Mikrokapsułka alginianowa jako platforma 3D do rozmnażania i różnicowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) do różnych linii

Podsumowanie

Zoptymalizowaliśmy technikę mikrokapsułkowania jako skuteczną platformę 3D do rozmnażania i różnicowania embrionalnych komórek macierzystych do endodermy i neuronów dopaminergicznych (DA). Daje to również możliwość immunologicznej izolacji komórek od gospodarza podczas przeszczepu. Platforma ta może być dostosowana do innych typów komórek.

Streszczenie

Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) stają się atrakcyjnym alternatywnym źródłem terapii zastępczej komórek, ponieważ mogą być w nieskończoność rozwijane w hodowli i różnicowane do dowolnych typów komórek w organizmie. W hodowlach komórek macierzystych zastosowano również różne rodzaje biomateriałów, aby zapewnić mikrośrodowisko naśladujące niszę komórek macierzystych^1-3. Ten ostatni jest ważny dla promowania interakcji międzykomórkowych, proliferacji komórek i różnicowania w określone linie, a także organizacji tkanek poprzez zapewnienie trójwymiarowego (3D) środowiska⁴ , takiego jak enkapsulacja. Zasada enkapsulacji komórek polega na uwięzieniu żywych komórek w granicach półprzepuszczalnych błon w kulturach 3D². Błony te umożliwiają wymianę składników odżywczych, tlenu i bodźców przez błony, podczas gdy przeciwciała i komórki odpornościowe gospodarza, które są większe niż rozmiar porów kapsułki, są wykluczone⁵. W tym artykule przedstawiono podejście do hodowli i różnicowania neuronów hESC DA w mikrośrodowisku 3D za pomocą mikrokapsułek alginianowych. Zmodyfikowaliśmy warunki hodowli², aby zwiększyć żywotność kapsułkowanego hESC. Wcześniej wykazaliśmy, że dodanie inhibitora kinazy cewki cewki (ROCK) związanego z p160-Rho, Y-27632 i pożywki zastępczej surowicy kondycjonowanej przez ludzki płód fibroblastów (hFF-CM) do platformy 3D znacznie zwiększyło żywotność kapsułkowanego hESC, w którym komórki wyrażały ostateczne geny markera endodermy¹. Wykorzystaliśmy tę platformę 3D do propagacji hESC i efektywnego różnicowania do neuronów DA. Analizy ekspresji białek i genów po końcowym etapie różnicowania neuronów DA wykazały zwiększoną ekspresję hydroksylazy tyrozynowej (TH), markera neuronów DA, >100-krotnie po 2 tygodniach. Postawiliśmy hipotezę, że nasza platforma 3D wykorzystująca mikrokapsułki alginianowe może być przydatna do badania proliferacji i ukierunkowanego różnicowania hESC do różnych linii. Ten system 3D umożliwia również oddzielenie komórek zasilających od hESC podczas procesu różnicowania, a także ma potencjał do izolacji immunologicznej podczas przeszczepu w przyszłości.

Protokół

Wszystkie poniższe procedury są przeprowadzane przy użyciu technik aseptycznych w Komorze Bezpieczeństwa Biologicznego klasy II. Stosowane odczynniki i sprzęt są wymienione w poniższych tabelach.

1. Przygotowanie 1,1% alginianu (w/v)

1. Dodać 0,275 g oczyszczonego alginianu sodu (wysoka zawartość kwasu glukuronowego ≥60%, lepkość >200 mPa s i endotoksyna ≤100 EU/g) w sterylnej probówce o pojemności 50 ml i dodać 25 ml jałowego 0,1% roztworu żelatyny przygotowanego wcześniej (0,5 g żelatyny/500 ml mili-Q_H2Oi rozpuszczonego w autoklawie).
2. Wirować probówkę przez około 30 sekund, aby częściowo rozpuścić proszek alginianowy, a następnie umieścić probówkę na mieszalniku orbitalnym o sile 10 x g na noc (temperatura pokojowa).
3. Dodać 2,778 ml 9% sterylnego NaCl (4,5 g NaCl/50 ml mili-Q_{H 2}O) do 25 ml roztworu alginianu. Wirować probówkę przez około 30 sekund, a następnie odwirować przy 95 x g przez 5 minut.
4. Roztwór alginianu przechowywać w temperaturze 4 °C do krótkotrwałego przechowywania (1-2 miesiące) lub w temperaturze -20 °C do długotrwałego przechowywania (około roku).

2. Przygotowanie kąpieli wytrącającej CaCl₂

1. Rozpuścić 14,7 g CaCl₂^.2H₂O i 2,38 g HEPES w 1 litrze mili-Q H₂O.
2. Dostosuj poziom pH do 7,4.
3. Wysterylizuj roztwór za pomocą filtra 0,22 μm.
4. Kąpiel opadowa może być przechowywana w temperaturze pokojowej (6-12 miesięcy).

