Demonstrujemy sposób wycinania i hodowli eksplantów zwoju statoakustycznego w dniu E4 oraz rdzenia kręgowego w dniu E6 zarodka kurczaka. Eksplanty są hodowane w warunkach bezsurowiczych w trójwymiarowych żelach kolagenowych przez 24 godziny. Reaktywność neurytów jest badana przy użyciu pożywki uzupełnionej o czynniki wzrostu oraz koralików pokrytych białkiem.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Disekcja i hodowla eksplantów zrazustatoakustycznego i rdzenia kręgowego kurczaka w żelach kolagenowych do testów wzrostu neurytów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Narządy zmysłów wewnętrznego ucha kurczaka są unerwione przez wypustki obwodowe neuronów zwoju statoakustycznego (SAG). Innervacja narządów zmysłów zależy od kombinacji sygnałów kierujących wzrostem aksonów1 oraz czynników przetrwania2, znajdujących się wzdłuż trajektorii rosnących aksonów i/lub w obrębie ich docelowych narządów zmysłów. Na przykład funkcjonalna interferencja z klasyczną ścieżką sygnalizacji kierowania aksonami, semaforyna-neuropilina, spowodowała błędne prowadzenie aksonów słuchowych3. Ponadto, manipulacje w zwierzętach transgenicznych kilkoma czynnikami wzrostu ekspresowanymi w docelowych narządach zmysłów ucha wewnętrznego, w tym neurotrofiną-3 (NT-3) i neurotroficznym czynniku pochodzenia mózgowego (BDNF), również doprowadziły do błędnego prowadzenia aksonów SAG4. Te same cząsteczki promują zarówno przetrwanie, jak i wzrost neurytów neuronów SAG kurczaka in vitro5,6.
W niniejszej pracy opisujemy i prezentujemy metodę in vitro, której obecnie używamy do badania reaktywności neurytów z zwojów szyjnych (SAG) kurczaka na rozpuszczalne białka, w tym znane morfogeny, takie jak białka Wnt, a także czynniki wzrostu istotne dla stymulowania wzrostu neurytów SAG i przeżywalności neuronów. Wykorzystując ten model, pragniemy wyciągnąć wnioski dotyczące wpływu wydzielanych ligandów na przeżywalność neuronów SAG oraz wzrost ich neurytów.
Eksplanty SAG są wycinane w 4. dniu embrionalnym (E4) i hodowane w trójwymiarowych żelach kolagenowych w warunkach bezsurowiczych przez 24 godziny. Najpierw badana jest reaktywność neurytów poprzez hodowlę eksplantów w medium uzupełnionym o białka. Następnie, aby sprawdzić, czy punktowe źródła wydzielanych ligandów mogą wywierać kierunkowy wpływ na wzrost neurytów, eksplanty są hodowane wspólnie z koralikami powlekanymi białkiem, a następnie analizowana jest zdolność koralików do lokalnego promowania lub hamowania wzrostu. Przedstawiamy również demonstrację wycinania (zmodyfikowany protokół7) i hodowli eksplantów rdzenia kręgowego z 6. dnia embrionalnego (E6). Rutynowo wykorzystujemy eksplanty rdzenia kręgowego do potwierdzania bioaktywności białek i koralików nasączonych białkiem oraz do weryfikacji reaktywności krzyżowej gatunkowej z tkanką kurcząt, w tych samych warunkach hodowli, co w przypadku eksplantów SAG. Te testy in vitro są wygodne do szybkiego przesiewania cząsteczek wywierających efekty troficzne (przeżycie) lub tropiczne (kierunkowe) na neurony SAG, zwłaszcza przed przeprowadzeniem badań in vivo. Co więcej, metoda ta pozwala na testowanie pojedynczych cząsteczek w warunkach bezsurowiczych, przy wysokiej przeżywalności neuronów8.
