Metodologia elastografii rezonansu magnetycznego do oceny wzrostu konstruktu opartego na inżynierii tkankowej

Summary

Procedura demonstruje metodologię elastografii rezonansu magnetycznego do monitorowania wyników inżynieryjnych konstrukcji tkanki tłuszczowej i osteogennej poprzez nieinwazyjną lokalną ocenę właściwości mechanicznych za pomocą mikroskopowej elastografii rezonansu magnetycznego (μMRE).

Abstract

Tradycyjne testy mechaniczne często prowadzą do zniszczenia próbki, a w przypadku długoterminowych badań nad konstruktami tkankowymi, stosowanie oceny niszczącej jest nie do przyjęcia. Proponowaną alternatywą jest zastosowanie procesu obrazowania zwanego elastografią rezonansu magnetycznego. Elastografia jest nieniszczącą metodą określania wyniku inżynieryjnego poprzez pomiar lokalnych wartości właściwości mechanicznych (tj. złożonego modułu ścinania), które są niezbędnymi markerami do identyfikacji struktury i funkcjonalności tkanki. W ciągu ostatniej dekady wzrosło zainteresowanie monitorowaniem konstruktów inżynieryjnych za pomocą metod obrazowania, takich jak rezonans magnetyczny (MRI)¹. Na przykład techniki rezonansu magnetycznego (MR) dyfuzji i relaksometrii były w stanie scharakteryzować zmiany właściwości chemicznych i fizycznych podczas rozwoju tkanek inżynieryjnych². Metoda zaproponowana w poniższym protokole wykorzystuje mikroskopową elastografię rezonansu magnetycznego (μMRE) jako nieinwazyjną technikę opartą na MR do pomiaru właściwości mechanicznych małych tkanek miękkich³. MRE uzyskuje się poprzez sprzężenie sonicznego siłownika mechanicznego z tkanką będącą przedmiotem zainteresowania i zarejestrowanie propagacji fali poprzecznej za pomocą skanera MR⁴. Od niedawna μMRE znajduje zastosowanie w inżynierii tkankowej w celu pozyskiwania istotnych informacji o wzroście, które tradycyjnie mierzy się za pomocą destrukcyjnych mechanicznych technik makroskopowych⁵. W poniższej procedurze elastografię uzyskuje się poprzez obrazowanie skonstruowanych konstrukcji ze zmodyfikowaną sekwencją echa spinowego Hahna sprzężoną z mechanicznym siłownikiem. Jak pokazano na rysunku 1, zmodyfikowana sekwencja synchronizuje akwizycję obrazu z transmisją zewnętrznych fal ścinających; Następnie ruch jest uwrażliwiany za pomocą oscylujących par bipolarnych. Po zebraniu obrazów z pozytywną i ujemną wrażliwością na ruch, złożony podział danych daje obraz fali poprzecznej. Następnie obraz jest oceniany przy użyciu algorytmu odwrócenia w celu wygenerowania mapy sztywności na ścinanie⁶. Wykazano, że uzyskane pomiary dla każdego woksela silnie korelują (R²>0,9914) z danymi zebranymi za pomocą dynamicznej analizy mechanicznej⁷. W tym badaniu elastografia jest włączona do procesu rozwoju tkanek w celu monitorowania różnicowania ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (hMSC) w konstrukty adipogenne i osteogenne, jak pokazano na rycinie 2.

Protocol

1. Przygotowanie konstrukcji tkankowych

Proces przygotowania konstrukcji tkanki składa się z trzech głównych etapów: ekspansji populacji komórek, umieszczania komórek na rusztowaniu biomaterialnym oraz różnicowania poprzez użycie chemicznych cząsteczek sygnalizacyjnych. Procedura przygotowania konstruktu opiera się na metodach przeprowadzonych przez Dennisa i wsp., Honga i wsp. oraz Mariona i Mao^8,9,10.

1. Po hodowli i ekspansji linii komórkowej należy wysiać ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (hMSCs) na gąbce żelatynowej (4 mm średnicy, 3,5 mm grubości) o gęstości 1x10⁶ komórek/ml dla kości i 3x10⁶ komórek/ml dla tworzenia tkanki tłuszczowej.
2. W celu różnicowania hMSCs w tkankę tłuszczową należy zastosować pożywkę do indukcji tkanki tłuszczowej składającą się z 1 μM deksametazonu, 0,5 μM izobutylu metyloksantyny, 10 μg/ml ludzkiej rekombinowanej insuliny i 200 μM indometacyny w podłożu do ekspansji komórek, gdy komórki wydają się zlewać na rusztowaniu. Po trzech dniach zastąp pożywkę 10 μg/ml ludzkiej rekombinowanej insuliny w pożywce ekspandującej na 24 godziny, a następnie wróć do pożywki indukcyjnej. Powtórz cykl trzy razy, a następnie wymieniaj tylko w mediach konserwacyjnych co dwa dni.
3. Aby indukować osteogenezę, przygotuj osteogenne pożywki indukcyjne, wytwarzając końcowe stężenie 0,1 μM deksametazonu, 50 μM kwasu L-askorbinowego-2fosforanu i 10 mM β-glicerofosforanu w podłożu do ekspansji komórek. Zastępować świeżymi pożywkami osteogennymi co dwa dni.

