Powtarzalne zmiażdżenie nerwu kulszowego myszy i późniejsza ocena regeneracji za pomocą analizy całego mięśnia wierzchowca

Podsumowanie

W tym raporcie opisujemy metodę na zmiażdżenie nerwu kulszowego myszy. Ta metoda wykorzystuje łatwo dostępne kleszcze hemostatyczne i łatwo i powtarzalnie powoduje całkowite zmiażdżenie nerwu kulszowego. Ponadto opisano metodę przygotowania całych wierzchowców mięśniowych nadających się do analizy regeneracji nerwów po zmiażdżeniu nerwu kulszowego.

Streszczenie

Regeneracja w obwodowym układzie nerwowym (PNS) jest szeroko badana zarówno pod kątem jej znaczenia dla chorób ludzkich, jak i w celu zrozumienia silnej reakcji regeneracyjnej neuronów PNS, co może rzucić światło na niepowodzenia regeneracji OUN¹. Zmiażdżenie nerwu kulszowego (aksonotmeza) jest jednym z najczęstszych modeli uszkodzenia nerwów obwodowych u gryzoni². Zgniatanie przerywa wszystkie aksony, ale blaszki podstawne komórek Schwanna są zachowane, dzięki czemu regeneracja jest optymalna^3,4. Pozwala to badaczowi na dokładne zbadanie zdolności rosnącego aksonu do interakcji zarówno z komórką Schwanna, jak i blaszkami podstawnymi⁴. Szczury były na ogół preferowanymi modelami zwierzęcymi do eksperymentalnego miażdżenia nerwów. Są one powszechnie dostępne, a ich uszkodzony nerw kulszowy zapewnia rozsądne przybliżenie zmian w nerwach u ludzi^5,4. Chociaż nerw myszy jest mniejszy niż nerw szczura, ma wiele podobnych cech. Co jednak najważniejsze, modele mysie są coraz cenniejsze ze względu na szeroką dostępność linii transgenicznych, które pozwalają teraz na szczegółową sekcję poszczególnych cząsteczek krytycznych dla regeneracji nerwów^{6, 7}. Wcześniejsi badacze stosowali wiele metod w celu wywołania zmiażdżenia lub urazu nerwu, w tym proste kleszcze kątowe, kleszcze chłodzone, kleszcze hemostatyczne, zaciski naczyniowe i zaciski zaprojektowane przez badaczy^8,9,10,11,12. Badacze zastosowali również różne metody oznaczania miejsca urazu, w tym szwy, cząstki węgla i koraliki fluorescencyjne^13,14,1. Opisujemy naszą metodę uzyskania powtarzalnego całkowitego zmiażdżenia nerwu kulszowego z dokładnym i trwałym oznaczaniem miejsca zgniecenia za pomocą drobnych kleszczy hemostatycznych, a następnie znakowaniem miejsca zgniecenia węglem. W ramach naszego opisu procedury zmiażdżenia nerwu kulszowego uwzględniliśmy również stosunkowo prostą metodę montażu całych mięśni, której używamy do późniejszego ilościowego określenia regeneracji.

Protokół

1. Tematy zwierząt

1.1. Leczenie

1. Wszystkie zabiegi na zwierzętach powinny być wykonywane za zgodą Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Etyki lokalnej instytucji oraz zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Użytkowania i Narodowego Instytutu Zdrowia, z podjętymi środkami w celu zminimalizowania bólu i dyskomfortu.
2. Nasze myszy trzymano w warunkach kontrolowanej temperatury w 12-godzinnym odwróconym cyklu światła i ciemności, karmiąc je karmą i wodą ad libitum.
3. W przypadku badań nad regeneracją dorosłych myszy powinny mieć co najmniej 6 tygodni, kiedy wykonuje się zmiażdżenie nerwu kulszowego. Ten wiek wykracza poza czas, w którym odbywa się przycinanie wielonerwowych połączeń nerwowo-mięśniowych.
4. W tych eksperymentach użyliśmy 6-8 tygodniowych myszy C57BL/6 pozyskanych z Charles River. Porównując regenerację po zmiażdżeniu nerwu kulszowego (tj. tempo wzrostu aksonów), szczepy myszy powinny być takie same, ponieważ zauważono różnice w regeneracji aksonów między różnymi szczepami wsobnymi^15,16. Jeśli mają być wykorzystane myszy zmodyfikowane genetycznie, kontrola rodzeństwa z miotu jest najbardziej odpowiednia.