Protokół
Przepisy
Pierścienie dla kurcząt
| 7,2 g | NaCl |
| 0,23 g | CaCl2 + 2H2O |
| 0,37 g | KCl |
| 0,115 g | Na2HPO4 |
| 900 ml | Woda (do hodowli tkankowych) |
Uwaga: Dostosować pH do 7,4. Uzupełnić objętość końcową do 1000 ml wodą.
10X PBS
| 40 g | NaCl |
| 1 g | KCl |
| 7 g | Na2HPO4 |
| 1.2 g | KH2PO4 |
| 450 ml | woda z DEPC |
Uwaga: Dostosować pH do 7.4. Uzupełnić objętość końcową do 500 ml wodą. Stężenie robocze (1X) przygotowuje się poprzez rozcieńczenie 1 części zapasu 10X z 9 częściami wody jakości hodowli tkankowej, np. uzyskanej za pomocą systemu naświetlania UV Millipore w celu otrzymania wody o przewodności 18 MΩ-cm.
Pożywka do utrzymywania eksplantów SAG
- DMEM/F12 z L-glutaminą, 10 mM Hepes
- 10% Insulin, Transferring, Selenium (ITS+1)
- 1% pen-strep
Pożywka do hodowli eksplantów
- Pożywka do utrzymania eksplantów SAG
- 10 ng/ml neurotrofiny-3 (NT-3)
- 10 ng/ml czynnika neurotroficznego rzęsnego (CNTF)
Disekcja rdzenia kręgowego i medium stabilizujące
- L-15
- 10% płatkowej surowicy bydlęcej
- 1% pen-strep
Inkubować jaja w temperaturze 37-38°C. Sterylizować narzędzia sekcyjne oraz szalkę sekcyjną Sylgard w 70% etanolu. Szalki sekcyjne i narzędzia można również sterylizować promieniami UV przez noc.
1. Przygotowanie kulek
- Umieścić kuleczki w mikroprobowce z 1 ml sterylnego PBS, wymieszać i odczekać, aż kuleczki opadną na dno probówki.
- Przemyć kuleczki kilkakrotnie, usuwając nadsącz po opadnięciu kuleczek i resuspendując je w PBS.
- Inkubować kuleczki w oczyszczonym białku (rozcieńczonym w PBS) lub samym PBS (kontrola) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
- Opłukać kuleczki w PBS i przechowywać w płytce 24-dołkowej z 1 ml PBS do momentu umieszczenia w kolagenie.
2. Disekcja zwoju słuchowo-równoważnego
- W dniu E4 wyjmij zarodek z jaja i umieść go w naczyniu z roztworem Ringera dla kurcząt, aby usunąć błony zarodkowe.
- Umieść zarodek w wyłożonej Sylgard© płytce Petriego wypełnionej zimnym HBSS i ułóż go na boku tak, aby pęcherzyk słuchowy był skierowany ku górze. Przypnij zarodek do płytki za pomocą szpilek sekcyjnych.
- Używając dwóch szpilek sekcyjnych, wykonaj poziome cięcie skóry bezpośrednio brzusznie od kieszonek kanałowych, mniej więcej w miejscu ich połączenia z przewodem ślimakowym. Wykonaj cięcia pionowe przed i za SAG. Za pomocą pęsety lub szpilki sekcyjnej podnieś i usuń płat skóry ograniczony trzema cięciami.
Uwaga: SAG znajduje się na przednio-brzusznej krawędzi otocysty, mniej więcej w połowie drogi między widoczną przy oświetleniu w polu jasnym kieszonką grzbietową a brzusznie położonym przewodem ślimakowym, który wystaje w kierunku brzuszno-środkowym i jest przesłonięty łukami gardzielowymi. Przewód ślimakowy wydłuża się, więc jego wymiar grzbietowo-brzuszny będzie stopniowo zwiększał się w dniu E4 między etapami 23-25 według Hamburgera-Hamiltona 9. - Odciągnij otocystę w kierunku tylnym, aby oddzielić ją od SAG. Odsuń tkanki otaczające SAG za pomocą szpilek sekcyjnych i ostrożnie wyjmij SAG z zarodka, używając pęsety nr 55. Usuń z SAG duże fragmenty tkanki mezenchymalnej oraz wystające pęczki nerwowe.
