degradacji komponentów wewnątrzkomórkowych, co może skutkować autofagiczną śmiercią komórki lub programowaną śmiercią komórki typu II3.

Unikanie śmierci komórkowej jest uważane za jedną z cech charakterystycznych nowotworów4. Nowotwór jest chorobą charakteryzującą się niekontrolowanym wzrostem i proliferacją komórek5. W szczególności neuroblastoma wywodzi się z rozwijających się komórek nerwowych układu nerwu współczulnego z grzebienia neuronalnego6. Jest to najczęstszy guz lity występujący u małych dzieci, stanowiący około 9% wszystkich nowotworów dziecięcych7. Mimo znaczących postępów poczynionych do tej pory, choroba ta wciąż stanowi problem zarówno dla naukowców zajmujących się badaniami podstawowymi, jak i dla klinicystów. Z drugiej strony, rak piersi jest najczęstszym nowotworem wśród kobiet8. Tamoksifen (TAM) jest często stosowany w terapii hormonozależnych raków piersi jako antagonista receptorów estrogenowych (ER)9. Niemniej jednak, inne raporty dostarczają dowodów na dodatkowe, niezależne mechanizmy indukcji apoptozy przez TAM. W szczególności TAM oddziałuje z Kompleksem I mitochondrialnego łańcucha oddechowego (MRC) w miejscu wiązania mononukleotydu flawinowego (FMN)10.

PST jest naturalnym związkiem wyizolowanym z rośliny Hymenocallis littoralis. W przeciwieństwie do wielu obecnie stosowanych leków chemioterapeutycznych, wykazano, że indukuje on apoptozę w sposób niegenotoksyczny, selektywnie w różnych typach komórek nowotworowych poprzez celowanie w mitochondria11-15. Jednakże prace przedkliniczne i kliniczne były utrudnione przez jego dostępność; występuje on w bardzo niewielkich ilościach w źródle naturalnym, a syntezę chemiczną obciążają liczne komplikacje. Zsyntetyzowaliśmy i przeanalisowaliśmy syntetyczne analogi 7-deoksypancratystatyny i zaobserwowaliśmy podobną aktywność przeciwnowotworową w pochodnej acetoksymetylowej w pozycji C-1, JC-TH-acetate-4 (JCTH-4)16. Dysponujemy obecnie syntetycznym analogiem PST o silnym działaniu przeciwnowotworowym. Jego synteza została zestandaryzowana i może być skalowana w celu wytworzenia ilości wystarczających do badań przedklinicznych i klinicznych. Ponieważ zarówno naturalny PST, jak i TAM celują w mitochondria, interesujące byłoby zbadanie połączonego efektu syntetycznego analogu PST na ludzkie komórki raka piersi oraz neuroblastoma w kombinacji z TAM.

W niniejszej pracy raportujemy selektywną cytotoksyczność JCTH-4 w komórkach ludzkiego neuroblastoma (SH-SY5Y) oraz gruczolakoraka piersi (MCF7). JCTH-4 był w stanie indukować apoptozę w obu liniach komórkowych poprzez celowanie w mitochondria; JCTH-4 spowodował rozproszenie MMP oraz zwiększenie produkcji reaktywnych form tlenu (ROS) w izolowanych mitochondriach z tych komórek rakowych. Ponadto w komórkach MCF7 przez JCTH-4 indukowano autofagię. Co ciekawe, dodanie TAM do ekspozycji na JCTH-4 nasiliło wspomniane efekty działania JCTH-4 w komórkach SH-SY5Y i MCF7. Zmiany morfologiczne wywołane przez JCTH-4 i TAM osobno oraz w kombinacji w komórkach MCF7 monitorowano za pomocą mikroskopii time-lapse obrazów w kontraście fazowym lub w jasnym polu. Normalne ludzkie fibroblasty płodowe (NFF) wykazały wyraźny spadek wrażliwości na JCTH-4 zarówno podanym pojedynczo, jak i w kombinacji z TAM. Zatem obserwacje te sugerują, że JCTH-4, zarówno samodzielnie, jak i w połączeniu z TAM, jest bezpiecznym i skutecznym środkiem chemioterapeutycznym przeciwko rakowi piersi i neuroblastoma.

Materiały i metody

1. Hodowla komórek

  1. hodować i hodować ludzkie komórki neuroblastoma SH-SY5Y (ATCC, Cat. No. CRL-2266, Manassas, VA, USA) w pożywce Dulbecco's Modified Eagles Medium F-12 HAM (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Canada) uzupełnionej o 2 mM L-glutaminy, 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 10 mg/ml gentamycyny (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Canada). Przechowywać komórki w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.
  2. hodować i hodować ludzkie komórki gruczolakoraka piersi MCF7 (ATCC, Cat. No. HTB-22, Manassas, VA, USA) w pożywce RPMI-1640 (Sigma-Aldrich Canada, Mississauga, ON, Canada) uzupełnionej o 10% standardowej FBS (Thermo Scientific, Waltham, MA) i 10 mg/mL gentamycyny (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Canada). Przechowywać komórki w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.
  3. hodować i hodować linię komórkową pozornych prawidłowych ludzkich fibroblastów płodowych (NFF) (Coriell Institute for Medical Research, Cat. No. AG04431B, Camden, NJ, USA) w pożywce Dulbecco's Modified Eagle's Medium, High Glucose (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) uzupełnionej o 15% FBS i 10 mg/mL gentamycyny (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Canada). Przechowywać komórki w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.

2. Przygotowanie leku

  1. Odważyć cytrynian tamoksyfenu (TAM) (Sigma-Aldrich, nr kat. T9262, Mississauga, ON, Kanada) i rozpuścić go w DMSO w celu przygotowania roztworu stokowego o stężeniu 10 mM. Roztwór stokowy przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia. Wszystkie kontrole nośnikiem w niniejszym badaniu zawierały DMSO w stężeniu poniżej 0,5%.
  2. Powtórzyć krok 2.1, aby przygotować roztwór stokowy JC-TH-acetate-4 (JCTH-4) o stężeniu 1 mM rozpuszczony w DMSO, otrzymany w drodze syntezy chemoenzymatycznej z bromobenzenu, zgodnie z wcześniejszym opisem16. Roztwór stokowy przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia. Wszystkie kontrole nośnikiem w niniejszym badaniu zawierały DMSO w stężeniu poniżej 0,5%.

