Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

System 3D do hodowli ludzkich chondrocytów stawowych w płynie stawowym

20.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3587

⸱

31 stycznia 2012

 ,  , 
1Department of Anatomy and Cellular Biology, Tufts University School of Medicine, 2Department of Rheumatology, Tufts Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano trójwymiarowy system hodowli ludzkich chondrocytów stawowych w wysokim stężeniu płynu stawowego. Płyn stawowy odzwierciedla najbardziej naturalne mikrośrodowisko dla chrząstki stawowej, a jego pozyskanie i przechowywanie są łatwe. System ten może zatem być wykorzystywany do badania regeneracji chrząstki oraz do przesiewu terapeutyków stosowanych w leczeniu zapalenia stawów.

Streszczenie

Destrukcja chrząstki jest kluczową cechą patologiczną choroby zwyrodnieniowej stawów, która stanowi główną przyczynę niepełnosprawności w USA. Chrząstka u dorosłych nie regeneruje się efektywnie in vivo; w rezultacie choroba zwyrodnieniowa prowadzi do nieodwracalnej utraty chrząstki, której towarzyszy chroniczny ból i unieruchomienie 1,2. Inżynieria tkankowa chrząstki oferuje obiecujący potencjał w zakresie regeneracji i przywracania funkcji tkanki. Technologia ta zazwyczaj polega na wysiewaniu chondrocytów do rusztowań naturalnych lub syntetycznych i hodowli powstałej konstrukcji 3D w zrównoważonym medium przez określony czas, z celem stworzenia biochemicznie i biomechanicznie dojrzałej tkanki, którą można przeszczepić w miejsce ubytku in vivo 3-6. Osiągnięcie optymalnych warunków dla wzrostu chondrocytów i odkładania macierzy jest niezbędne dla sukcesu inżynierii tkankowej chrząstki.

W naturalnej jamie stawowej chrząstka na powierzchni stawowej kości jest kąpana w płynie stawowym. Ten klarowny i lepki płyn dostarcza składników odżywczych do naczyniowej chrząstki stawowej oraz zawiera czynniki wzrostu, cytokiny i enzymy, które są istotne dla metabolizmu chondrocytów 7,8. Ponadto płyn stawowy ułatwia ruchy przy niskim tarciu między powierzchniami chrzęstnymi, głównie poprzez wydzielanie dwóch kluczowych składników: kwasu hialuronowego i lubrycyny 9 10. W przeciwieństwie do tego, chrząstka inżynierowana tkankowo jest najczęściej hodowana w sztucznych mediach. Choć media te prawdopodobnie pozwalają na zapewnienie bardziej zdefiniowanych warunków do badania metabolizmu chondrocytów, płyn stawowy najdokładniej odzwierciedla naturalne środowisko, w którym znajdują się chondrocyty stawowe.

W rzeczywistości płyn stawowy ma tę zaletę, że jest łatwy do pobrania i przechowywania, a organizm często regularnie go uzupełnia. Kilka grup badawczych wzbogacało pożywkę hodowlaną płynem stawowym podczas hodowli ludzkich, bydlęcych, króliczych i psich chondrocytów, jednak najczęściej stosowano jedynie niskie stężenia płynu stawowego (poniżej 20%) 11-25. Choć chondrocyty kurczaka, konia i człowieka były hodowane w pożywkach z wyższym odsetkiem płynu stawowego, systemy te były dwuwymiarowe 26-28. Przedstawiamy tutaj naszą metodę hodowli ludzkich chondrocytów stawowych w systemie 3D z wysokim odsetkiem płynu stawowego (do 100%) przez okres 21 dni. W ten sposób pokonaliśmy główną przeszkodę, jaką jest wysoka lepkość płynu stawowego. System ten umożliwia badanie ludzkich chondrocytów w płynie stawowym w układzie 3D, co można dodatkowo połączyć z dwoma innymi istotnymi czynnikami (ciśnieniem parcjalnym tlenu oraz obciążeniem mechanicznym) 29,30, które stanowią naturalne środowisko chrząstki, aby naśladować naturalne warunki jej wzrostu. Co więcej, system ten może być również wykorzystywany do analizy aktywności płynu stawowego na chondrocyty oraz stanowić platformę do opracowywania technologii regeneracji chrząstki i opcji terapeutycznych w leczeniu zapalenia stawów.