1.2. Przygotowanie chirurgiczne

1. Zwierzęta są głęboko znieczulone do operacji przy użyciu koktajlu ketaminy (100 mg / kg) i ksylazyny (10 mg / kg) we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Każde zwierzę otrzymuje również podskórne wstrzyknięcie meloksykamu (10 mg/kg) w celu zminimalizowania bólu pooperacyjnego.
2. Obie kończyny tylne są starannie golone za pomocą maszynki do strzyżenia chirurgicznego (Roboz, RC-5903), a depilację kończy się kremem do depilacji Nair (znalezionym w lokalnej aptece).
3. Skórę oczyszcza się za pomocą sterylnych aplikatorów z bawełnianą końcówką i peelingu chirurgicznego betadyny (Fisher Scientific, 19066452).
4. Maść okulistyczną (Fisher Scientific, 19082795) nakłada się na oczy za pomocą sterylnych aplikatorów z bawełnianą końcówką.
5. Mysz umieszcza się na czystej płycie ze stali nierdzewnej, pod którą umieszczono wstępnie podgrzany homeotermiczny system (Harvard Apparatus, 507222F). Temperatura zwierząt jest utrzymywana na poziomie 37°C.
6. Wszystkie kończyny są przyklejone taśmą, przy czym należy zwrócić uwagę na symetryczne ustawienie kończyn tylnych tak, aby staw kolanowy tworzył kąt prosty z ciałem (ryc. 1, panel A).
7. Pole operacyjne pokryte jest sterylnym obłożeniem. Wszystkie narzędzia są sterylizowane w autoklawie lub sterylizacji gorącymi kulkami (Fine Science Tools, 18000-45), a chirurg nosi maskę, fartuch i sterylne rękawiczki.