3. Mikroskopia poklatkowa

  1. W sterylnych warunkach w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II wysiać około 2,0 x 105 komórek MCF7 do szalek hodowlanych z szklanym dnem o średnicy 35 mm (MatTek Corporation, Cat. No. P35G-014-C, Ashland, MA, USA) i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
  2. Gdy komórki osiągną 60 do 70% konfluencji, w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II poddać je działaniu 1 μM JCTH-4 (stosując roztwór stokowy 1 mM rozpuszczony w DMSO) oraz 10 μM TAM (stosując roztwór stokowy 10 mM rozpuszczony w DMSO), osobno oraz w kombinacji.
  3. Po 48 godzinach inkubacji komórki umieścić w komorze grzewczej w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego Leica DMI6000 (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany).
  4. Za pomocą oprogramowania LAS AF6000 skonfigurować mikroskop do wykonywania mikrofotografii w kontraście fazowym lub w polu jasnym przy powiększeniu 400x co 5 minut przez 18 godzin.

4. Barwienie jąder komórkowych

  1. W komorze laminarnej klasy II wysiać około 2,0 x 105 komórek MCF7 lub SH-SY5Y do każdej studni 6-studzienkowej płytki hodowlanej z przezroczystym dnem, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
  2. Gdy komórki osiągną 60 do 70% konfluencji, potraktować je w komorze laminarnej klasy II 1 μM JCTH-4 (korzystając z roztworu stokowego 1 mM w DMSO) oraz 10 μM TAM (korzystając z roztworu stokowego 10 mM w DMSO), zarówno osobno, jak i w kombinacji.
  3. Inkubować komórki z wyżej wymienionymi substancjami w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 48 godzin (komórki SH-SY5Y) lub 72 godziny (komórki MCF7).
  4. Po potraktowaniu i inkubacji komórek z lekami, bezpośrednio do pożywki dodać barwnik Hoechst 33342 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) do stężenia końcowego 10 μM w celu zabarwienia jąder komórkowych.
  5. Inkubować komórki z barwnikiem Hoechst przez 5 do 10 minut, chroniąc je przed światłem.
  6. Umieścić płytkę na stoliku odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego Leica DM IRB (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany).
  7. Wykonać mikrofotografie w świetle fluorescencyjnym i w kontraście fazowym przy powiększeniu 400x.

5. Analiza wiązania Aneksyny V

  1. W komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II wysiać około 5,0 x 105 komórek MCF7, SH-SY5Y lub NFF na płytki do hodowli tkanek o pojemności 10 mL i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
  2. Gdy komórki osiągną 60 do 70% konfluencji, poddać je działaniu 1 μM JCTH-4 (stosując roztwór zapasowy 1 mM rozpuszczony w DMSO) oraz 10 μM TAM (stosując roztwór zapasowy 10 mM rozpuszczony w DMSO), zarówno oddzielnie, jak i w połączeniu, w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II.
  3. Inkubować komórki z wyżej wymienionymi substancjami w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 48 godzin (komórki SH-SY5Y) lub 72 godziny (komórki MCF7 i NFF).
  4. Przygotować bufor wiążący Annexin V w ddH2O z dodatkiem 10 mM HEPES, 10 mM NaOH, 140 mM NaCl oraz 1 mM CaCl2 o pH 7,6 i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
  5. Po zakończeniu traktowania i inkubacji komórek lekami, usunąć medium z płytek zawierających zawieszone komórki i przenieść je do oddzielnych probówek stożkowych o pojemności 15 mL dla każdej grupy traktowania, odpowiednio je etykietując.
  6. Odczepić komórki przylegające od płytek przy użyciu trypsyny.
  7. Po odczepieniu komórek od płytki w wyniku działania trypsyny, odessać medium umieszczone w probówce stożkowej 15 mL w kroku 5.4 i przenieść je z powrotem na oryginalne płytki z zawiesiną komórkową w trypsynie.
  8. Za pomocą elektronicznego pipetora i pipet serologicznych wymieszać medium z roztworem komórek w trypsynie, a następnie przenieść tę mieszaninę z powrotem do odpowiadających im probówek stożkowych 15 mL.
  9. Wirować komórki przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, usunąć nadmiar cieczy z każdej probówki i resuspenderować komórki w PBS.
  10. Wirować komórki przy 600 x g przez 5 minut, usunąć nadmiar cieczy z każdej probówki i resuspenderować komórki w oznakowanych probówkach do mikrowirowania w około 50 do 70 μL buforu wiążącego Annexin V.
  11. Dodać Annexin V AlexaFluor-488 (1:50) (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Canada) oraz barwnik Hoechst do stężenia końcowego 10 μM i inkubować przez 15 minut w ciemności.
  12. Po inkubacji wymieszać jedną z probówek do mikrowirowania w wstrząsarku wortex, nanieść 7 do 10 μL mieszaniny komórkowej na szkiełko przedmiotowe, przykryć mieszaninę komórkową na szkiełku szkiełkiem nakrywką i wykonać mikrofotografie fluorescencyjne (zarówno obrazy Annexin V, jak i Hoechst dla każdego widoku) przy powiększeniu 400x na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym Leica DM IRB (Leica Microsystems, Wetzlar, Niemcy). Powtórzyć procedurę dla każdej próbki eksperymentalnej w pozostałych probówkach do mikrowirowania.