Protokół

Trójwymiarowy system hodowli ludzkich chondrocytów stawowych w płynie stawowym

W niniejszej pracy enkapsulowano ludzkie chondrocyty stawowe w kule alginianowe, stosując zmodyfikowany protokół enkapsulacji sugerowany przez producenta (Lonza, oraz 31). Wykorzystując te konstrukty 3D, opracowaliśmy system hodowli komórek w pożywce zawierającej różne stężenia ludzkiego płynu stawowego i oceniliśmy ekspresję genów chrząstki w tych konstruktach 3D.

1. Przygotowanie ludzkich chondrocytów stawowych (HAC) do enkapsulacji trójwymiarowej (3D)

  1. Rozmrozić fiolkę (1 ml) ludzkich chondrocytów stawowych (HAC) (Lonza) (pasaż 2) w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C przez 1 min.
  2. Wymieszać z 1 ml pożywki do wzrostu chondrocytów (Lonza) i wirować przy 3000 rpm przez 3-5 min w celu zebrania komórek. Odrzucić nadsącz.
  3. Resuspendować pellet komórkowy w pożywce do wzrostu chondrocytów (Lonza).
  4. Przesiać komórki do 10 cm płytki do hodowli tkanek (BD Biosciences) i hodować w pożywce do wzrostu chondrocytów (Lonza) aż do uzyskania konfluencji. HAC powinny być wykorzystywane w pasażu nie wyższym niż 3 lub 4 (P3 lub P4).
  5. Przemyć HAC na płytce za pomocą 155 mM NaCl zamiast standardowego PBS, a następnie przeprowadzić trypsynizację w celu zebrania komórek do enkapsulacji w kuleczkach alginianowych. Po odczepieniu komórek wirować je przy 3000 rpm przez 5 min. Komórki są teraz gotowe do enkapsulacji 3D.

2. Enkapsulacja HAC w koralikach 3D

Resuspender HAC w 1,2% roztworze alginianu (Sigma) przy gęstości 8x105cells/ml. Liczbę komórek określono przed enkapsulacją, korzystając ze standardowego licznika komórek. Bardzo ważne jest dokładne wymieszanie, aby zapewnić równomierny rozkład komórek w kuleczkach.

  1. Przenieś mieszaninę roztworu HAC/alginianu pipetą do strzykawki o pojemności 12 ml z dołączoną igłą o rozmiarze 22G (Tyco healthcare, Inc.).
  2. W międzyczasie przygotuj zlewkę o pojemności 50 mL z 102 mM CaCl2 w objętości 5-krotnie większej niż objętość roztworu HAC/alginianu. Umieść w zlewce mieszadło magnetyczne i powoli mieszaj roztwór 102 mM CaCl2 (z prędkością około 150 rpm).
  3. Trzymając końcówkę strzykawki na wysokości około 6 cali nad powierzchnią roztworu CaCl2, dodawaj mieszaninę HAC/alginianu do roztworu CaCl2 kroplami. Zazwyczaj otrzymane kule alginianowe mają średnicę 2 mm, a gęstość enkapsulacji wynosi około 104 komórek/kula. Uwaga: Wysokość strzykawki nad roztworem CaCl2 jest istotna. Krótsza odległość spowoduje powstanie kulek w kształcie łzy zamiast sferycznych, co doprowadzi do nierównomiernej integralności mechanicznej i enkapsulacji komórek.
  4. Pozostaw kulki do mieszania w roztworze CaCl2 przez 20-25 min. Choć inne protokoły enkapsulacji w alginianie wskazują znacznie krótszy czas inkubacji wynoszący 10 min, stwierdzono, że dłuższy czas inkubacji w roztworze CaCl2 poprawia integralność kulek.
  5. Usuń roztwór CaCl2, przemyj kulki 2-3 razy w 2-3 objętościach NaCl, a następnie raz w medium do różnicowania chondrocytów (Lonza). Podczas gdy inne protokoły enkapsulacji w kule alginianowe obejmują użycie filtra do powyższych procedur płukania, zaobserwowano, że kulki alginianowe często zaplątują się w filtrze i wysychają, co zmniejsza wydajność enkapsulacji. Najbardziej efektywnym rozwiązaniem okazało się pozwolenie kulkom na opadnięcie na dno zlewki przed wylaniem roztworu.
  6. Używając standardowej szpatułki, przenieś kulki do naczyń hodowlanych. Zazwyczaj hoduje się 12 kulek na studzienkę 3 cm przez 2 dni w medium wzrostowym dla chondrocytów, aby umożliwić chondrocytom adaptację do procesu enkapsulacji w medium, w którym były hodowane, przed przejściem na medium do różnicowania chondrocytów (Lonza) z płynem stawowym.