2. Powtarzalne zmiażdżenie nerwu kulszowego

1. Po przygotowaniu w skórze wykonuje się półkoliste nacięcie w poprzek linii środkowej (ryc. 1). Skóra jest delikatnie oddzielana od leżących pod nią mięśni i składana, aby nie przeszkadzała podczas zabiegu. Jest utrzymywany w stanie wilgotnym za pomocą aplikacji 0,1 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej (Hospira, 0409-4888-20) podczas zabiegu.
2. Otwarcie płaszczyzny powięziowej między pośladkiem wielkim a przednią głową mięśnia dwugłowego uda odsłania nerw kulszowy (ryc. 1, panel A). W celu kontroli chirurgicznej przeciwległy nerw kulszowy powinien być odsłonięty i zmobilizowany, ale pozostawiony w stanie nienaruszonym. Mięśnie pośladkowe są następnie ponownie przeciwstawiane i zszywane za pomocą plecionych jedwabnych, niewchłanialnych szwów 6-0 (Roboz, SUT-1073-11).
3. Eksperymentalny nerw kulszowy jest następnie odsłaniany w ten sam sposób, z retraktorami na miejscu, aby ułatwić wizualizację (ryc. 1, panel B). Retraktory są sterylizowane przed użyciem.
   Uwaga: chociaż systemy zwijaczy są dostępne na rynku, często są dość drogie. Udało nam się stworzyć zadowalający system zwijaczy przy użyciu niedrogich materiałów eksploatacyjnych i szpilek do owadów (patrz sekcja Materiały).
4. Nerw kulszowy jest następnie delikatnie uwalniany z otaczającej tkanki łącznej za pomocą nożyczek do irydektomii.
5. Za pomocą cienkich kleszczy 5/45 (Fine Science Tools, 11251-35) nerw umieszcza się na dolnej szczęce bardzo cienkich kleszczy hemostatycznych (Fine Science Tools, 13020-12). Trzy pęczki są ustawione sekwencyjnie, a nie jeden na drugim (ryc. 1, wstawka B). Kleszcze hemostatyczne zostały wygrawerowane ze znakiem w odległości 1,5 mm od ich końcówki. Najbardziej zewnętrzna część rwy kulszowej jest umieszczona w jednej linii z tym znakiem przed zmiażdżeniem. Zapewnia to zgniatanie o jednolitej szerokości i to, że nerw nie wystaje poza szczęki kleszczy hemostatycznych, gdy jest spłaszczony pod wpływem siły zgniatania. Jeśli nerw wystaje poza końcówkę kleszczy, nerw zostanie tylko częściowo zmiażdżony.
6. Zgniatanie jest prostopadłe do nerwu w odległości 45 mm od trzeciego palca, mierzone za pomocą nici, która przybliża ścieżkę nerwu kulszowego. Nerw jest miażdżony raz przez 15 sekund za pomocą 3 kliknięć kleszczy hemostatycznych. Należy uważać, aby nie rozciągać nerwu. Kiedy hemostatyki zostaną ponownie otwarte, cały nerw powinien być półprzezroczysty w miejscu zgniecenia.
7. Druga para kleszczy hemostatycznych (identyczna z pierwszą), która została wstępnie zanurzona w sproszkowanym węglu (Fisher Scientific, C272-500) służy do oznaczania miejsca zgniecenia. Nerw jest miażdżony w tym samym miejscu zgniatania przez 15 sekund za pomocą 3 kliknięć. Żadne oznakowanie węglowe nie powinno wykraczać poza granicę początkowego zgniecenia. Jest to szczególnie ważne, gdy wymagane jest precyzyjne oznaczenie miejsca zgniatania. Przed użyciem proszek węglowy jest sterylizowany przez wystawienie na działanie światła UV przez dwie godziny, a następnie jest przetwarzany przy użyciu sterylnej techniki.
   1. Aby wstępnie zanurzyć kleszcze w węglu, ale wykluczyć rozprzestrzenianie się węgla w miejscu operacji, kleszcze są otwierane w sproszkowanym węglu, a następnie delikatnie zamykane (ale nie klikane) zamykane, a węgiel na zewnątrz hemostatów jest wycierany za pomocą sterylnej gazy. Kleszcze są sprawdzane pod co najmniej 3-krotnym powiększeniem, aby sprawdzić, czy powierzchnie kruszenia są równomiernie pokryte sproszkowanym węglem. W razie potrzeby są ponownie zanurzane i wycierane.
8. Muskulatura pośladkowa jest ponownie przeciwstawiona i zszyta w taki sam sposób, jak strona przeciwległa.
9. Na koniec nacięcie skóry zamyka się za pomocą klipsów refleksyjnych o średnicy 9 mm (World Precision Instruments, 500346; Zgłaszający: 500345). Jeśli okaże się, że klipsy refleksyjne 9 mm ograniczają ruch, zamiast nich można użyć mniejszych klipsów refleksyjnych lub szwów 6-0 (Roboz, SUT-1073-11).

3. Opieka pooperacyjna

1. Po zabiegu zwierzęta umieszcza się na poduszce grzewczej w temperaturze 37°C, aż pojawią się oznaki ruchu.
2. Następnie są przenoszone z powrotem do swojej domowej klatki, gdzie woda i jedzenie są łatwo dostępne na podłodze w postaci hydrożelu i zwilżonego jedzenia.