6. Test WST-1 (rozpuszczalna w wodzie sól tetrazoliowa) w celu oceny żywotności komórek

  1. W komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy II przeprowadzić trypsynizację konfluencyjnej hodowli komórek MCF7, SH-SY5Y lub NFF w kolbie T75 lub naczyniu hodowlanym o średnicy 10 cm.
  2. Po odlepieniu komórek dodać od 5 do 10 mL pożywki do trypsyny, a następnie przelać zawiesinę komórkową do stożkowej probówki o objętości 15 mL.
  3. Wirować komórki przy 600 x g przez 5 minut, umieścić probówkę z powrotem w komorze bezpieczeństwa biologicznego, usunąć nadsącz z każdej probówki i resuspendować komórki w około 1 do 3 mL pożywki, zależnie od wielkości osadu komórkowego.
  4. Do probówki do wirówki mikrocentryfużowej przenieść 10 μL zawiesiny komórkowej, dodać 10 μL barwnika Trypan Blue (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Canada) i wymieszać za pomocą mikropipety.
  5. Nanieść 10 μL zawiesiny komórek z barwnikiem Trypan Blue na hemosytometr (Hausser Scientific, USA), policzyć komórki i obliczyć stężenie komórek w oryginalnej zawiesinie w probówce stożkowej 15 mL.
  6. Wykorzystać obliczone stężenie do określenia objętości oryginalnej zawiesiny komórkowej niezbędnej do przygotowania rozcieńczonych zawiesin o stężeniu 1,5 x 105 komórek/mL dla MCF7 i SH-SY5Y oraz 5,0 x 104 dla komórek NFF, wymaganych do wysiewu.
  7. Wykorzystując rozcieńczone zawiesiny, wysiać 15 x 103 komórek MCF7 lub SH-SY5Y na studzienkę lub 5,0 x 103 komórek NFF na studzienkę, dodając 100 μL rozcieńczonej zawiesiny do każdej studzienki przezroczystej płytki hodowlanej o 96 studzienkach. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez noc.
  8. W komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II traktować komórki 1 μM JCTH-4 oraz 10 μM TAM, zarówno osobno, jak i w kombinacji, przez 72 godziny dla komórek MCF7 i NFF oraz przez 48 godzin dla komórek SH-SY5Y.
  9. Po zakończeniu inkubacji z lekami dodać 10 μL odczynnika WST-1 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) do każdej studzienki i inkubować płytkę przez 4 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
  10. Pomiar absorbancji przeprowadzić przy 450 nm na czytniku Wallac Victor3 1420 Multilabel Counter (PerkinElmer, Woodbridge, ON, Canada) i wyrazić wyniki jako procent grup kontrolnych z rozpuszczalnikiem.

7. Barwienie estrem metylowym tetrametylorodaminy (TMRM)

  1. Do każdego dołka 6-dołkowej płytki do hodowli tkanek z przezroczystym dnem włóż szkiełko nakrywkowe, a następnie w komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy II wysiej komórki MCF7 do każdego dołka płytki. Pozostaw je do wzrostu w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.
  2. Gdy komórki osiągną 60 do 70% konfluencji, potraktuj je w komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy II 1 μM JCTH-4 (korzystając z roztworu stokowego 1 mM rozpuszczonego w DMSO) oraz 10 μM TAM (korzystając z roztworu stokowego 10 mM rozpuszczonego w DMSO), zarówno osobno, jak i w kombinacji.
  3. Inkubuj komórki z wyżej wymienionymi preparatami w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 przez 72 godziny.
  4. Po potraktowaniu i inkubacji komórek z lekami, dodaj bezpośrednio do medium komórek barwnik Hoechst 33342 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) do stężenia końcowego 10 μM w celu zabarwienia jąder, a także ester metylowy tetrametylorodaminy (TMRM) (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Canada) do stężenia końcowego 200 nM.
  5. Inkubuj komórki z barwnikami przy 5% CO2 i w temperaturze 37 °C przez 45 minut, chroniąc je przed światłem.
  6. Naniesienie pipetą 8 μL medium lub PBS na szkiełko przedmiotowe, a następnie za pomocą pęsety wyjmij szkiełko nakrywkowe z płytki 6-dołkowej i połóż je na medium lub PBS na szkiełku przedmiotowym, stroną z komórkami skierowaną w dół.
  7. Wykonaj mikrografie fluorescencyjne, zarówno dla Hoechst, jak i TMRM dla każdego pola widzenia, przy użyciu odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego Leica DM IRB (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) przy powiększeniu 400x.

8. Izolacja mitochondriów

  1. Przygotować około 10 mL buforu hipotonicznego (1 mM EDTA, 5 mM Tris-HCl, 210 mM mannitolu, 70 mM sacharozy, 10 μM Leu-pep, 10 μM Pep-A oraz 100 μM PMSF) i buforu reakcyjnego, a następnie przechowywać oba roztwory w lodzie.
  2. Z około 8 do 10 konfluencyjnych kolb hodowlanych T75 z komórkami SH-SY5Y przeprowadzić trypsynizację, dodać medium w celu neutralizacji trypsyny, zebrać zawiesiny komórkowe do probówek stożkowych o pojemności 50 mL i odwirować probówki przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Odmienić supernatant i resuspendować osady komórkowe w około 10 do 20 mL zimnego PBS, odwirować probówki przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i powtórzyć ten proces płukania raz.
  4. Odmienić supernatant i resuspendować komórki w zimnym buforze hipotonicznym. Homogenizować komórki ręcznie za pomocą szklanego homogenizatora tkankowego i odwirować lizat komórkowy przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Odwirować otrzymany supernatant przy 15 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Odmienić supernatant cytozolowy i resuspendować osad mitochondrialny w zimnym buforze reakcyjnym.

9. Test Amplex Red

  1. Po wyizolowaniu mitochondriów z komórek, należy oszacować stężenie białka w próbce wyizolowanych mitochondriów, wykorzystując krzywą standardową o znanych stężeniach 1mg/mL BSA (albuminy surowicy bydlęcej) za pomocą testu białkowego BioRad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA USA).
  2. Na podstawie oszacowanego stężenia białka w roztworze wyizolowanych mitochondriów należy obliczyć objętość tego roztworu, która odpowiada 20 μg białka. Tą objętość należy nanieść do każdego dołka nieprzeźroczystej płytki 96-dołkowej, aby uzyskać 20 μg białka na dołek.
  3. Każdy dołek na płytce należy dopełnić do całkowitej objętości 100 μL za pomocą buforu reakcyjnego, leku (w końcowym stężeniu 1 μM JCTH-4 i/lub 10 μM TAM lub 250 μM PQ (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Canada) stosowanego jako kontrola pozytywna), odczynnika Amplex Red w końcowym stężeniu 50 μM oraz peroksydazy chrzanowej (HRP) (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Canada) w stosunku 6 U/200 μL.
  4. Po 2-godzinnej inkubacji należy wykonać pomiary fluorescencji przy Ex. 560 nm i Em. 590 nm na spektrofluorometrze (SpectraMax Gemini XPS, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