3. Hodowla chondrocytów w pożywce do hodowli w płynie stawowym

  1. Świeży płyn stawowy można pozyskać z poradni ambulatoryjnej (pozyskano go z Tufts Medical Center). Płyn stawowy można transportować do laboratorium w probówkach Falcon o pojemności 15 ml, a następnie niezwłocznie odwirować przy 3000 rpm przez 15min w celu usunięcia szczątków komórkowych. Płyn stawowy pozbawiony komórek należy rozdzielić do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL, aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania. Nadlodówkę można przechowywać w temperaturze -80°C do momentu użycia.
  2. Przed hodowlą zmieszać płyn stawowy z pożywką do różnicowania chondrocytów (CDM, Lonza) w różnych stosunkach objętościowych, przy stałym stężeniu 100mM kwasu askorbinowego i 9 mM CaCl2 (ta śladowa ilość CaCl2 ma na celu zapewnienie integralności kulek alginianowych).
  3. Płytkę należy umieścić na platformie kołyszącej w inkubatorze w temperaturze 37°C (częstotliwość kołysania: ok. 75 razy/min), aby wspomóc dystrybucję składników odżywczych wewnątrz kulek alginianowych oraz ograniczyć ich zlepianie się. Jest to szczególnie istotne, ponieważ hodujemy te chondrocyty przez przedłużony czas (do 4 tygodni). Uwaga: Choć pożywki do wzrostu i różnicowania chondrocytów (Lonza) zawierają dwa powszechnie stosowane antybiotyki – gentamycynę i amfoterycynę – nie dodawaliśmy żadnych antybiotyków podczas stosowania różnych stężeń płynu stawowego w hodowli chondrocytów. Nie zaobserwowano żadnych zanieczyszczeń.
  4. Wymieniać mieszaniny pożywek co 2-3 dni. Lepkość płynu stawowego stanowiła główną przeszkodę w hodowli chondrocytów enkapsulowanych w kulkach alginianowych podczas długoterminowych kultur. Stwierdzono, że najskuteczniejszą metodą jest rozcieńczanie pożywki z dodatkiem płynu stawowego za pomocą 102mM CaCl2 (50% V/V), co dodatkowo wzmacnia integralność kulek alginianowych. W ten sposób pożywkę można powoli usunąć pipetą, nie uszkadzając kulek.

4. Odzyskiwanie HAC w kuleczkach alginianowych do analizy ekspresji genów

Należy zachować szczególną ostrożność podczas odzyskiwania HAC z kulek alginianowych do analizy ekspresji genów.

  1. Przemyć kule alginianowe 3 razy w 102 mM CaCl2, po około 5 min każdego razie.
  2. Odzyskać chondrocyty, dodając 55 mM NaCitrate w objętości 4-5 razy większej niż objętość kulek. Ważne jest, aby kule alginianowe były całkowicie zanurzone w roztworze NaCitrate. Wstrząsać lub inkubować na wytrząsarce przez 20-30 min.
  3. Odwirować komórki i odlać nadsącz.
  4. Do analizy RT-PCR resuspender pellet komórkowy w buforze do lizy komórek (Qiagen RNA isolation kit), a następnie przystąpić do oczyszczania RNA.

5. Fixowanie HAC w kuleczkach alginianowych do analizy histologicznej

Należy zachować szczególną ostrożność podczas odzyskiwania HAC z kulek 3D do analizy histologicznej.