- Używając końcówki do pipety o szerokim wlocie, przenieś eksplant do płytki 24-dołkowej z 0,5 ml pożywki podtrzymującej eksplanty SAG. Przechowuj eksplanty na lodzie lub w temperaturze pokojowej przez maksymalnie 4 godziny.
3. Disekcja rdzenia kręgowego
- Wyjąć zarodek E6 z jaja i umieścić go w naczyniu zawierającym roztwór Ringera dla kurcząt. Usunąć głowę oraz błony embrionalne.
- Umieścić tułów w szalku sekcyjnym Sylgard© zawierającym zimne medium do sekcji rdzenia kręgowego. Upozycjonować i przypiąć zarodek stroną brzuszną do dołu, z końcem ogonowym skierowanym w stronę eksperymentatora. Wbić piny sekcyjne w każdą kończynę oraz w koniec przedni.
- Używając pincety i/lub pinów sekcyjnych, ostrożnie usunąć skórę i tkanki, przesuwając się w kierunku brzusznym, aż do momentu uwidocznienia powierzchni grzbietowej rdzenia kręgowego.
- Naciąć linię środkową grzbietową rdzenia kręgowego pinem sekcyjnym, kierując się od strony tylnej do przedniej, wzdłuż całej długości rdzenia kręgowego. Pozwoli to na rozchylenie rdzenia kręgowego „jak książkę” poprzez rozdzielenie jego strony lewej i prawej.
- Usunąć bocznie otaczające tkanki, aby wyizolować rdzeń kręgowy i odsłonić zwoje korzeni grzbietowych (DRG). Usunąć DRG i opony mózgowo-rdzeniowe, pocierając pinem sekcyjnym lub pincetą pomiędzy rdzeniem kręgowym a DRG.
- Wyjąć rdzeń kręgowy z organizmu, chwytając pincetą najbardziej tylny koniec rdzenia i podnosząc go w górę i w kierunku przeciwnym do eksperymentatora. Usunąć pozostałe DRG i opony.
- Przytrzymać jeden koniec rdzenia kręgowego pincetą (lub przypiąć go do szalka) i za pomocą nożyczek Vannasa naciąć linię środkową brzuszną, aby podzielić rdzeń kręgowy na dwie połowy.
- Przytrzymać jeden koniec eksplantu pincetą w celu unieruchomienia tkanki i za pomocą nożyczek Vannasa wyciąć małe eksplanty (o długości 100-500 um) wzdłuż tkanki. Płytę dna można rozpoznać jako wyraźne pogrubienie tkanki wzdłuż jednej krawędzi eksplantu.
- Użyć szerokiego końcówki pipety, aby przenieść eksplanty do płytki 24-dołkowej zawierającej 0,5 ml zimnego medium do sekcji. Przechowywać eksplanty na lodzie w celu utrzymania żywotności tkanki przez maksymalnie 4 godziny.
4. Hodowla eksplantów z oczyszczonymi białkami w celu przetestowania reaktywności neurytów
- Przygotować roztwór kolagenu o stężeniu 1,5 mg/ml w 15 ml probówce stożkowej, w warunkach chłodzenia (na lodzie), zgodnie z instrukcjami producenta.
- Zweryfikować, czy roztwór kolagenu ma pH w zakresie 7-7,4, używając papierka wskaźnikowego pH. Skorygować pH, dodając NaOH w objętościach 1 μl.
- Przenieść eksplanty do płytki 24-dołkowej, używając szerokiego końcówki do pipety, a następnie odessać nadmiar cieczy. W jednym dołku można hodować wiele eksplantów, jednak powinny one być umieszczone w odległości co najmniej 500 μm od siebie.
- Dodać 0,5 ml kolagenu do dołka zawierającego eksplant. Umieścić eksplant na dnie dołka. Należy upewnić się, że każda hodowla całkowicie zastygła przed przejściem do kolejnego dołka, ponieważ kolagen zacznie polimeryzować w temperaturze pokojowej.