10. Przygotowanie lizatu komórkowego

  1. Hodować komórki MCF7 do uzyskania 60–70% konfluencji w 10 cm płytkach do hodowli tkankowej.
  2. Traktować komórki 1 μM JCTH-4 oraz 10 μM TAM osobno oraz w kombinacji przez 72 godziny, używając około 10–15 płytek na grupę traktowaną.
  3. Przygotować bufor do lizy komórek (10 mM Tris HCl o pH 7.2, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 1% Triton-X-100; 10 μM Leu-pep, 10 μM Pep-A oraz 100 μM PMSF) i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
  4. Mechanicznie odjąć komórki z powierzchni płytek za pomocą skrobaka do komórek i zebrać je do oznakowanych stożkowych probówek 50 mL.
  5. Wirować probówki przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, usunąć nadosad i resuspendować osad komórkowy w około 10–20 mL zimnego PBS, następnie wirować probówki przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i powtórzyć ten proces płukania raz.
  6. Usunąć nadosad i resuspendować komórki w zimnym buforze do lizy komórek. Homogenizować komórki ręcznie za pomocą szklanego homogenizatora tkankowego i wirować lizat komórkowy przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Odrzucić osad i przechowywać lizaty komórkowe w temperaturze -20 °C do momentu użycia.

11. Analizy Western Blot

  1. Oznaczyć stężenie białka w lizatach komórkowych przy użyciu testu BioRad protein assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA USA). Próbki białek poddać elektroforezie SDS-PAGE i przenieść białka na membranę nitrocelulozową.
  2. Po transferze zablokować membrany 5% (w/v) roztworem mleka w TBST (Tris-Buffered Saline Tween-20) przez 1 godzinę.
  3. Inkubować membrany przez noc w temperaturze 4 °C z przeciwciałem przeciwko LC3 wytworzonym u królika (1:500) (Novus Biologicals, nr kat. NB100-2220, Littleton, CO, USA) lub przeciwciałem przeciwko β-Actin wytworzonym u myszy (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., nr kat. sc-81178, Paso Robles, CA, USA).
  4. Przepłukać membrany raz przez 15 minut i dwukrotnie przez 5 minut w TBST, a następnie inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C z przeciwciałem wtórnym sprzężonym z peroksydazą chrzanową przeciwko myszy (1:2000) lub przeciwko królikowi (1:2000) (Abcam, nr kat. ab6728 i ab6802, Cambridge, MA, USA).
  5. Przepłukać membrany trzykrotnie po 5 minut w TBST i zwizualizować prążki białkowe przy użyciu odczynnika do wzmocnionej chemiluminescencji (Sigma-Aldrich, CPS160, Mississauga, ON, Canada).
  6. Przeprowadzić analizy densytometryczne przy użyciu oprogramowania ImageJ.

12. Barwienie monodansylkadaweryną (MDC)

  1. Włóż szkiełko nakrywkę do każdej studni 6-dołkowej płytki hodowlanej z przezroczystym dnem, a następnie wysiej komórki MCF7 do każdej studni płytki w komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy II. Pozostaw je do wzrostu w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.
  2. Gdy komórki osiągną 60-70% konfluencji, potraktuj je w komorze klasy II 1 μM JCTH-4 (korzystając z roztworu zapasowego 1 mM rozpuszczonego w DMSO) oraz 10 μM TAM (korzystając z roztworu zapasowego 10 mM rozpuszczonego w DMSO), zarówno osobno, jak i w kombinacji.
  3. Inkubuj komórki z powyższymi preparatami w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 przez 72 godziny.
  4. Po potraktowaniu i inkubacji komórek z lekami, dodaj bezpośrednio do każdej studni Monodansylkadaverynę (MDC) (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Canada) do stężenia końcowego 0,1 mM na 15 min.
  5. Inkubuj komórki z barwnikiem przy 5% CO2 i w temperaturze 37 °C przez 15 minut, chroniąc je przed światłem.
  6. Nanieś pipetą 30 μL pożywki lub PBS na szkiełko przedmiotowe, wyjmij pęsetą szkiełko nakrywkowe z płytki 6-dołkowej i połóż je na pożywce lub PBS na szkiełku przedmiotowym, tak aby komórki były skierowane w dół.
  7. Wykonaj mikrofotografie fluorescencyjne MDC oraz mikrofotografie w kontraście fazowym dla każdego pola widzenia, używając odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego Leica DM IRB (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) przy powiększeniu 400x.

13. Reprezentatywne wyniki

Selektywna indukcja apoptozy w ludzkich komórkach gruczolakowatego raka piersi i neuroblastoma przez JCTH-4: wzmocnienie aktywności przez TAM

W różnych komórkach nowotworowych wykazano selektywną indukcję apoptozy przez naturalną PST (Ryc. 1a)11-13. Ze względu na niską dostępność PST, zsyntetyzowaliśmy analogi 7-deoksy-pancratystatyny (JCTH-4, Ryc. 1b) i przebadaliśmy je pod kątem podobnej aktywności przeciwnowotworowej w komórkach gruczolakoraka piersi człowieka (MCF7) oraz neuroblastoma (SH-SY5Y). W pierwszej fazie eksperymentów chcieliśmy monitorować zmiany morfologiczne w czasie po zastosowaniu samego JCTH-4 i TAM oraz ich kombinacji w komórkach MCF7. Komórki MCF7 były monitorowane przez 18 godzin, co przedstawiono w Video 1 wykonanym za pomocą mikroskopii poklatkowej z obrazami w kontraście fazowym, z traktowaniem rozpuszczalnikiem (kontrola) przez 48 godzin; komórki te nie wykazały istotnych zmian morfologicznych. W przeciwieństwie do tego, po 48 godzinach traktowania 1 μM JCTH-4, komórki te wykazały zmiany morfologiczne związane z apoptozą, takie jak kurczenie się, pęcherzykowanie oraz tworzenie ciał apoptotycznych, co widoczne jest w Video 2. Z kolei samo traktowanie TAM w komórkach MCF7 wywołało bardzo charakterystyczną morfologię, w tym inkluzje punktowe wskazujące na obecność autofagosomów związanych z autofagią (Video 3). Zaobserwowano minimalną morfologię apoptotyczną, a komórki generalnie wykazywały zdrową morfologię porównywalną do komórek MCF7 traktowanych kontrolą z rozpuszczalnikiem. Co ciekawe, w obecności TAM indukcja apoptozy przez JCTH-4 była drastycznie zwiększona, o czym świadczy nasilona morfologia apoptotyczna w komórkach MCF7 po 48 godzinach, co zilustrowano w Video 4.