  1. Przemyć kuleczki alginianowe 3 razy w 102 mM CaCl2, po około 5 min za każdym razem. Aby całkowicie usunąć lepki płyn stawowy, najskuteczniejszą metodą okazało się płukanie w pożywce do różnicowania chondrocytów (Lonza) przez noc, w inkubatorze z kołysaniem w temperaturze 37°C (częstotliwość kołysania: około 75 razy/min). Zastosowano pożywkę do wzrostu chondrocytów, aby zapewnić ich przeżycie podczas tego przedłużonego płukania oraz umożliwić maksymalne przenikanie utrwalacza.
  2. Utrwalić kuleczki w 70% etanolu przez noc, a następnie przystąpić do analizy histologicznej. Aby przeprowadzić barwienie Dapi, inkubować kuleczki alginianowe z roztworem Dapi (500ng/ml) przez 1h przy delikatnym kołysaniu, a następnie przemyć 3 razy w 102mM CaCl2 po 15 min za każdym razem. Obrazy Dapi można następnie oglądać pod mikroskopem fluorescencyjnym. Kuleczki można również poddać sekcjowaniu w celu barwienia błękitem alcianowym oraz H&E.

6. Reprezentatywne wyniki

Nasza metoda hodowli 3D chondrocytów ludzkich w wysokich stężeniach płynu stawowego została przedstawiona na schemacie widocznym na Rys. 1. Po enkapsulacji chondrocytów ludzkich w kulek alginianowych, pozwolono im rosnąć w pożywce uzupełnionej o różne proporcje płynu stawowego. Ze względu na lepkość płynu stawowego, niezbędne jest hodowanie chondrocytów w warunkach ciągłego kołysania, aby zapobiec zlepianiu się konstruktów chrzęstnych i zapewnić równomierny rozkład składników odżywczych. Niezbędne jest również dokładne przemycie kulek alginianowych przed odzyskaniem chondrocytów, aby bufor utrwalający lub lizujący mógł przeniknąć do wnętrza kulek (Rys. 1). Zdjęcia chondrocytów w kulkach alginianowych wykonane w jasnym polu (BF) przedstawiono na Rys. 2. Wykonano barwienie Dapi, aby potwierdzić jednolity rozkład komórek wewnątrz kulek (Rys. 2). Po zakończeniu 21-dniowego okresu hodowli przeprowadzono analizę ekspresji genów za pomocą qRT-PCR. Gen referencyjny GAPDH został wykorzystany do normalizacji wszystkich reakcji PCR, ponieważ określono go jako jeden z najwiarygodniejszych genów referencyjnych dla analiz qPCR w chondrocytach 32. Przykład przedstawiono na Rys. 3, gdzie przeanalizowano wyniki uzyskane z ludzkich chondrocytów stawowych hodowanych w płynie stawowym zebranym od sześciu pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów. Zgodnie z faktem, że chondrocyty z firmy Lonza były namnażane w hodowlach 2D, co nieuchronnie prowadzi do dedyferencjacji 33, stwierdzono, że chondrocyty w dniu 0 wykazywały minimalne poziomy ekspresji genów macierzy chrzęstnej (Rys. 3). Hodowla 3D chondrocytów w pożywce do różnicowania chondrocytów (Lonza) lub w pożywce uzupełnionej płynem stawowym znacząco zwiększyła ekspresję genów chrzęstnych kolagenu, agrekanu i MMP13, co wskazuje na redyferencjację chondrocytów do 21. dnia (Rys. 3) 34. Zwiększanie procentowej zawartości płynu stawowego w pożywkach doprowadziło do uzyskania porównywalnych poziomów ekspresji mRNA markerów macierzy chrzęstnej: kolagenu II i agrekanu (Rys. 3A i 3B). Co więcej, chondrocyty hodowane w 100% płynie stawowym wykazały nawet spadek ekspresji mRNA MMP13, enzymu degradującego chrząstkę, w porównaniu do komórek hodowanych w samej pożywce (Rys. 3C). Co ciekawe, poziom ekspresji wskaźnika śmierci komórkowej kaspazy 3 stopniowo malał wraz ze wzrostem proporcji płynu stawowego, co sugeruje, że hodowla w płynie stawowym doprowadziła do obniżenia poziomu apoptozy (Rys. 3D). Zatem nasze wyniki wykazują, że hodowanie ludzkich chondrocytów stawowych w wysokich stężeniach płynu stawowego w układzie 3D jest technologią wykonalną.