3. Przygotowanie roztworu dekapsulującego

1. Do 500 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (D-PBS) firmy Dulbecco dodać 50 ml 0,5M EDTA i 5 ml 1M HEPES.
2. Sterylizować za pomocą filtra 0,22 μm lub autoklawu w temperaturze 121 °C przez 20 minut.
3. Roztwór dekapsulujący należy przechowywać w temperaturze pokojowej (6-12 miesięcy).

4. Przygotowanie podłoża zastępującego surowicę (SR)

1. Przed enkapsulacją należy wcześniej przygotować pożywkę SR zgodnie z opisem w Tabeli określonych odczynników i sprzętu.

5. Przygotowanie inhibitora ROCK (Y-27632)

1. Rozcieńczyć proszek Y-27632 w 0,1% albuminie surowicy ludzkiej (HSA) w D-PBS, aby uzyskać roztwór o stężeniu 5 mM.

6. Przygotowanie hESC do enkapsulacji

1. Komórki należy wstępnie potraktować pożywką do hodowli uzupełnioną 10 μM inhibitora ROCK (RI) przez dwie godziny w temperaturze 37 °C (chronić przed światłem).
2. Po poddaniu działaniu RIS dwukrotnie przemyć komórki D-PBS i enzymatycznie usunąć komórki z płytek hodowlanych za pomocą akutazy przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
3. Delikatnie zeskrobać komórki za pomocą pipety lub skrobaka do komórek i zebrać w probówce o pojemności 15 ml. Zneutralizować akutazę pożywką SR w stosunku 1:1.
4. Aby przygotować zawiesinę jednokomórkową, przefiltrować zneutralizowane komórki za pomocą filtra 40 μm i zebrać w świeżej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.
5. Oblicz całkowitą liczbę komórek w roztworze za pomocą hemacytometru.
6. Odwirować zawiesinę komórkową 95 x g przez 5 minut, a następnie ostrożnie wyrzucić supernatant. Umyj komórki wstępnie podgrzanym 0,9% NaCl. Odwirować 95 x g przez 5 minut i wyrzucić supernatant.

7. Hermetyzacja komórek

1. Przygotować strzykawkę o pojemności 1 ml przymocowaną do miękkiej plastikowej rurki z cewnikiem dożylnym 14G x 2". Służy do zasysania zawiesiny komórek, która ma być załadowana do pompy strzykawkowej, jak pokazano na rysunku 1.
2. Ponownie zawiesić komórki wstępnie podgrzanym roztworem alginianu o gęstości 1,25 miliona komórek/ml alginianu. Delikatnie wymieszać ze strzykawką i unikać tworzenia pęcherzyków.
3. Ustaw generator kulek, pompę strzykawkową i przepływomierz powietrza, jak pokazano na rysunku 1. Więcej szczegółów na temat tych urządzeń znajduje się w Tabeli poszczególnych odczynników i wyposażenia.
4. Po odessaniu komórek do strzykawki należy wyrzucić plastikową rurkę cewnika dożylnego i podłączyć strzykawkę do urządzenia do kapsułkowania. Upewnij się, że między końcem maszyny do hermetyzacji a punktem zbiórki jest 10 cm odstępu, jak pokazano na rysunku 1.
5. Kapsułkuj komórki, ustawiając pompę strzykawkową na 20 ml/h, natężenie przepływu powietrza na 8 l/min i ciśnienie 100 kPa (rozmiar kapsułek można zmienić, zmieniając natężenie przepływu powietrza).
6. Zebrać zamknięte komórki na szalce Petriego (100 x 15 mm) wypełnionej 20 ml wstępnie podgrzanej kąpieli strącającej przez 7 minut w celu ustabilizowania kapsułek.
7. Przenieść zamknięte komórki przez delikatne aspiracje do 50 ml probówek wirówkowych wypełnionych 20 ml 0,9% NaCl.
8. Pozwolić, aby kapsułki osiadły na dnie probówki, a następnie delikatnie wyrzucić supernatant. Powtórz proces prania z 0,9% NaCl.
9. Zawiesić zamknięte komórki we wstępnie ogrzanej pożywce z dodatkiem RI (10 μM), przenieść do kolby hodowlanej i inkubować w temperaturze 37 °C/5% CO₂ .

8. Różnicowanie enkapsulowanych neuronów hESC do DA

Kapsułkowane hESC są leczone RI przez 3 dni przed różnicowaniem.