W drugiej fazie eksperymentów wykorzystano barwniki fluorescencyjne do oceny indukcji apoptozy. Po 72 godzinach i 48 godzinach traktowania komórek MCF7 i SH-SY5Y odpowiednio 1 μM JCTH-4, zastosowano barwnik Hoechst w celu monitorowania morfologii jądra komórkowego. Wyniki wykazały skondensowane, intensywnie barwiące się jądra wraz z obecnością ciał apoptotycznych w komórkach MCF7 i SH-SY5Y, co wskazuje na indukcję apoptozy (Ryc. 2a, b). Samo traktowanie TAM spowodowało minimalne zmiany w morfologii jąder apoptotycznych w komórkach MCF7 i SH-SY5Y; jądra były duże, okrągłe i słabo barwiły się barwnikiem Hoechst, podobnie jak w grupie kontrolnej z rozpuszczalnikiem (Ryc. 2a, b). Zgodnie z Filmem 4, jądra komórek MCF7 i SH-SY5Y wykazały wyraźny wzrost morfologii apoptotycznej po 72 godzinach leczenia skojarzonego (Ryc. 2a, b).

Aby zweryfikować indukcję apoptozy, oceniono eksternalizację fosfatydyloseryny, będącą markerem apoptozy, za pomocą testu wiązania Annexin V17. Komórki MCF7 i SH-SY5Y traktowane odpowiednio przez 72 i 48 godziny samym JCTH-4 w stężeniu 1 μM oraz w kombinacji z TAM w stężeniu 10 μM wykazały wiązanie Annexin V, co objawiało się zieloną fluorescencją, potwierdzając indukcję apoptozy (Rys. 3a, b). Nie zaobserwowano wyraźnej eksternalizacji fosfatydyloseryny w komórkach MCF7 i SH-SY5Y traktowanych samym TAM, ani w komórkach NFF w przypadku wszystkich wspomnianych grup traktowania po 72 godzinach (Rys. 3c). Zatem JCTH-4, zarówno samodzielnie, jak i w kombinacji z TAM, selektywnie indukuje apoptozę w komórkach MCF7 i SH-SY5Y.

Aby określić wpływ samego JCTH-4 oraz jego połączenia z TAM, przeprowadzono kolorymetryczny test żywotności komórek oparty na WST-1, będący wskaźnikiem aktywnego metabolizmu komórkowego, na komórkach MCF7 i NFF poddawanych działaniu przez 72 godziny oraz na komórkach SH-SY5Y poddawanych działaniu przez 48 godzin. W porównaniu z grupami kontrolnymi z rozpuszczalnikiem, 1 μM JCTH-4 zmniejszył aktywny metabolizm komórek o ponad 50%, podczas gdy 10 μM samego TAM nie wykazało istotnej różnicy w komórkach MCF7 i SH-SY5Y (Rys. 4a, b). Co ciekawe, w komórkach MCF7 i SH-SY5Y dodanie TAM do działania JCTH-4 spowodowało synergistyczny spadek metabolizmu komórkowego. Komórki NFF były znacznie mniej wrażliwe zarówno na sam JCTH-4, jak i na JCTH-4 z TAM (Rys. 4c). Zatem JCTH-4 wykazuje selektywną aktywność synergistyczną z TAM w komórkach MCF7 i SH-SY5Y.

Kierowanie JCTH-4 do mitochondriów

Aby sprawdzić, czy JCTH-4 oddziałuje na mitochondria w celu indukcji apoptozy, monitorowano potencjał błony mitochondrialnej w całych komórkach oraz generowanie ROS w izolowanych mitochondriach. Komórki MCF7 poddano działaniu preparatu przez 72 godziny i barwiono TMRM. 1 μM JCTH-4 zmniejszyło MMP, co zasygnalizował zanik czerwonej fluorescencji (Rys. 5a). Jednakże po dodaniu 10 μM TAM zaobserwowano większy spadek MMP, podczas gdy 10 μM TAM samego w sobie nie wywarło widocznego wpływu na MMP.

Ponieważ wzrost generowania ROS wiąże się z permeabilizacją błony mitochondrialnej i indukcją apoptozy, produkcję ROS oceniono za pomocą barwnika Amplex Red w wyizolowanych mitochondriach z komórek SH-SY5Y traktowanych 1 μM JCTH-4 i 10 μM TAM, osobno oraz w kombinacji18-20. Odczyty fluorescencji wyrażono w względnych jednostkach fluorescencji (RFU). Wzrost generowania ROS zaobserwowano przy zastosowaniu samego JCTH-4 oraz samego TAM (Rys. 5b). Co ciekawe, terapia skojarzona doprowadziła do większego wzrostu produkcji ROS. Jako kontrolę pozytywną wykorzystano PQ, znany induktor produkcji ROS w mitochondriach.

Indukcja autofagii przez JCTH-4 i TAM

Indukcja autofagii została powiązana z oddziaływaniem chemioterapeutycznym wielu różnych związków3. Aby ocenić indukcję autofagii, przeprowadzono barwienie MDC w komórkach MCF7 traktowanych 1 μM JCTH-4 oraz 10 μM TAM osobno i w kombinacji przez 72 godziny. Niebieska fluorescencja punktowa, wskazująca na obecność autofagosomów, wystąpiła w komórkach MCF7 traktowanych JCTH-4 i TAM osobno oraz w kombinacji (Ryc. 6a). Co istotne, intensywność barwienia MDC była największa w przypadku leczenia skojarzonego, a następnie dla TAM osobno i JCTH-4 osobno.