4. Półcienkie przygotowanie

1. Po przedawkowaniu pentobarbitalu (300 mg/kg) mięśnie nóg są usuwane w celu odsłonięcia nerwu kulszowego*. Gdy nerw pozostaje in situ, ćwierćtuszę tylną zanurza się w 2% paraformaldehydu i 2% aldehydu gluterowego w 0,1 M buforze fosforanowym na lodzie na 30 minut.
   *W przypadku przygotowania całych mięśni górskich, mięśnie są pobierane przed odsłonięciem nerwu kulszowego.
2. Nerw jest ostrożnie usuwany, z zachowaniem ostrożności, aby obchodzić się tylko z bliższym końcem. Następnie nerw jest mocowany w tym samym utrwalaczu przez trzy dodatkowe godziny.
3. Po utrwaleniu nerw przepłukuje się trzykrotnie w 0,1 M buforze fosforanowym.
4. Nerw zanurza się w 2% tetratlenku osmu w 0,1 M buforze fosforanowym na jedną godzinę.
5. Nerw jest następnie odwadniany przez sekwencyjne zanurzanie w coraz bardziej stężonym etanolu (50%, 70%, 80%, 95%, 100%, 100%, 100%). Każde zanurzenie trwa 15 minut.
6. Odwodniony nerw inkubuje się dwukrotnie w tlenku propylenu przez trzy minuty każdy.
7. Następnie nerw zanurza się w mieszaninie tlenku propylenu w stosunku 1:1 i Embed 812 na co najmniej 6 godzin (zwykle przez noc).
8. Następnie nerw zanurza się w mieszaninie tlenku propylenu w proporcji 2:1 i Embed 812 na noc.
9. Na koniec nerw zanurza się w czystym Embed 812 na sześć godzin, a następnie osadza w odpowiedniej formie i piecze w temperaturze 60°C przez 48 godzin.
10. Wycinki o wielkości 1,0 μm wycina się z dystalnego pnia nerwu w określonej odległości od miejsca zgniecenia za pomocą ultramikrotomu Ultracut UCT (Leica) ze szklanym nożem i barwi błękitem toluidyny. Cienkie skrawki mogą być również wytwarzane do badania ultrastruktury za pomocą mikroskopii elektronowej.

5. Przygotowanie całego wierzchowca

1. Najpierw myszy są uśmiercane za pomocą przedawkowania pentobarbitalu (300 mg/kg), a tylne kończyny są usuwane na kolanach.
2. Do analizy usuwa się cztery mięśnie kończyny tylnej: piszczelowy przedni (TA), prostownik palca długiego (EDL), płaszczkowaty i mięsień strzałkowy długi.
3. Wszystkie mięśnie są usuwane poprzez staranną sekcję i przypinane przez ich tkankę łączną do naczynia pokrytego czarną sylgardą (Fisher Scientific, NC9492579). Są one płukane w PBS, a następnie utrwalane w 4% paraformaldehydzie przez 30 minut.
4. TA jest następnie płukany w PBS, zatopiony w O.C.T (Fisher Scientific, 14-373-65) i szybko zamrażany w kąpieli acetonu i suchego lodu.
   1. Jest przechowywany w temperaturze -80 °C w celu cienkiego cięcia na wypadek, gdyby nie powiodło się całe przygotowanie montażu. Ogólnie rzecz biorąc, TA jest zbyt gruba dla odpowiednich całych mocowań.
5. EDL, płaszczkowaty i strzałkowy długi płucze się przez 3 x 10 minut w PBS, umieszcza w 0,1 M glicynie* (Fisher Scientific, AC12007-0010; rozcieńczony w PBS) przez 30 minut i ponownie płuka 3 x 10 minut w PBS. Następnie schładza się je w lodowatym 100% metanolu dokładnie przez 5 minut w temperaturze -20°C, spłukuje 3 x 10 minut w PBS i kąpie w fluorescencyjnie sprzężonej alfa-bungarotoksynie (rozcieńczonej w stosunku 1:200 w PBS) przez 30 minut. Mięśnie są płukane przez 3 x 10 minut w PBS, a następnie 1-godzinny blok w 2 % BSA (KPL, 50-61-00) i 0,2 % Triton X-100 (Dot Scientific Incorporated, 9002-93-1) w PBS*, a następnie inkubowane przez noc w temperaturze 4 °C w koktajlu przeciwciał pierwszorzędowych rozcieńczonych w tym samym bloku 2% BSA/0,2% Triton.
   *Glicyna i roztwory blokujące są wytwarzane tego samego dnia co pobieranie mięśni i mieszane przez 30-60 minut w temperaturze pokojowej przed użyciem.
   1. Do oznaczania aksonów i synaps nerwowo-mięśniowych używamy kombinacji mysiego monoklonalnego markera neurofilamentu (Covance, SMI-312R; rozcieńczony 1:1000), mysiego monoklonalnego markera pęcherzyków synaptycznych (SV2 DSHB, rozcieńczony 1:1000) i sprzężonej z rodaminą alfa-bungarotoksyny (Sigma-Aldrich, rozcieńczony 1:200). Do oznaczania reaktywnych komórek Schwanna używamy króliczego anty-GAP-43 (Novus Biologicals, NB300-143, rozcieńczony 1/500). Przeciwciała pierwszorzędowe są wizualizowane za pomocą specyficznego dla podtypu IgG1 skoniugowanego z fluoresceiną koziego przeciwciała przeciw myszy i sprzężonego z koniugacją DyLight 649 przeciwko królikowi osła (Jackson ImmunoResearch, rozcieńczony 1:200).
6. Następnego dnia mięśnie przepłukuje się w PBS przez 3 x 10 minut, a następnie inkubuje w przeciwciałach drugorzędowych rozcieńczonych w stosunku 1:200 (w 2% BSA/0,2% roztworze blokującym Triton). Następnie spłukuje się je 2 x 10 minut w PBS, a następnie zanurza się w DAPI (Invitrogen, D3571; rozcieńcza do 300 nM w wodzie dejonizowanej) i kolejne 10-minutowe płukanie w PBS.
7. Każdy mięsień jest następnie preparowany na czarnej szalce Petriego pokrytej sylgardem (Fisher Scientific, NC9492579). Początkowo ścięgna są usuwane w punktach przyczepu do mięśnia, a następnie mięśnie są rozrzedzane poprzez odklejanie wewnętrznych włókien mięśniowych (ryc. 3, panele A-C). Należy zwrócić uwagę na zachowanie zewnętrznej powierzchni mięśnia, w tym pasm płytki końcowej (ryc. 3, panele D-F). Powstałe w ten sposób mięśnie są montowane na szkiełkach podstawowych (Fisher Scientific, 12-550-15) z osłoną vectashield (Vector Laboratories, H-1000) oraz szklanych szkiełkach nakrywkowych o wymiarach 22 x 40 mm (Fisher Scientific, 12-548-5C) uszczelnionych z dwóch stron przezroczystym lakierem do paznokci. Po prawidłowym zamontowaniu na suwaku opaska płyty końcowej styka się ze szkiełkiem nakrywkowym.

