Zoptymalizowaliśmy technikę mikroenkapsulacji jako efektywną platformę 3D do propagacji i różnicowania embrionalnych komórek macierzystych w endodermę oraz neurony dopaminergiczne (DA). Zapewnia ona również możliwość immunoisolacji komórek od gospodarza podczas transplantacji. Platforma ta może zostać dostosowana do innych typów komórek.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mikrokapsułka alginianowa jako trójwymiarowa platforma do propagacji i różnicowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) w różne linie komórkowe
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) stają się atrakcyjnym alternatywnym źródłem dla terapii zastępczej komórek, ponieważ mogą być namnażane w hodowli w nieskończoność i różnicowane w dowolne typy komórek w organizmie. W hodowlach komórek macierzystych stosowano również różne rodzaje biomateriałów w celu zapewnienia mikrośrodowiska naśladującego niszę komórek macierzystych1-3. Jest to istotne dla promowania interakcji międzykomórkowych, proliferacji komórek i różnicowania w określone linie, a także organizacji tkanki poprzez zapewnienie trójwymiarowego (3D) środowiska4, takiego jak enkapsulacja. Zasada enkapsulacji komórek polega na uwięzieniu żywych komórek w obrębie półprzepuszczalnych membran w hodowlach 3D2. Membrany te umożliwiają wymianę składników odżywczych, tlenu i bodźców, podczas gdy przeciwciała i komórki odpornościowe gospodarza, które są większe niż pory kapsuły, zostają wykluczone5. W niniejszej pracy przedstawiamy podejście do hodowli i różnicowania hESC w neurony dopaminergiczne (DA) w mikrośrodowisku 3D przy użyciu mikrokapsułek alginianowych. Zmodyfikowaliśmy warunki hodowli2, aby zwiększyć żywotność enkapsulowanych hESC. Wykazaliśmy wcześniej, że dodatek inhibitora kinazy p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK), Y-27632 oraz pożywki zastępczej z serum kondycjonowanym przez ludzkie fetalne fibroblasty (hFF-CM) do platformy 3D znacząco zwiększył żywotność enkapsulowanych hESC, w których komórki wykazywały ekspresję genów markerów ostatecznej endodermy1. Wykorzystaliśmy obecnie tę platformę 3D do propagacji hESC i efektywnego różnicowania w neurony DA. Analizy ekspresji białek i genów po końcowym etapie różnicowania neuronów DA wykazały wzrost ekspresji hydroksylazy tyrozynowej (TH), markera neuronów DA, ponad >100-krotny po 2 tygodniach. Postawiliśmy hipotezę, że nasza platforma 3D wykorzystująca mikrokapsułki alginianowe może być użyteczna do badania proliferacji i ukierunkowanego różnicowania hESC w różne linie. Ten system 3D pozwala również na oddzielenie komórek karmiacych od hESC podczas procesu różnicowania, a także posiada potencjał do izolacji immunologicznej podczas przyszłych transplantacji.
Protokół
Wszystkie poniższe procedury są przeprowadzane z zachowaniem zasad aseptyki w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II. Wykorzystane odczynniki i sprzęt wymieniono w poniższych tabelach.
1. Przygotowanie 1,1% alginianu (m/v)
- Do sterylnej probówki o pojemności 50 ml wsypać 0,275 g oczyszczonego alginianu sodu (wysoka zawartość kwasu glukuronowego ≥60%, lepkość >200 mPa s oraz zawartość endotoksyn ≤100 EU/g), a następnie dodać 25 ml wcześniej przygotowanego sterylnego 0,1% roztworu żelatyny (0,5 g żelatyny/500 ml wody milli-Q H2O, rozpuszczonej w autoklawie).
- Probówkę mieszać na wortexie przez około 30 sekund do częściowego rozpuszczenia proszku alginianowego, a następnie umieścić ją na mieszadle orbitalnym przy 10 x g na noc (w temperaturze pokojowej).
- Do 25 ml roztworu alginianu dodać 2,778 ml 9% sterylnego NaCl (4,5 g NaCl/50 ml wody milli-Q H2O). Probówkę mieszać na wortexie przez około 30 sekund, a następnie wirować przy 95 x g przez 5 min.