Podczas autofagii białko 1 lekkiego łańcucha 3 związane z mikrotubulami (LC3), normalnie zlokalizowane w cytozolu (LC3-I), ulega lipidacji fosfatydyloetanolaminą, a następnie lokalizuje się w błonach autofagosomów (LC3-II)2. Aby zweryfikować indukcję autofagii, poziomy LC3-II w komórkach MCF7 traktowanych przez 72 godziny oceniono za pomocą analizy western blot. 1 μM JCTH-4 słabo indukowało konwersję LC3-I do LC3-II, podczas gdy 10 μM TAM wywołało silniejszą odpowiedź autofagiczną (Rys. 6b). Co ciekawe, terapia skojarzona doprowadziła do najsilniejszej indukcji autofagii, dając stosunek LC3-II do LC3-I większy niż 3. Zatem wyniki te wykazują indukcję autofagii w komórkach MCF7 przez JCTH-4 i TAM osobno oraz w kombinacji, przy czym najsilniejsza odpowiedź wystąpiła w komórkach poddanych terapii skojarzonej.

Wideo dodatkowe 1. Morfologia komórkowa komórek MCF7 traktowanych kontrolą rozpuszczalnika. Komórki MCF7 monitorowano między 48 a 66 godzinami po traktowaniu kontrolą rozpuszczalnika (DMSO) przy użyciu mikroskopii time-lapse z obrazami w kontraście fazowym. Komórki utrzymywano w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Obrazy wykonano przy powiększeniu 400x. Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo.

Wideo uzupełniające 2. Indukcja apoptotycznej morfologii komórkowej w komórkach MCF7 traktowanych JCTH-4. Komórki MCF7 monitorowano między 48 a 66 godzinami po traktowaniu 1 μM JCTH-4 przy użyciu mikroskopii time-lapse z obrazowaniem w kontraście fazowym. Komórki utrzymywano w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Obrazy zarejestrowano przy powiększeniu 400x. Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo.

Wideo uzupełniające 3. Indukcja autofagicznej morfologii komórkowej w komórkach MCF7 traktowanych TAM. Komórki MCF7 monitorowano między 48 a 66 godzinami po traktowaniu 10 μM TAM przy użyciu mikroskopii time-lapse z obrazami w kontraście fazowym. Komórki utrzymywano w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Obrazy zarejestrowano przy powiększeniu 400x. Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo.

Wideo uzupełniające 4. Wzmocniona morfologia apoptozy indukowana przez JCTH-4 wraz z TAM w komórkach MCF7. Komórki MCF7 monitorowano między 48 a 66 godzinami po podaniu 1 μM JCTH-4 i 10 μM TAM przy użyciu mikroskopii poklatkowej z obrazami w kontraście fazowym. Komórki utrzymywano w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Obrazy zarejestrowano przy powiększeniu 400x. Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo.

Wzory struktur chemicznych: schemat pancratystatyny (PST) i JC-TH-acetate-4 (JCTH-4).
Rycina 1. Porównanie strukturalne PST z syntetycznym analogiem 7-deoksy. (a) Struktura chemiczna pancratystatyny (PST). (b) Struktura chemiczna JC-TH-acetate-4 (JCTH-4).

Efekty traktowania komórek; barwienie Hoechstem, kontrast fazowy, MCF7/SH-SY5Y, mikroskopia fluorescencyjna.
Rycina 2. JCTH-4 indukuje apoptotyczną morfologię jąder komórkowych, wykazując zwiększoną aktywność w połączeniu z TAM. Morfologia jąder komórek (a) MCF7 oraz (b) SH-SY5Y traktowanych odpowiednio przez 72 i 48 godzin wskazanymi stężeniami TAM i JCTH-4, zabarwionych barwnikiem Hoechst. Grupy kontrolne traktowano rozpuszczalnikiem (DMSO). Obrazy wykonano przy powiększeniu 400x za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Pasek skali = 15 μm.

Test żywotności komórek; barwniki Hoechst i Annexin V; komórki MCF7, SH-SY5Y i NFF; mikroskopia fluorescencyjna.
Rycina 3. JCTH-4 powoduje eksternalizację fosfatydyloseryny samodzielnie oraz w połączeniu z TAM selektywnie w komórkach nowotworowych. Wiązanie Annexin V do eksternalizowanej fosfatydyloseryny oceniano w celu weryfikacji indukcji apoptozy w komórkach (a) MCF7 (72 godziny), (b) SH-SY5Y (48 godzin) oraz (c) NFF (72 godziny) traktowanych JCTH-4 i TAM w zaznaczonych stężeniach. Grupy kontrolne traktowano rozpuszczalnikiem (DMSO). Obrazy wykonano przy powiększeniu 400x za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Pasek skali = 15 μm.

Wykresy słupkowe absorbancji dla linii komórkowych MCF7, SH-SY5Y, NFF; wpływ TAM, JCTH-4 na żywotność.
Rycina 4. TAM nasila spadek żywotności wywołany przez JCTH-4 selektywnie w komórkach nowotworowych. Na płytkach 96-dołkowych wysiano komórki (a) MCF7, (b) SH-SY5Y oraz (c) NFF, które następnie poddano działaniu JCTH-4 i TAM w indicated stężeniach. Komórki MCF7 i NFF inkubowano z lekami przez 72 godziny, a komórki SH-SY5Y przez 48 godzin. Po zakończeniu leczenia i inkubacji do każdego dołka dodano odczynnik WST-1, a następnie zmierzono absorbancję przy 450 nm i wyrażono ją jako procent wartości kontroli (DMSO). Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu programu GraphPad Prism w wersji 5.0. Wartości przedstawiono jako średnia ± SD z czterech powtórzeń w 3 niezależnych eksperymentach. MCF7: *p<0.001, **p<0.0001 względem kontroli; #p<0.05 względem 1 μM JCTH-4; †p<0.0001 względem 10 μM TAM. SH-SY5Y: *p<0.0005 względem kontroli; #p<0.005 względem 1 μM JCTH-4; †p<0.005 względem 10 μM TAM. NFF: *p<0.005 względem 10 μM TAM + 1 μM JCTH-4 w komórkach MCF7; #p<0.01 względem 10 μM TAM + 1 μM JCTH-4 w komórkach SH-SY5Y.