6. Pomiar regeneracji

1. Regenerację można oszacować we wszystkich trzech mięśniach (mięśniu strzałkowym, EDL i płaszczkowatym). Często badamy regenerację czternaście dni po zmiażdżeniu nerwów, w czasie, w którym znaczny odsetek NMJ jest ponownie unerwiony. Odpowiednie są również zarówno wcześniejsze, jak i późniejsze punkty czasowe, w zależności od zadanego pytania naukowego. W każdym mięśniu bada się ponowne unerwienie całego pasma płytki końcowej. Oceniane są tylko NMJ na powierzchni powierzchniowej. W ten sposób można szybko zbadać co najmniej 200 NMJ na mięsień.
2. Aby ocenić ponowne unerwienie mięśni, określamy "współczynnik unerwienia". Mianownikiem jest liczba odnerwionych połączeń nerwowo-mięśniowych oznaczonych wiązaniem α-bungarotoksyny i immunoreaktywnością komórek Schwanna GAP-43. Licznik to liczba ponownie unerwionych NMJ oznaczonych immunoreaktywnością neurofilamentu/SV2. W razie potrzeby NMJ mogą być sklasyfikowane jako częściowo (niepełne pokrycie α-bungarotoksyną przez SV2) lub całkowicie (pełne pokrycie α-bungarotoksyny przez SV2) ponownie unerwione. Przykłady ponownie unerwionych i odnerwionych NMJ znajdują się na rysunku 3, panele G i H.

7. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1. Schemat anatomii kończyn tylnych ważny dla zmiażdżenia nerwu. ZA. Wykonano półkoliste nacięcie skóry odsłaniające leżącą pod spodem muskulaturę. Ur. Mięśnie pośladkowe zostały oddzielone, a nerw kulszowy odsłonięty (krok 2.4 powyżej). Strzałka oznacza przybliżone miejsce zmiażdżenia. Umiejscowienie retraktora jest pokazane jako ogólny przewodnik i jest dostosowywane podczas każdej operacji, aby ułatwić wizualizację rwy kulszowej i zbliżanie się kleszczy hemostatycznych w celu zmiażdżenia. B (wkładka): Umieszczenie rwy kulszowej na dolnej szczęce kleszczy hemostatycznych tuż przed zgnieceniem (krok 2.5 powyżej). Oddzielne pęczki są oznaczone, aby pokazać, że przylegają do siebie poziomo, ale nie pionowo, podczas zgniatania. Chociaż na tym schemacie oznaczone są trzy pęczki, można również zobaczyć czwarty pęczek, gałąź stawową strzałkową. Aby uzyskać bardziej szczegółowy rysunek anatomiczny rozgałęzień pęczków nerwu kulszowego dystalnie do punktu zgniatania, zapoznaj się z Greene's Anatomy of the Rat, Rysunek 188¹⁷.