1. Wysiewać linię komórek zrębu myszy, komórki PA6 o gęstości 1,0 x 10⁴ na cm² w 0,1% kolbie T75 pokrytej żelatyną i kondycjonować komórki PA6 w pożywce do różnicowania neuronów DA (tabela materiałów) 24 godziny przed różnicowaniem.
2. Przenieść kapsułki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i pozostawić je do osadzenia się na dnie probówki.
3. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić kapsułki w kondycjonowanym przez komórki PA6 pożywce różnicowania neuronalnego DA.
4. Hodować kapsułkowane hESC z monowarstwą komórek PA6 (9 x 10⁶ komórek hESC na 7,5 x 10⁵ komórek PA6) przez 28 dni ze zmianą pożywki w 4 dniu, a następnie co drugi dzień (za każdym razem zmieniaj tylko połowę pożywki).
5. Po 3 tygodniach w hodowli z komórkami PA6 uzupełnij pożywkę różnicowania neuronalnego DA 100 ng/ml SHH i 100 ng/ml FGF8a przez pozostały tydzień.

9. Dekapsulacja enkapsulowanego hESC

1. Odessać kapsułki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i pozostawić do osadzenia się na dnie probówki. Następnie należy ostrożnie wyrzucić supernatant.
2. Kapsułki należy umyć dwukrotnie preparatem D-PBS. Pozwól kapsułkom osiąść na dnie probówki, a następnie usuń supernatant.
3. Dodać 5 ml roztworu odkapsulującego do kapsułek. Zawiesinę dokładnie wymieszać przez aspirację przed inkubacją w temperaturze pokojowej przez 4-5 minut.
4. Odwirować zdecapsulowane komórki w stężeniu 95 x g przez 3 minuty i odrzucić supernatant.
5. Przemyć osad komórkowy preparatem D-PBS, a następnie odwirować przy 95 x g przez 3 minuty. Powtórzyć.
6. Zdecapsulowane komórki mogą być dalej hodowane jako monowarstwa lub wykorzystywane do dalszej analizy.

10. Reprezentatywne wyniki

Średnica mikrokapsułek alginianowych wynosi 400-500 μm. Liczbę komórek w kapsułce oszacowano, obliczając całkowitą liczbę komórek podzieloną przez całkowitą liczbę kapsułek na serię. W związku z tym oszacowano około 5,0 x 10⁴ komórek na kapsułkę. Na tej podstawie zakładamy, że maksymalna liczba komórek, jakie może zawierać kapsułka, wynosi około 1,0 x 10⁵. Żywotność kapsułkowanego hESC wynosi >80% (ryc. 2), jak określono przy użyciu testu na obecność estru sukcynimidowego dioctanu karboksyfluoresceiny (CFDA)/jodku propidyny (PI). Zoptymalizowaliśmy warunki enkapsulacji hESC poprzez zmniejszenie stężenia alginianów z 2,2% do 1,1% oraz zmianę kąpieli wytrącającej z chlorku baru na chlorek wapnia. Na podstawie tych warunków wykazaliśmy, że tylko komórki, które były otoczone 1,1% alginianem wapnia, mogły przetrwać, namnażać się i tworzyć EB in vitro¹. Aby jeszcze bardziej zoptymalizować stan, zbadano wpływ pożywek hodowlanych i RI, Y-27632. Dane przedstawione na rycinach 2 i 3 pokazują, że RI zapobiegał apoptozie wywołanej dysocjacją i utrzymywał żywotność komórek oraz sprzyjał tworzeniu klastrów^1,6. Ponadto żywotność kapsułkowanego hESC hodowanego w hFF-CM + RI była znacznie wyższa niż w innych grupach bez suplementacji RI; jednak nie różniło się to znacząco od kapsułkowanego hESC hodowanego w SR + RI. Podobnie, proliferacja komórek za pomocą testu BrdU wzrosła z 25% do 75%, gdy pojedyncze komórki rozwijały się w klastry (ryc. 3). Test apoptozy przeprowadzony przez TUNEL wykazał, że pojedyncze komórki w mikrokapsułkach hodowanych w pożywce SR były apoptotyczne (dane nie pokazane), podczas gdy klastry pobrane z hFF-CM były w większości ujemne dla TUNEL. Do pewnego stopnia hFF-CM uzupełniony bFGF sprzyjał również przeżywalności i proliferacji enkapsulowanych hESC pod nieobecność Y-27632. Jednak leczenie Y-27632 przed (2 godziny) i po enkapsulacji (przez dodatkowe 4 dni) znacznie zwiększyło żywotność, proliferację i tworzenie klastrów kapsułkowanego hESC w 1,1% mikrokapsułkach z alginianu wapnia.