Mikroskopia komórek MCF7 wykazująca barwienie TMRM po zastosowaniu preparatów; wykres słupkowy wyników RFU dla komórek SH-SY5Y.
Rycina 5. JCTH-4 i TAM oddziałują na mitochondria. (a) Komórki MCF7 hodowano na szkiełkach nakrywkowych, traktowano wskazanymi stężeniami leków przez 72 godziny, a następnie barwiono TMRM w celu oceny MMP. Komórki grupy kontrolnej traktowano rozpuszczalnikiem (DMSO). Obrazy zarejestrowano przy powiększeniu 400x za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Pasek skali = 15 μm. (b) Izolowane mitochondria z komórek SH-SY5Y traktowano JCTH-4 i TAM w wskazanych stężeniach, a produkcję ROS oceniano przy użyciu substratu Amplex Red w obecności peroksydazy chrzanowej (HRP). Komórki grupy kontrolnej traktowano rozpuszczalnikiem (DMSO). Paraquat (PQ) w stężeniu 250 μM zastosowano jako kontrolę dodatnią. Odczyty fluorescencji uzyskano po 2 godzinach traktowania przy Ex. 560 nm i Em. 590 nm i wyrażono jako względne jednostki fluorescencji (RFU). Obliczenia statystyczne wykonano przy użyciu programu GraphPad Prism w wersji 5.0. Dane są reprezentatywne dla 3 niezależnych eksperymentów o podobnych trendach. Wartości wyrażono jako średnia ± SD z czterech powtórzeń jednego niezależnego eksperymentu. *p<0,05, **p<0,005, ***p<0,001 względem kontroli; #p<0,05 względem 1 μM JCTH-4; †p<0,05 względem 10 μM TAM; @p<0,05 względem 250 μM PQ.

Analiza traktowania komórek MCF7, obrazy mikroskopowe i wyniki ekspresji białek, wykres słupkowy stosunku LC3.
Rysunek 6. TAM wzmacnia indukcję autofagii przez JCTH-4. (a) Komórki MCF7 hodowano na szkiełkach nakrywkowych i poddano działaniu JCTH-4 oraz TAM w określonych stężeniach przez 72 godziny. Komórki grupy kontrolnej traktowano rozpuszczalnikiem (DMSO). Po traktowaniu komórki MCF7 barwiono MDC w celu wykrycia wakuol autofagicznych. Obrazy wykonano przy powiększeniu 400x za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Pasek skali= 15 μm. (b) Analizy Western blot dla LC3 i β-Actin przeprowadzono na lizatach komórkowych komórek MCF7 traktowanych wskazanymi stężeniami leków przez 72 godziny. Analizy densytometryczne wykonano przy użyciu oprogramowania ImageJ. Obliczenia statystyczne przeprowadzono za pomocą programu GraphPad Prism wersja 5.0. Wartości przedstawiono jako średnia ± SD. *p<0,05, **p<0,005, ***p<0,0005 względem kontroli; #p<0,001 względem 1 μM JCTH-4; †p<0,001 względem 10 μM TAM.

Lista skrótów.

ERreceptor estrogenowy
FMNflawinomononukleotyd
JCTH-4JC-TH-octan-4
LC3białko 1 związane z mikrotubulami, lekki łańcuch 3
MDCmonodansylowana kadaweryna
MMPpotencjał błony mitochondrialnej
MRCmitochondrialny łańcuch oddechowy
NFFnormalne ludzkie fibroblasty płodowe
PQparaquat
PSTpankratystatyna
RFUwzględne jednostki fluorescencji
ROSreaktywne formy tlenu
TAMtamoksifen
TMRMestry metylowe tetrametylorodaminy

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wykazano, że PST i podobne związki wykazują właściwości przeciwnowotworowe11-15,21. Wcześniej zgłaszaliśmy, że naturalny PST selektywnie destabilizuje mitochondria w komórkach nowotworowych, co indukuje apoptozę poprzez uwalnianie czynników apoptogennych12,14. Najbardziej prawdopodobne jest, że JCTH-4 działa poprzez ten sam mechanizm; JCTH-4 spowodował spadek MMP w komórkach MCF7, co wykazano w barwieniu TMRM (Ryc. 5a), oraz zwiększył generowanie ROS w izolowanych mitochondriach z k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca ta została wsparta przez Knights of Columbus Chapter 9671 (Windsor, Ontario) oraz stypendium kanadyjskie CIHR Frederick Banting and Charles Best Canada Graduate Scholarship przyznanym Dennisowi Ma. Dziękujemy Robertowi Hodge'owi i Elizabeth Fidalgo da Silva za pomoc przy mikroskopii poklatkowej. Dziękujemy Katie Facecchia za montaż filmów z mikroskopii poklatkowej. Chcielibyśmy również podziękować Sudipie June Chatterjee i Phillipowi Tremblayowi za krytyczny przegląd niniejszego manuskryptu. Praca ta jest dedykowana pamięci Kevina Couvillona, który w 2010 roku przegrał walkę z rakiem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
linia komórkowa SH-SY5YATCCCRL-2266
Dulbecco’modyfikowana pożywka Eaglesa F-12 HAMSigma-Aldrich51448C
Płodowa surowica bydlęca GIBCO, by Life Technologies16000-044
linia komórkowa MCF7ATCCHTB-22
pożywka RPMI-1640Sigma-AldrichR 0883
Linia komórkowa pozornych normalnych fibroblastów płodu ludzkiego (NFF)Coriell Institute for Medical ResearchAG04431B
Dulbecco’zmodyfikowane pożywka Eagle'a’poziom medium, pożywka z wysoką zawartością glukozyThermo Fisher Scientific, Inc.SH30022.01
Cytrynian tamoksyfenu Sigma-AldrichT9262
szalki hodowlane z przeszklonym dnem o średnicy 35 mm MatTek Corp.P35G-014-C
odwrócony mikroskop Leica DMI6000 BLeica MicrosystemsN/D
H–barwnik chst 33342Sondy molekularne, Life TechnologiesH3570
odwrócony mikroskop fluorescencyjny Leica DM IRB Leica MicrosystemsN/A
Aneksyna V AlexaFluor-488InvitrogenA13201
roztwór błękitu trypanowegoSigma-AldrichT8154-20ML
Komora licznikowa (hemocytometr)Fisher Scientific267110
odczynnik WST-1Grupa Roche11644807001
Wallac Victor3 Licznik wieloetykietowy 1420PerkinElmer, Inc.1420-011
Metyloester tetrametylorodaminy (TMRM) GIBCO, by Life TechnologiesT-668
Szklany homogenizator do tkanekFisher ScientificK8885300-0002
Analiza białek BioRadBio-Rad500-0001Dół formularza
Amplex RedInvitrogenA12222
peroksydaza chrzanowa (HRP)Sigma-AldrichP8125
SpectraMax Gemini XPSMolecular Devices3126666
Przeciwciało przeciwko LC3 wytworzone u królikaNovus BiologicalsNB100-2220
Przeciwmysi przeciwciało wtórne sprzężone z HRPAbcamab6728
przeciwkrólicze przeciwciało wtórne sprzężone z HRPAbcamab6802
Substrat peroksydazy do chemiluminescencjiSigma-AldrichCPS160
Monodansylowana kadawerynaSigma-Aldrich30432