- Umieścić płytkę hodowlaną na podgrzewaczu do szkiełek w temperaturze 37°C na 30-45 min w celu polimeryzacji kolagenu. Po polimeryzacji kolagen będzie przypominał żel.
- Dodać 0,5 ml ciepłej pożywki do hodowli eksplantów uzupełnionej o oczyszczone białka (rozcieńczone w PBS) lub PBS (kontrola) i inkubować w temperaturze 37°C, przy 5% CO2. Efekty w zakresie wzrostu neurytów powinny być widoczne w ciągu 24 godzin.
UWAGA: Ten sam protokół zastosowano do hodowli eksplantów SAG przez okres do 42 godzin.
5. Kokultura eksplantów z kuletkami pokrytymi białkiem w celu zbadania kierunkowego wzrostu neurytów
- Rozpocząć od kroków 4.1-4.4 hodowli eksplantów.
- Za pomocą pipety przenieść 1-5 kulek z PBS do studzienki zawierającej roztwór kolagenu i eksplant.
- Używając pęsety, umieścić kulki w odległości 50-500 μm od krawędzi eksplantu.
- Umieścić płytkę na podgrzewaczu do szkiełek w temperaturze 37°C na 30-45 min w celu polimeryzacji kolagenu. W miarę polimeryzacji kolagenu tkanka lub kulki mogą zostać przesunięte. Należy sprawdzić hodowle i ponownie ustawić tkankę oraz kulki w ciągu pierwszych 5 min.
- Do każdej studzienki dodać 0,5 ml pożywki SAG i inkubować przez 24 godziny.
6. Wizualizacja wzrostu neurytów za pomocą immunohistochemii
- Przepłukać hodowle w PBS i utrwalić przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w 4% paraformaldehydzie w PBS.
- Odczepić żele od ścianek studzienek, prowadząc zaokrąglony koniec teflonowej mikroszpatułki wzdłuż krawędzi żeli. Immunobarwienie przeprowadzić z żelami pozostającymi w studzienkach. Kilkukrotnie przepłukać w PBS.
- Inkubować w 0,5 ml roztworu blokującego (10% surowicy cielęcej, 0,1% Triton X-100, 0,1% azotku sodu w PBS) przez noc w temperaturze 4°C.
- Inkubować w 0,5 ml przeciwciała pierwszorzędowego (przeciwciało anty-β-Tubulin rozcieńczone 1:500 w roztworze blokującym) przez noc w temperaturze 4°C.
- Kilkukrotnie przepłukać w PBS. Inkubować w 0,5 ml przeciwciała wtórnego (przeciwciało Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG2b rozcieńczone 1:500) przez noc w temperaturze 4°C. Od tego etapu płytki przechowywać w ciemności lub zawinąć w folię ze względu na światłoczułość przeciwciał wtórnych.
- Kilkukrotnie przepłukać w PBS i przechowywać w 4°C w PBS przez maksymalnie jeden tydzień.
7. Reprezentatywne wyniki
Rycina 1. Reprezentatywne wyniki działania promocyjnego na neurity oczyszczonego NT-3 oraz kulek pokrytych NT-3 w eksplantach SAG zarodków kurzych E4. Ciała komórkowe neuronów SAG i neuryty barwiono immunocytochemicznie przeciwciałem przeciwko β-Tubulinie i obrazowano za pomocą obiektywu 10x pod mikroskopem konfokalnym. Po 24 godzinach in vitro eksplanty SAG wykazały większy wzrost neurytów w obecności 100 ng/ml oczyszczonego ludzkiego NT-3 dodanego do pożywki hodowlanej (1B) w porównaniu z grupami kontrolnymi (1A). Neurony SAG współhodowano z kulkami nasączonymi 100 ng/ml NT-3, aby wykazać, że punktowe źródło NT-3 może lokalnie promować wzrost neurytów. Eksplanty wykazały dłuższy i gęstszy wzrost neurytów po stronie skierowanej w stronę kulki w porównaniu ze stroną przeciwległą (1D) oraz w porównaniu z kulturami kontrolnymi z kulkami nasączonymi PBS (1C). Pasek skali = 200 μm.