Poprzednio wykazaliśmy, że kapsułkowane hESC można z powodzeniem odróżnić od ostatecznej endodermy¹. W tym miejscu zbadaliśmy zastosowanie enkapsulacji komórek jako platformy 3D do różnicowania enkapsulowanych hESC w neurony DA. hESC, które utworzyły ciała zarodkowe (EB) w kapsułkach, były bezpośrednio zróżnicowane i po dekapsulacji w opisanych warunkach wykazały postępującą morfologię neuronów (ryc. 4) po 2-3 dniach hodowli z ponad 90% żywotnością. Analiza ekspresji genów wykazała regulację w dół markera pluripotencjalnego, OCT4, podczas gdy marker neuroprogenitorowy, PAX6 i marker neuronalny DA, TH były regulowane w górę po 7 dniach różnicowania (Figura 5A). Barwienie immunofluorescencyjne wykazało, że zróżnicowane hESC były PAX6-dodatnie (>80%), ale OCT4-ujemne w dniu 7. Dalej zróżnicowane hESC wykazało neurony TH-dodatnie (>90%) po 21 dniach (Figura 5B). Analiza Western blot wykazała również regulację w górę ekspresji TH od 14 dnia (Figura 5C), podczas gdy ekspresja PAX6 była regulowana w dół po 21 dniu. Dla porównania, komórki hodowane w dwuwymiarowym (2D) środowisku w podobnych warunkach (np. RI przed traktowaniem przez 2 godziny i RI po leczeniu przez 3 dni przed różnicowaniem) utrzymywały wysoki odsetek komórek PAX6-dodatnich (>80%) przez cały okres różnicowania i nie były tak skuteczne w różnicowaniu się do komórek TH-dodatnich (<60%), jak w środowisku 3D zapewnionym przez enkapsulację (Figura 5A i C).

Dyskusja

Kilka badań z wykorzystaniem embrionalnych komórek macierzystych myszy i hESC wykazało korzyści płynące z systemu hodowli 3D w biomateriałach i inżynierii tkankowej^2,3. Użyliśmy mikrokapsułek alginianu wapnia jako odpowiedniej platformy 3D do badania propagacji i różnicowania hESC w porównaniu z alginianem baru, ponieważ hESC wykazywało znacznie wyższą żywotność, gdy było zamknięte w alginianie wapnia niż alginian baru. Ten system hodowli umożliwia również hodowlę komórkową o dużej gęstości oraz wymianę składn...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Alginian (Pronova UP MVG)	NovaMatrix	4200101	wysoka zawartość kwasu glukuronowego ≥ 60%, lepkość > 200 mPa s i endotoksyny < 100 EU/g
Żelatyna	Sigma-Aldrich	G1890-100G
0,9% NaCl	Baxter Internationl Inc.
Generator kulek typu J1	Nisco engineering Inc	SPA-0447
Wielofazowa pompa strzykawkowa	New Era	Model NE-1000
Ezi-Flow Przepływomierz medyczny	Gascon Systems	G0149
Y-27632	Merck & Co., Inc.	688000
Albumina surowicy ludzkiej	Sigma-Aldrich	A4327-1G
Accutase	EMD Millipore	SCR005
14G x 2” I.V. cewnik	Terumo Medical Corp.	SR-OX1451C
Knockout-DMEM	Invitrogen	10829-018	Dla SR medium (podstawowego)
GlutaMAX -I	Invitrogen	35050-061	Dla SR medium (2 mM)
Zamiennik surowicy do nokautu	Invitrogen	10828-028	Dla podłoża SR (20%)
Penicylina-Streptomycyna	Invitrogen	15070063	Dla podłoża SR (2,5 U/ml)
Insulina-Transferyna-Selen (ITS)	Invitrogen	41400045	Dla podłoża SR (1x)
β-Mercapt– thanol	Invitrogen	21985-023	Dla podłoża SR (0,1 mM)
MEM NEAA Roztwór	Invitrogen	11140-050	Dla podłoża SR (5 mM)
Glasgow Minimum Essential Medium	Invitrogen	11710035	Dla podłoża do różnicowania neuronów DA (podstawowego)
Wymiana surowicy nokautującej	Invitrogen	10828-028	Do podłoża różnicowania neuronalnego DA (10%)
Sód pirogronian	Invitrogen	11360070	Do pożywki różnicowania neuronów DA (1 mM)
MEM NEAA Solution	Invitrogen	11140-050	Do pożywki różnicowania neuronów DA (0,1 mM)
β-Mercapt– thanol	Invitrogen	21985-023	Do podłoża różnicowania neuronów DA (0,1 mM)
Jeż dźwiękowy (SHH)	R & D Systems	1314-SH-025/CF	Do różnicowania neuronów DA (100 ng / ml)
Czynnik wzrostu fibroblastów 8a (FGF8a)	R& D Systems	4745-F8-050	Do różnicowania neuronów DA (100 ng / ml)