- Roztwór alginianu przechowywać w temperaturze 4 °C w przypadku przechowywania krótkoterminowego (1-2 miesiące) lub w temperaturze -20 °C w przypadku przechowywania długoterminowego (około roku).
2. Przygotowanie kąpieli wytrącania CaCl2
- Rozpuścić 14,7 g CaCl2.2H2O oraz 2,38 g HEPES w 1 litrze wody milli-Q H2O.
- Dostosować pH do wartości 7,4.
- Sterylizować roztwór, używając filtra 0,22 μm.
- Kąpiel do precypitacji można przechowywać w temperaturze pokojowej (6–12 miesięcy).
3. Przygotowanie roztworu do usuwania otoczki
- Do 500 ml soli fizjologicznej z buforem fosforanowym Dulbecco (D-PBS) dodać 50 ml 0.5M EDTA oraz 5 ml 1M HEPES.
- Sterylizować za pomocą filtra 0.22 μm lub w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 min.
- Roztwór do usuwania kapsydy przechowywać w temperaturze pokojowej (od 6 do 12 miesięcy).
4. Przygotowanie pożywki z zamiennikiem surowicy (SR)
- Przed enkapsulacją należy wcześniej przygotować medium SR zgodnie z opisem w Tabeli specyficznych odczynników i sprzętu.
5. Przygotowanie inhibitora ROCK (Y-27632)
- Rozpuścić proszek Y-27632 w 0,1% albuminie ludzkiej (HSA) w D-PBS, aby przygotować roztwór o stężeniu 5 mM.
6. Przygotowanie hESC do enkapsulacji
- Poddać komórki wstępnej inkubacji w pożywce hodowlanej uzupełnionej o 10 μM inhibitora ROCK (RI) przez dwie godziny w temperaturze 37 °C (chroniąc przed światłem).
- Po traktowaniu RI przemyć komórki dwukrotnie roztworem D-PBS i odłączyć komórki od płytek hodowlanych enzymatycznie za pomocą accutase przez 10 min w temperaturze 37 °C.
- Delikatnie zebrać komórki za pomocą pipety lub skrobaka do komórek i przenieść do probówki o pojemności 15 ml. Zneutralizować accutase pożywką SR w stosunku 1:1.
- W celu przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek przefiltrować zneutralizowane komórki przez filtr 40 μm i zebrać do nowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
- Obliczyć całkowitą liczbę komórek w roztworze przy użyciu hemocytometru.
- Wirować zawiesinę komórkową z prędkością 95 x g przez 5 min, a następnie ostrożnie usunąć nadsącz. Przemyć komórki uprzednio ogrzanym 0,9% NaCl. Wirować z prędkością 95 x g przez 5 min i usunąć nadsącz.
7. Enkapsulacja komórek
- Przygotuj strzykawkę o pojemności 1 ml z podłączonym miękkim plastikowym drenem kaniuli dożylnej (I.V.) o rozmiarze 14G x 2". Służy ona do aspiracji zawiesiny komórkowej, która zostanie załadowana do pompy strzykawkowej, jak pokazano na Rysunku 1.
- Resuspenduj komórki w uprzednio ogrzanym roztworze alginianu, aby uzyskać gęstość 1,25 miliona komórek/ml alginianu. Delikatnie wymieszaj zawartość strzykawki, unikając powstawania pęcherzyków powietrza.
- Ustaw generator kulek, pompę strzykawkową i przepływomierz powietrza zgodnie z Rysunkiem 1. Więcej szczegółów dotyczących tych urządzeń znajduje się w Tabeli specyficznych odczynników i sprzętu.
- Po aspiracji komórek do strzykawki usuń plastikowy dren kaniuli dożylnej i podłącz strzykawkę do urządzenia do enkapsulacji. Upewnij się, że między końcem urządzenia do enkapsulacji a punktem zbierania zachowana jest przerwa 10 cm, jak pokazano na Rysunku 1.
- Przeprowadź enkapsulację komórek, ustawiając pompę strzykawkową na 20 ml/hr, przepływ powietrza na 8 L/min oraz ciśnienie na 100 kPa (rozmiar kapsułek można zmienić poprzez modyfikację szybkości przepływu powietrza).