Rysunek 2. Reprezentatywne wyniki efektów promujących wzrost neurytów przez oczyszczony Wnt5a oraz koraliki powlekane Wnt5a w rdzeniu kręgowym zarodka kurczego E6. Eksplanty rdzenia kręgowego poddano immunobarwieniu przeciwko β-Tubulinie i obrazowano za pomocą mikroskopu konfokalnego. Po 24 godzinach wzrostu w obecności oczyszczonego mysiego Wnt5a (400ng/ml) zaobserwowano zwiększony wzrost neurytów z eksplantów rdzenia kręgowego kurczaka (2B) w porównaniu z kontrolami hodowanymi bez Wnt5a (2A). Koraliki namoczone w 500 ng/ml Wnt5a, umieszczone 300-500 μm od krawędzi eksplantów rdzenia kręgowego, również promowały wzrost neurytów (2D) w porównaniu z kulturami kontrolnymi (2C). Podobne wyniki kokultur opublikowano wcześniej w przypadku komórek wykazujących ekspresję Wnt5a8. Pasek skali = 200 μm.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiamy metodę wyizolowania i hodowli eksplantów z zwojów SAG (zwoje zwojowe tylne) w stadium E4 oraz rdzenia kręgowego w stadium E6 zarodka kury w warunkach bezsurowiczych. Procedura ta jest obecnie stosowana w naszym laboratorium do badania wpływu różnych wydzielanych ligandów na przeżywalność neuronów SAG oraz wzrost neurytów. Nowatorskie aspekty tego protokołu obejmują zastosowanie systemu bezsurowiczego do hodowli eksplantów oraz wykorzystanie kulek nasączonych czynnikami wzrostu w celu zbadania ich wpływu na ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była finansowana z grantu National Institutes of Health RO1DC002756 oraz przez Purdue Research Foundation. Dziękujemy Doris Wu i Wiese Chang za porady dotyczące eksperymentów oraz Rodney McPhail za pomoc w przygotowaniu rycin.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Stereomikroskop | Używamy stereomikroskopu Leica M80 z dolnym oświetleniem w polu jasnym. | ||
| podgrzewacz do szkiełek przedmiotowych | C.S. E. | Polimeryzacja kolagenu | |
| Inkubator do jaj kurzych | |||
| 37°C/5% CO22 inkubator do hodowli komórkowych z nawilżaniem | |||
| Sylgard© powlekana płytka Petriego | |||
| płytka do hodowli komórkowej z 24 dołkami | Corning | 3526 | |
| #5 Pincety Dumont | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| #55 Pinceta Dumonta | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Szpilki sekcyjne ze stali nierdzewnej | Fine Science Tools | 26002-10 | Przytwierdzanie zarodka szpilkami, precyzyjna sekcja |
| łyżka perforowana Moria | Fine Science Tools | 10370-17 | Pozyskiwanie/transfer embrionów |
| 200 μszerokie końcówki do pipet o pojemności 1 ml | Dot Scientific, Inc. | 118-96R | Przeszczepianie eksplantatów |
| jaja kurze E4 i E6 | |||
| roztwór Ringera dla kurcząt’roztwór s | Pozyskiwanie zarodków | ||
| HBSS | Sigma-Aldrich | H8264 | disekcja SAG |
| pożywka L15 | Sigma-Aldrich | L5520 | Medium do sekcji rdzenia kręgowego |
| Płodowa surowica cielęca | Atlanta Biologicals | S11150 | Medium do sekcji rdzenia kręgowego |
| Nożyczki Vannasa | World Precision Instruments, Inc. | 501778 | Disekcja rdzenia kręgowego |
| Kolagen typu I z ogona szczura | BD Biosciences | 354249 | Hodowla eksplantów |
| 10X PBS (sterylny) | Aby zneutralizować kolagen | ||
| 1N NaOH (sterylny) | Aby zneutralizować kolagen | ||
| Woda destylowana (sterylna) | Aby zneutralizować kolagen | ||
| paski wskaźnikowe pH (6,0-8,1) | Whatman, GE Healthcare | 2629-990 | Aby sprawdzić pH kolagenu |