Tabele i rysunki

Schemat enkapsulacji i hodowli chondrocytów; konfiguracja analizy ekspresji genów; proces odzyskiwania komórek.
Rysunek 1. Schemat metody hodowli ludzkich chondrocytów stawowych w wysokim stężeniu płynu stawowego w 3D alginianowych kuletkach. Najpierw miesza się chondrocyty z roztworem alginianu. Po nakraplaniu do roztworu CaCl2 chondrocyty zostają unieruchomione wewnątrz sieciowanych kuletek hydrożelu alginianu wapnia. Te konstrukty 3D są następnie hodowane w medium do różnicowania chondrocytów (Lonza) z różnymi proporcjami ludzkiego płynu stawowego. Po 21 dniach hodowli w warunkach kołysania kuletki alginianowe zawierające komórki są dokładnie płukane, po czym komórki są odzyskiwane do analizy ekspresji genów.

Kolejne obrazy mikroskopowe analizy fluorescencji i struktury komórkowej.
Rysunek 2. Obrazy w jasnym polu (BF) i barwione DAPI hodowle enkapsulowanych ludzkich chondrocytów stawowych z 0%, 30%, 50%, 70% i 100% płynu stawowego. Chondrocyty miały kształt sferyczny we wszystkich warunkach hodowli. Obrazy z jasnego pola (BF) oraz barwienia DAPI zostały nałożone na siebie w celu potwierdzenia lokalizacji i rozkładu chondrocytów. Wstawki przedstawiają powiększone obrazy. Groty strzałek wskazują kolokalizację chondrocytów na obrazach BF i barwienia DAPI.

Wykresy słupkowe ekspresji mRNA dla kolagenu, agrekanu, MMP13 i kaspazy 3, D0 vs. D21.
Rysunek 3. Analiza qRT-PCR enkapsulowanych ludzkich chondrocytów stawowych w dniu 0 (D0) oraz po 21 dniach hodowli (D21) w medium uzupełnionym różnymi proporcjami płynu stawowego (SF) (0%, 30%, 50%, 70% i 100%). Przedstawiono wyniki z czterech niezależnych próbek. GAPDH służył jako wewnętrzna referencja dla wszystkich reakcji PCR. A. Ekspresja mRNA kolagenu II. B. Ekspresja mRNA agrekanu. C. Ekspresja mRNA MMP13. D. Ekspresja mRNA kaspazy 3. Istotność statystyczną dla próbek z dnia 0 oraz próbek z dnia 21 hodowlanych w 0% i 100% płynu stawowego (SF) oceniono za pomocą oprogramowania INSTAT. * oznacza P<0.05.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszym raporcie opracowaliśmy metodę umożliwiającą hodowlę ludzkich chondrocytów stawowych w środowisku 3D w pożywce zawierającej wysokie stężenia ludzkiego płynu stawowego. Płyn stawowy jest jednym z głównych składników tworzących naturalne środowisko w jamie stawowej, w której bytują chondrocyty stawowe. Jednak lepkość płynu stawowego stanowiła główne wyzwanie dla trójwymiarowej długoterminowej hodowli chondrocytów. Aby przezwyciężyć trudność z utrzymaniem równomiernego rozkładu składników odżywczych w konstrukci...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

Pragniemy podziękować Robin Nye (Tufts Medical Center), Tomoya Uchimura oraz Dana Cairns (Tufts University) za pomoc w przechowywaniu i wirowaniu płynu stawowego. Praca ta była finansowana przez NIH (1R01AR059106-01A1) dla L.Z.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Tabela specyficznych odczynników i sprzętu:
Nazwa odczynnikaFirmaNumer katalogowyUwagi
Alginian (sól sodowa kwasu alginowego)Sigma-AldrichA2158-250Groztwór 2,4% przechowywany w 40°C
Chlorek wapnia dwuwodny, ziarnistyJT BakerA19339
Chondrogenne medium wzrostoweLonza Inc.CC-3156 (medium podstawowe)
CC-4409 (suplement)
Medium do różnicowania chondrogennegoLonza Inc.CC-3226 (medium podstawowe)
CC-4408 (suplement)
Ludzkie chondrocyty stawoweLonza Inc.CC-2550
Dapi (4′,6-diamidino-2-fenyloindol dichlorowodorek)Sigma-AldrichD9542
Zestaw RNeasy mini (do ekstrakcji RNA)Qiagen74104
Odczynniki do PCR: SYBR-greenQuanta Biosciences95053-500
Strzykawka 12 mlTyco Healthcare, Covidien512852
Igła hipodermiczna 22GTyco Healthcare, Covidien8881
MikroskopOlympus CorporationIX71
Wstrząsarka platformowaThermo Fisher Scientific, Inc.Vari-mix
Collagen IIa-forward5’-TTC ATC CCA CCC TCT CAC AGT-3’
Collagen IIa-reverse5’-CCTCTGCCTTGACCCGAA-3’
MMP13-forward5’-TGT GCC CTT CTT CAC ACA GAC ACT-3’
MMP13-reverse5’-GAG AGC AGA CTT TGA GTC ATT GCC-3’
Caspase 3-forward5’-TCA TTA TTC AGG CCT GCC GTG GTA-3’
Caspase 3-reverse5’-TGG ATG AAC CAG GAG CCA TCC TTT -3’