- Zbierz enkapsulowane komórki do szalki Petriego (100 x 15 mm) wypełnionej 20 ml uprzednio ogrzanej kąpieli wytrącającej na 7 min w celu stabilizacji kapsułek.
- Przenieś enkapsulowane komórki poprzez delikatną aspirację do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml wypełnionych 20 ml 0,9% NaCl.
- Pozostaw kapsułki do momentu opadnięcia na dno probówki, a następnie delikatnie usuń nadsącz. Powtórz proces płukania przy użyciu 0,9% NaCl.
- Resuspenduj enkapsulowane komórki w uprzednio ogrzanym medium hodowlanym uzupełnionym o RI (10 μM), przenieś je do kolby hodowlanej i inkubuj w temperaturze 37 °C/5% CO2.
8. Różnicowanie enkapsulowanych hESC w neurony DA
Enkapsułowane hESC są traktowane RI przez 3 dni przed różnicowaniem.
- Wysiać linię komórek zrębowych myszy, komórki PA6, w gęstości 1.0 x 104 na cm2 do kolby T75 powleczonej 0,1% żelatyną i przygotować komórki PA6 w medium do różnicowania neuronalnego DA (tabela materiałów) na 24 godziny przed różnicowaniem.
- Przenieść kapsułki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i pozwolić im osiąść na dnie probówki.
- Odpiłować nadsącz i resuspendować kapsułki w medium do różnicowania neuronalnego DA warunkowanym przez komórki PA6.
- Kulturować enkapsulowane hESC z monowarstwą komórek PA6 ( 9 x 106 hESCs na 7.5 x 105 komórek PA6 ) przez 28 dni, wymieniając medium w dniu 4. oraz co drugi dzień w dalszym ciągu (za każdym razem wymieniać tylko połowę medium).
- Po 3 tygodniach hodowli z komórkami PA6, uzupełnić medium do różnicowania neuronalnego DA o 100 ng/ml SHH oraz 100 ng/ml FGF8a w ostatnim tygodniu.
9. Dekapsulacja enkapsulowanych hESC
- Przenieś kapsułki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i pozwól im opaść na dno probówki. Następnie ostrożnie odlej nadsącz.
- Przemyj kapsułki dwukrotnie roztworem D-PBS. Pozostaw kapsułki do opadnięcia na dno probówki, a następnie usuń nadsącz.
- Dodaj do kapsułek 5 ml roztworu do dekapsulacji. Przed inkubacją w temperaturze pokojowej przez 4-5 min dokładnie wymieszaj zawiesinę poprzez aspirację.
- Odwiruj dekapsulowane komórki przy 95 x g przez 3 min i usuń nadsącz.
- Przemyj osad komórkowy roztworem D-PBS, a następnie wiruj przy 95 x g przez 3 min. Powtórz czynność.
- Dekapsulowane komórki można następnie hodować jako monowarstwę lub wykorzystać do dalszych analiz.