| probówki stożkowate 15 ml | Dot Scientific, Inc. | 818-PG | |
| 500 μszerokie końcówki do pipet l | Dot Scientific, Inc. | 119-R100 | Pipetowanie kolagenu |
| pożywka DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D8437 | Eksplant pożywka hodowlana |
| ITS+1 | Sigma-Aldrich | I2521 | Suplement pożywki |
| Penicylina-streptomycyna | Invitrogen | 15140-122 | dodatek do pożywki |
| CNTF (szczur) | Sigma-Aldrich | C3835 | suplement do pożywki |
| NT-3 (ludzki) | Sigma-Aldrich | N1905 | Suplement pożywki |
| Oczyszczone białko Wnt5a mysie | R&R&D Systems | 645-WN-010 | |
| Kuleczki żelu Affi-gel Blue | Bio-Rad | 153-7302 | |
| Paraformaldehyd | Sigma-Aldrich | P6148 | Fiksacja |
| PBS | Płukania | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | roztwór blokujący |
| Azydek sodu | Sigma-Aldrich | S8032 | Roztwór blokujący |
| surowica cielęca | Invitrogen | 16170-078 | Roztwór blokujący |
| mysi monoklonalny IgG2b anty-β przeciwciało przeciwko tubulinie 1+II | Sigma-Aldrich | T8535 | Etykiety: ciała komórek i neuryty |
| przeciwciało kozie anty- Alexa Fluor 488–mysia IgG2b przeciwciało | Invitrogen | A21141 | Wykrywa β Przeciwciało przeciwko tubulinie |
| teflonowa mikroszpatułka | VWR International | 57949-033 | Wyjmowanie żeli kolagenowych z dołków |
Bibliografia
- Fekete, D. M., Campero, A. M. Axon guidance in the inner ear. Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 549-549 (2007).
- Fritzsch, B. Development of inner ear afferent connections: forming primary neurons and connecting them to the developing sensory epithelia. Brain Res. Bull. 60 (5-6), 423-423 (2003).
- Gu, C. Neuropilin-1 conveys semaphorin and VEGF signaling during neural and cardiovascular development. Dev. Cell. 5 (1), 45-45 (2003).
- Tessarollo, L., Coppola, V., Fritzsch, B. NT-3 replacement with brain-derived neurotrophic factor redirects vestibular nerve fibers to the cochlea. J. Neurosci. 24 (10), 2575-2575 (2004).
- Avila, M. A. Brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 support the survival and neuritogenesis response of developing cochleovestibular ganglion neurons. Dev. Biol. 159 (1), 266-266 (1993).
- Bianchi, L. M., Cohan, C. S. Effects of the neurotrophins and CNTF on developing statoacoustic neurons: comparison with an otocyst-derived factor. Dev. Biol. 159 (1), 353-353 (1993).
- Juurlink, B. ernhardH. J. Chick Spinal Somatic Motoneurons in Culture. Protocols for Neural Cell Culture.. 59, (2001).
- Fantetti, K. N., Zou, Y., Fekete, D. M. Wnts and Wnt inhibitors do not influence axon outgrowth from chicken statoacoustic ganglion neurons. Hear. Res. , (2011).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-49 (1951).
- Bourikas, D. Sonic hedgehog guides commissural axons along the longitudinal axis of the spinal cord. Nat. Neurosci. 8 (3), 297-297 (2005).
- Charron, F., Tessier-Lavigne, M. Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance. Development. 132 (10), 2251-2251 (2005).
- Augsburger, A. BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons. Neuron. 24 (1), 127-127 (1999).
- Lyuksyutova, A. I. Anterior-posterior guidance of commissural axons by Wnt-frizzled signaling. Science. 302 (5652), 1984-1984 (2003).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