Bibliografia

  1. Centers for Disease Control and P. Projected state-specific increases in self-reported doctor-diagnosed arthritis and arthritis-attributable activity limitations--United States, 2005-2030. MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 56, 423-425 (2007).
  2. Theis, K. A., Murphy, L., Hootman, J. M., Helmick, C. G., Yelin, E. Prevalence and correlates of arthritis-attributable work limitation in the US population among persons ages 18-64: 2002 National Health Interview Survey Data. Arthritis Rheum. 57, 355-363 (2007).
  3. Chung, C., Burdick, J. A. Engineering cartilage tissue. Adv. Drug. Deliv. Rev. 60, 243-262 (2008).
  4. Glowacki, J. In vitro engineering of cartilage. J. Rehabil. Res. Dev. 37, 171-177 (2000).
  5. Chokalingam, K., Hunter, S. A., Gooch, C. 3D-In vitro Effects of Compression and Time in Culture on Aggregate Modulus and on Gene Expression and Protein content of Collagen Type II in Murine Chondrocytes. Tissue Eng. Part A. , (2009).
  6. Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. Functional tissue engineering: the role of biomechanics. J. Biomech. Eng. 122, 570-575 (2000).
  7. Goldring, M. B., Goldring, S. R. Osteoarthritis. J. Cell. Physiol. 213, 626-634 (2007).
  8. Zvaifler, N. J., Firestein, G. S. Cytokines in chronic inflammatory synovitis. Scand. J. Rheumatol. Suppl. 76, 203-210 (1988).
  9. Rhee, D. K., Marcelino, J., Baker, M. The secreted glycoprotein lubricin protects cartilage surfaces and inhibits synovial cell overgrowth. J. Clin. Invest. 115, 622-631 (2005).
  10. Campo, G. M., Avenoso, A., Nastasi, G. Hyaluronan reduces inflammation in experimental arthritis by modulating TLR-2 and TLR-4 cartilage expression. Biochim. Biophys. Acta. , (2011).
  11. van de Lest, C. H., van den Hoogen, B. M., van Weeren, P. R. Loading-induced changes in synovial fluid affect cartilage metabolism. Biorheology. 37, 45-55 (2000).
  12. Saxne, T., Heinegard, D., Wollheim, F. A. Human arthritic synovial fluid influences proteoglycan biosynthesis and degradation in organ culture of bovine nasal cartilage. Coll. Relat. Res. 8, 233-247 (1988).
  13. Lee, D. A., Salih, V., Stockton, E. F., Stanton, J. S., Bentley, G. Effect of normal synovial fluid on the metabolism of articular chondrocytes in vitro. Clin. Orthop. Relat. Res. , 228-238 (1997).
  14. Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. Chondrocyte nonresponsiveness to insulin-like growth factor 1 in experimental arthritis. Arthritis Rheum. 32, 894-900 (1989).
  15. Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van Wyk, J. J., van de Putte, L. B. Insulin-like growth factor stimulation of chondrocyte proteoglycan synthesis by human synovial fluid. Arthritis Rheum. 32, 66-71 (1989).
  16. Joosten, L. A., Schalkwijk, J., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. Chondrocyte unresponsiveness to insulin-like growth factor-1. A novel pathogenetic mechanisms for cartilage destruction in experimental arthritis. Agents Actions. 26, 193-195 (1989).
  17. Schuerwegh, A. J., Dombrecht, E. J., Stevens, W. J. Synovial fluid and peripheral blood immune complexes of patients with rheumatoid arthritis induce apoptosis in cytokine-activated chondrocytes. Rheumatol. Int. 27, 901-909 (2007).
  18. Hegewald, A. A., Ringe, J., Bartel, J. Hyaluronic acid and autologous synovial fluid induce chondrogenic differentiation of equine mesenchymal stem cells: a preliminary study. Tissue Cell. 36, 431-438 (2004).