10. Reprezentatywne wyniki
Średnica mikrokapsułek alginianowych wynosi 400-500 μm. Liczbę komórek wewnątrz kapsułki oszacowano, obliczając całkowitą liczbę komórek podzieloną przez całkowitą liczbę kapsułek w jednym cyklu. W związku z tym oszacowano, że na jedną kapsułkę przypada około 5,0 x 104 komórek. Na tej podstawie zakładamy, że maksymalna liczba komórek, jaką może pomieścić kapsułka, wynosi około 1,0 x 105. Żywotność enkapsulowanych hESC wynosi >80% (Rysunek 2), co określono za pomocą testu z użyciem estru bursztynianowego diacetatu karboksyfluoresceiny (CFDA) i jodku propidyny (PI). Zoptymalizowaliśmy warunki enkapsulacji hESC poprzez zmniejszenie stężenia alginianu z 2,2% do 1,1% oraz zmianę kąpieli wytrącającej z chlorku baru na chlorek wapnia. W tych warunkach wykazaliśmy, że przeżyć, proliferować i tworzyć ciała inkluzyjne (EB) in vitro1 mogły jedynie komórki enkapsulowane w 1,1% alginianie wapnia. Aby dalej zoptymalizować te warunki, zbadano wpływ pożywek hodowlanych oraz RI i Y-27632. Dane przedstawione na Rysunku 2 i 3 wykazują, że RI zapobiegał apoptozie indukowanej przez dysocjację, utrzymywał żywotność komórek i promował tworzenie skupisk1,6. Co więcej, żywotność enkapsulowanych hESC hodowanych w hFF-CM + RI była znacznie wyższa niż w pozostałych grupach bez suplementacji RI; nie różniła się ona jednak znacząco od żywotności enkapsulowanych hESC hodowanych w SR + RI. Podobnie proliferacja komórek w teście BrdU wzrosła z 25% do 75% w miarę rozwoju pojedynczych komórek w skupiska (Rysunek 3). Test apoptozy metodą TUNEL wykazał, że pojedyncze komórki w mikrokapsułkach hodowane w medium SR ulegały apoptozie (dane nie przedstawiono), podczas gdy odzyskane skupiska z hFF-CM były w większości negatywne w teście TUNEL. W pewnym stopniu hFF-CM suplementowany bFGF również promował przeżycie i proliferację enkapsulowanych hESC w obecności Y-27632. Jednakże traktowanie Y-27632 przed (2 godziny) i po enkapsulacji (przez dodatkowe 4 dni) wyraźnie zwiększyło żywotność, proliferację i tworzenie skupisk enkapsulowanych hESC w mikrokapsułkach z 1,1% alginianu wapnia.
Wcześniej wykazaliśmy, że enkapsulowane hESC mogą zostać pomyślnie zróżnicowane do definitywnej endodermy1. W niniejszej pracy zbadaliśmy zastosowanie enkapsulacji komórek jako platformy 3D do różnicowania enkapsulowanych hESC w neurony DA. Komórki hESC, które utworzyły ciała embrionalne (EB) w kapsułkach, poddano bezpośredniemu różnicowaniu; po dekapsulacji, w opisanych warunkach, wykazały one progresywną morfologię neuronalną (Rysunek 4) po 2-3 dniach hodowli, przy zachowaniu ponad 90% żywotności. Analiza ekspresji genów wykazała obniżenie poziomu markeru pluripotencji OCT4, podczas gdy marker neuroprogenitorowy PAX6 oraz marker neuronów DA, TH, uległy zwiększeniu po 7 dniach różnicowania (Rysunek 5A). Barwienie immunofluorescencyjne ujawniło, że zróżnicowane hESC były PAX6-dodatnie (>80%), ale OCT4-ujemne w 7. dniu. Dalsze różnicowanie hESC doprowadziło do powstania neuronów TH-dodatnich (>90%) po 21 dniach (Rysunek 5B). Analiza Western blot wykazała również wzrost ekspresji TH od 14. dnia (Rysunek 5C), podczas gdy ekspresja PAX6 spadła po 21. dniu. W porównaniu z nimi, komórki hodowane w środowisku dwuwymiarowym (2D) w podobnych warunkach (np. wstępna obróbka RI przez 2 godziny i obróbka RI po 3 dniach przed różnicowaniem) utrzymywały wysoki odsetek komórek PAX6-dodatnich (>80%) przez cały okres różnicowania i nie różnicowały się w komórki TH-dodatnie (<60%) tak efektywnie, jak w środowisku 3D zapewnionym przez enkapsulację (Rysunek 5A i C).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wiele badań z wykorzystaniem mysich embrionalnych komórek macierzystych oraz hESC wykazało korzyści płynące z zastosowania systemów hodowli 3D w biomateriałach i inżynierii tkankowej2,3. Wykorzystaliśmy mikrokapsułki alginianu wapnia jako odpowiednią platformę 3D do badania propagacji i różnicowania hESC w porównaniu z alginianem baru, ponieważ hESC wykazały znacznie wyższą żywotność po enkapsulacji w alginianie wapnia niż w alginianie baru. Ten system hodowli umożliwia również hodowlę komórek o wysokiej gęsto...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