Rysunek 2. Oznaczone węglem miejsce zmiażdżenia in situ i toluidyna zabarwione na niebiesko, półcienkie odcinki zmiażdżonego nerwu kulszowego. ZA. Przykład miejsca zmiażdżenia in situ (lewa kończyna tylna). węgiel oznacza miejsce zgniecenia. Gwiazdka oznacza gałąź nerwu piszczelowego, która unerwia mięśnie ud i służy jako przydatny punkt orientacyjny podczas operacji zmiażdżenia. Podział piszczelowy nerwu kulszowego jest zaznaczony na niebiesko, strzałkowy na zielono, a łydkowy na żółto. Ur. Półcienkie odcinki demonstrujące całkowite zmiażdżenie wykonane za pomocą kleszczy hemostatycznych. C. Półcienkie odcinki świadczące o niepełnym zgnieceniu wykonanym za pomocą kleszczy kątowych. Na obu obrazach degenerujące się profile mieliny są oznaczone grotami strzałek. W panelu C strzałki zaznaczają przykłady zachowanych profili mielinowych oraz skupisko oszczędzonych aksonów. Podziałka wynosi 10 μm.

Rysunek 3. Schemat całego mięśnia wierzchowca i reprezentatywny NMJ. A-C: Renderowane obrazy mięśni EDL (A), mięśnia strzałkowego długiego (B) i mięśnia płaszczkowatego (C) po usunięciu z kończyny tylnej. Pokazane mięśnie pochodzą z prawej kończyny tylnej. Anatomiczna orientacja kolana i kostki jest również dołączona w celach informacyjnych. Ścięgna są koloru białego i są obrysowane ciągłą czarną linią, gdy są umieszczone na górze mięśnia. Są one obrysowane czarną przerywaną linią, gdy rozciągają się poniżej mięśnia. Cięcia są pokazane czerwonymi liniami przerywanymi. Mięśnie są odrywane od miejsc cięcia, jak wskazują niebieskie strzałki, a następnie przerzedzane. Po rozrzedzeniu mięsień jest oddzielany od szpilek poprzez nacięcie wokół tego, co pozostało z upiętych ścięgien. D-F: Renderowane obrazy całych mięśni wierzchowca po usunięciu tkanki łącznej i późniejszym przerzedzeniu. Pasma końcowe są obrysowane na każdym mięśniu. G-H: Mięsień płaszczkowaty całego wierzchowca czternaście dni po zmiażdżeniu nerwu kulszowego, wykazujący ponownie unerwione (G) i odnerwione (H) połączenia nerwowo-mięśniowe. W tych panelach NMJ, aksony i komórki Schwanna są wizualizowane, jak opisano powyżej w sekcji 5.5.1. Receptory acetylocholiny są czerwone, aksony zielone, a procesy komórkowe Schwanna niebieskie. W panelu G strzałki wskazują obszary NMJ, które zostały ponownie unerwione przez akson. W panelu H groty strzałek wskazują GAP-43 dodatnie procesy komórek Schwanna. Zwróć uwagę na brak aksonów. Podziałka wynosi 10 μm.

Dyskusja

Przedstawiliśmy metodę uzyskania niezawodnie kompletnego zmiażdżenia nerwu kulszowego z precyzyjnym oznaczeniem miejsca zmiażdżenia. Jak wcześniej wspomniano, zmiażdżenie nerwu kulszowego jest powszechnym modelem uszkodzenia nerwów obwodowych u myszy i szczurów. Chociaż każda metoda zgniatania ma swoje zalety i wady, stwierdziliśmy, że ta metoda daje całkowite zgniatanie, które można łatwo oznaczyć przy użyciu minimalnego specjalnego sprzętu (np. specjalnych zacisków itp.).

Metody zgniatania

...