  19. Xu, Q. R., Dong, Y. H., Chen, S. L., Bao, C. D., Du, H. Degeneration of normal articular cartilage induced by late phase osteoarthritic synovial fluid in beagle dogs. Tissue Cell. 41, 13-22 (2009).
  20. Kruger, J. P., Endres, M., Neumann, K., Haupl, T., Erggelet, C., Kaps, C. Chondrogenic differentiation of human subchondral progenitor cells is impaired by rheumatoid arthritis synovial fluid. J. Orthop. Res. 28, 819-827 (2010).
  21. Steinhagen, J., Bruns, J., Niggemeyer, O. Perfusion culture system: Synovial fibroblasts modulate articular chondrocyte matrix synthesis in vitro. Tissue Cell. 42, 151-157 (2010).
  22. Yang, K. G., Saris, D. B., Verbout, A. J., Creemers, L. B., Dhert, W. J. The effect of synovial fluid from injured knee joints on in vitro chondrogenesis. Tissue Eng. 12, 2957-2964 (2006).
  23. Skoog, V., Widenfalk, B., Ohlsen, L., Wasteson, A. The effect of growth factors and synovial fluid on chondrogenesis in perichondrium. Scand. J. Plast. Reconstr. Surg. Hand. Surg.. 24, 89-95 (1990).
  24. Nuver-Zwart, I., Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. Effects of synovial fluid and synovial fluid cells on chondrocyte metabolism in short term tissue culture. J. Rheumatol. 15, 210-216 (1988).
  25. Beekhuizen, M., Bastiaansen-Jenniskens, Y. M., Koevoet, W. Osteoarthritic synovial tissue inhibits proteoglycan production in human osteoarthritic cartilage; Establishment and characterisation of a long-term coculture. Arthritis Rheum. , (2011).
  26. Rodrigo, J. J., Steadman, J. R., Syftestad, G., Benton, H., Silliman, J. Effects of human knee synovial fluid on chondrogenesis in vitro. Am. J. Knee. Surg. 8, 124-129 (1995).
  27. van den Hoogen, B. M., van de Lest, C. H., van Weeren, P. R. Loading-induced changes in synovial fluid affect cartilage metabolism. Br. J. Rheumatol. 37, 671-676 (1998).
  28. Webb, G. R., Westacott, C. I., Elson, C. J. Osteoarthritic synovial fluid and synovium supernatants up-regulate tumor necrosis factor receptors on human articular chondrocytes. Osteoarthritis Cartilage. 6, 167-176 (1998).
  29. Kook, S. H., Son, Y. O., Lee, K. Y. Hypoxia affects positively the proliferation of bovine satellite cells and their myogenic differentiation through up-regulation of MyoD. Cell. Biol. Int. 32, 871-878 (2008).
  30. Knobloch, T. J., Madhavan, S., Nam, J., Agarwal, S., Agarwal, S. Regulation of chondrocytic gene expression by biomechanical signals. Crit. Rev. Eukaryot. Gene. Expr. 18, 139-150 (2008).
  31. Guo, J. F., Jourdian, G. W., MacCallum, D. K. Culture and growth characteristics of chondrocytes encapsulated in alginate beads. Connect. Tissue. Res. 19, 277-297 (1989).
  32. Toegel, S., Huang, W., Piana, C. Selection of reliable reference genes for qPCR studies on chondroprotective action. BMC. Mol. Biol. 8, 13-13 (2007).
  33. Lin, Z., Fitzgerald, J. B., Xu, J. Gene expression profiles of human chondrocytes during passaged monolayer cultivation. J. Orthop. Res. 26, 1230-1237 (2008).
  34. Goessler, U. R., Bieback, K., Bugert, P. Human chondrocytes differentially express matrix modulators during in vitro expansion for tissue engineering. Int. J. Mol. Med. 16, 509-515 (2005).
  35. Anat, J. 121, 107-118 (1976).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kultura p ynu stawowego3D enkapsulacja w alginianier nicowanie chondrocyt wanaliza macierzy chrz stnejanaliza ekspresji gen wbarwienie histologiczneprzygotowanie p ynu stawowegoutrzymanie integralno ci kulekd ugoterminowa kultura chondrocyt w
System 3D do hodowli ludzkich chondrocytów stawowych w płynie stawowym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.