Niniejsza praca jest wspierana przez grant programowy NHMRC nr 568969 (PSS) oraz Faculty of Medicine, University of New South Wales, Stem Cell Initiative (KSS).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Alginian (Pronova UP MVG) | NovaMatrix | 4200101 | wysoka zawartość kwasu glukuronowego ≥60%, lepkość >200 mPa s oraz endotoksyny <100 EU/g |
| Żelatyna | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| 0.9% NaCl | Baxter Internationl Inc. | AHF7123 | |
| Generator kulek typu J1 | Nisco engineering Inc | SPA-0447 | |
| Pompa strzykawkowa Multi-Phaser | New Era | Model NE-1000 | |
| Przepływomierz medyczny Ezi-Flow | Gascon Systems | G0149 | |
| Y-27632 | Merck & Co., Inc. | 688000 | |
| Albuminy surowicy ludzkiej | Sigma-Aldrich | A4327-1G | |
| Accutase | EMD Millipore | SCR005 | |
| Kaniula dożylna 14G x 2” | Terumo Medical Corp. | SR-OX1451C | |
| Knockout-DMEM | Invitrogen | 10829-018 | Do pożywki SR (podstawowa) |
| GlutaMAX -I | Invitrogen | 35050-061 | Do pożywki SR (2 mM) |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | Do pożywki SR (20%) |
| Penicylina-streptomycyna | Invitrogen | 15070063 | Do pożywki SR (2.5 U/ml) |
| Insulina-transferyna-selen (ITS) | Invitrogen | 41400045 | Do pożywki SR (1x) |
| β-merkapto–etanol | Invitrogen | 21985-023 | Do pożywki SR (0.1 mM) |
| Roztwór MEM NEAA | Invitrogen | 11140-050 | Do pożywki SR (5 mM) |
| Glasgow Minimum Essential Medium | Invitrogen | 11710035 | Do pożywki do różnicowania neuronalnego DA (podstawowa) |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | Do pożywki do różnicowania neuronalnego DA (10%) |
| Pirowinian sodu | Invitrogen | 11360070 | Do pożywki do różnicowania neuronalnego DA (1 mM) |
| Roztwór MEM NEAA | Invitrogen | 11140-050 | Do pożywki do różnicowania neuronalnego DA (0.1 mM) |
| β-merkapto–etanol | Invitrogen | 21985-023 | Do pożywki do różnicowania neuronalnego DA (0.1 mM) |
| Sonic hedgehog (SHH) | R&D Systems | 1314-SH-025/CF | Do różnicowania neuronalnego DA (100 ng/ml) |
| Czynnik wzrostu fibroblastów 8a (FGF8a) | R&D Systems | 4745-F8-050 | Do różnicowania neuronalnego DA (100 ng/ml) |
Bibliografia
- Chayosumrit, M., Tuch, B., Sidhu, K. Alginate microcapsule for propagation and directed differentiation of hESCs to definitive endoderm. Biomaterials. 31, 505-514 (2010).
- Dean, S. K., Yulyana, Y., Williams, G., Sidhu, K. S., Tuch, B. E. Differentiation of encapsulated embryonic stem cells after transplantation. Transplantation. 82, 1175-1184 (2006).
- Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance. Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).
- Dawson, E., Mapili, G., Erickson, K., Taqvi, S., Roy, K. Biomaterials for stem cell differentiation. Adv. Drug Deliv. Rev. 60, 215-228 (2008).
- Cell encapsulation: promise and progress. Nat. Med. Orive, G. 9, 104-107 (2003).
- Watanabe, K. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22, 275-282 (2004).
- Drukker, M. Characterization of the expression of MHC proteins in human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99, 9864-9869 (2002).
- Calafiore, R. Standard Technical Procedures for Microencapsulation of Human Islets for Graft into Nonimmunosuppressed Patients With Type 1 Diabetes Mellitus. Transplantation Proceedings. 38, 1156-1157 (2006).
- Cho, M. S. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3392-3397 (2008).
- Vazin, T., Chen, J., Lee, C. T., Amable, R., Freed, W. J. Assessment of stromal-derived inducing activity in the generation of dopaminergic neurons from human embryonic stem cells. Stem Cells. 26, 1517-1525 (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