Bibliografia

  1. Earnshaw, W. C. Apoptosis. A cellular poison cupboard. Nature. 397, 387-389 (1999).
  2. Kroemer, G., Mariño, G., Levine, B. Autophagy and the integrated stress response. Mol. Cell. 40, 280-293 (2010).
  3. Dalby, K. N., Tekedereli, I., Lopez-Berestein, G., Ozpolat, B. Targeting the prodeath and prosurvival functions of autophagy as novel therapeutic strategies in cancer. Autophagy. 6, 322-329 (2010).
  4. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  5. Fearon, E. R. Human Cancer Syndromes: Clues to the Origin and Nature of Cancer. Science. 278, 1043-1050 (1997).
  6. Tsokos, M., Scarpa, S., Ross, R. A., Triche, T. J. Differentiation of human neuroblastoma recapitulates neural crest development. Study of morphology, neurotransmitter enzymes, and extracellular matrix proteins. The American Journal of Pathology. 128, 484-496 (1987).
  7. Schwab, M., Westermann, F., Hero, B., Berthold, F. Neuroblastoma: biology and molecular and chromosomal pathology. Lancet Oncol. 4, 472-480 (2003).
  8. Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Thun, M. J. Cancer statistics, 2009. CA Cancer J. Clin. 59, 225-249 (2009).
  9. Howell, A. The endocrine prevention of breast cancer. Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab. 22, 615-623 (2008).
  10. Moreira, P., Custodio, J., Morena, A., Oliveira, C., Santos, M. Tamoxifen and estradiol interact with the flavin mononucleotide site of complex I leading to mitochondrial failure. J. Biol. Chem. 281, 10143-10152 (2006).
  11. Kekre, N., Griffin, C., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin causes early activation of caspase-3 and the flipping of phosphatidyl serine followed by rapid apoptosis specifically in human lymphoma cells. Cancer Chemother. Pharmacol. 56, 29-38 (2005).
  12. McLachlan, A., Kekre, N., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin: a natural anti-cancer compound that targets mitochondria specifically in cancer cells to induce apoptosis. Apoptosis. 10, 619-630 (2005).
  13. Griffin, C., Hamm, C., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin induces apoptosis in clinical leukemia samples with minimal effect on noncancerous peripheral blood mononuclear cells. Cancer Cell Int. 10, 6(2010).
  14. Griffin, C., Karnik, A., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin selectively targets cancer cell mitochondria and reduces growth of human colon tumor xenografts. Molecular Cancer Therapeutics. 10, 57-68 (2011).
  15. Griffin, C., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin induces apoptosis and autophagy in metastatic prostate cancer cells. Int. J. Oncol. 38, 1549-1556 (2011).
  16. Collins, J., Rinner, U., Moser, M., Hudlicky, T., Ghiviriga, I., Romero, A. E., Kornienko, A., Ma, D., Griffin, C., Pandey, S. Chemoenzymatic synthesis of Amaryllidaceae constituents and biological evaluation of their C-1 analogues. The next generation synthesis of 7-deoxypancratistatin and trans-dihydrolycoricidine. J. Org. Chem. 75, 3069-3084 (2010).
  17. Zhang, G., Gurtu, V., Kain, S. R., Yan, G. Early detection of apoptosis using a fluorescent conjugate of annexin V. Biotechniques. 23, 525-531 (1997).
  18. Madesh, M., Hajnóczky, G. VDAC-dependent permeabilization of the outer mitochondrial membrane by superoxide induces rapid and massive cytochrome c release. J. Cell Biol. 155, 1003-1015 (2001).
  19. Simon, H. U., Haj-Yehia, A., Levi-Schaffer, F. Role of reactive oxygen species (ROS) in apoptosis induction. Apoptosis. 5, 415-418 (2000).
  20. Batandier, C., Leverve, X., Fontaine, E. Opening of the mitochondrial permeability transition pore induces reactive oxygen species production at the level of the respiratory chain complex I. J Biol Chem. 279, 17197-17204 (2004).
  21. Lefranc, F., Sauvage, S., Goietsenoven, G. V. an, Mégalizzi, V., Lamoral-Theys, D., Debeir, O., Spiegl-Kreinecker, S., Berger, W., Mathieu, V., Decaestecker, C., Kiss, R. Narciclasine, a plant growth modulator, activates Rho and stress fibers in glioblastoma cells. Mol. Cancer Ther. 8, 1739-1750 (2009).
  22. Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
  23. Heerdt, B. G., Houston, M. A., Augenlicht, L. H. Growth properties of colonic tumor cells are a function of the intrinsic mitochondrial membrane potential. Cancer Res. 66, 1591-1596 (2006).
  24. Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
  25. Casellas, P., Galiegue, S., Basile, A. S. Peripheral benzodiazepine receptors and mitochondrial function. Neurochem. Int. 40, 475-486 (2002).
  26. Mathupala, S. P., Rempel, A., Pedersen, P. L. Aberrant glycolytic metabolism of cancer cells: a remarkable coordination of genetic, transcriptional, post-translational, and mutational events that lead to a critical role for type II hexokinase. J. Bioenerg. Biomembr. 29, 339-343 (1997).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Indukcja apoptozyanalog JCTH-4kombinacja z tamoksyfenemcelowanie mitochondrialnekomórki raka piersimikroskopia time-lapsereaktywne formy tlenuanaliza Western blot
Wzmocnienie indukcji apoptozy i autofagii przez nowy syntetyczny analog C-1 7-deoksypancratystatyny w ludzkich komórkach gruczolakoraka piersi i neuroblastoma w połączeniu z tamoksyfenem
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.