2. Charakterystyka siłownika

Charakterystyka siłownika jest kluczowym krokiem w eksperymencie MRE. MRE opiera się na rozchodzeniu się mechanicznych fal ścinających w celu oceny lokalnych wartości właściwości mechanicznych; Dlatego te drgania mechaniczne muszą być generowane i charakteryzowane w tkance będącej przedmiotem zainteresowania za pomocą siłownika piezoelektrycznego. Ilustrowany przykład procesu charakterystyki przedstawiono na rysunku 3. Celem tej procedury jest optymalizacja ruchu siłownika w celu wygenerowania nieszkodliwych fal ścinających o znacznych amplitudach (~250 mikronów).

1. Przed eksperymentem nałóż 0,5% żelu agarozowego, aby zamknąć konstrukcję w probówce o średnicy 10 mm. Temperatura żelu powinna wynosić około 37 °C, aby zminimalizować uszkodzenia konstrukcji.
2. Po odczekaniu pięciu minut, aby żel agarozowy stężał w temperaturze pokojowej, włóż końcówkę piezoelektrycznego silnika gnącego do powierzchni żelu.
3. Przymocuj rurkę zawierającą próbkę i siłownik do sztywnego wspornika i skieruj wiązkę laserowego wibrometru dopplerowskiego w kierunku końcówki siłownika mechanicznego. Dostosuj położenie systemu, aby zoptymalizować odbity sygnał, w razie potrzeby użyj taśmy odblaskowej.
4. Na podstawie oczekiwanej częstotliwości rezonansowej siłownika mechanicznego należy ustawić generator funkcyjny tak, aby przemiatał żądany zakres częstotliwości (tj. w tym eksperymencie od 20 do 2000 Hz) przy użyciu napięcia roboczego 20 Vpp z sygnałem białego szumu.
5. View scharakteryzowane widmo w programie Polytec Vibrosoft, aby zidentyfikować częstotliwość rezonansową systemu i ustawić program na FFT i prędkość jako oś y.
6. W celu pomiaru przemieszczenia należy ustawić siłownik tak, aby dostarczał ciągłą sinusoidę o wskazanej częstotliwości rezonansowej przy użyciu napięcia roboczego 200 Vpp i zwrócić uwagę na wygenerowane przemieszczenie dostarczane na powierzchnię żelu. Ustaw Vibrosoft tak, aby wyświetlał FFT z przemieszczeniem jako oś y.

3. Akwizycja obrazu

1. Po zakończeniu charakterystyki siłownika umieść próbkę i siłownik na środku skanera MRI. Do eksperymentów z konstrukcją tkankową należy użyć małej i bardziej czułej cewki RF (tj. 10 mm w tym doświadczeniu) do transmisji i odbioru sygnału RF. (Przedstawiona procedura wykorzystuje magnes o pionowym otworze 9,4 T wyposażony w potrójne gradienty osi, 100 G/cm).
2. Zdobądź obraz zwiadowcy, aby zidentyfikować lokalizację konstrukcji.
3. Ustaw parametry akwizycji. Typowy skan strzałkowy in vitro będzie miał czas powtórzenia 1000 ms, czas echa 20-40 ms, grubość warstwy 0,5-1,0 mm i pole widzenia 12x10^mm2 przy rozmiarze matrycy 128x128 pikseli.
4. Dla parametrów elastografii należy ustawić częstotliwość siłownika na wartość określoną przez charakterystykę wibrometru laserowego dopplera. W obecnym badaniu potrzebna była jedna para bipolarna o amplitudzie gradientu 50 G/cm. Inne parametry, które należy dostosować, obejmują opóźnienie, które powinno być ustawione na zero milisekund dla początkowej akwizycji.
5. Zmień generator funkcji na tryb serii i dostosuj parametry generatora funkcji, aby odpowiadały parametrom akwizycji elastografii, w tym częstotliwości i liczbie cykli. Ustaw również generator funkcji tak, aby był wyzwalany zewnętrznie.
6. W przypadku obrazu strzałkowego ustaw czułość na ruch w kierunku dodatniego przekroju i rozpocznij skanowanie. Po akwizycji sprawdź obraz i zmień uczulenie na ujemny kierunek wycinka.
7. Uruchom program MATLAB, który wykona złożony podział w celu wygenerowania obrazu fali poprzecznej.
8. Oceń obraz pod kątem obecności fal ścinających i możliwych artefaktów, takich jak owijanie fazy.
9. Jeśli nie są konieczne żadne korekty obrazu, dostosuj rozmiar tablicy parametrów do ośmiu równomiernie rozłożonych wartości w zakresie od zera sekund do pełnego okresu scharakteryzowanej częstotliwości rezonansowej.
10. Uzyskaj skan zarówno w dodatniej, jak i ujemnej orientacji plasterka.
11. Po uzyskaniu obrazów użyj programu MATLAB przeznaczonego do generowania danych fali poprzecznej z tablicy obrazów.

4. Przetwarzanie obrazu w eksperymencie MRE

1. Ostatnim krokiem MRE jest obliczenie sztywności na ścinanie na podstawie obrazów fali ścinającej. Umieszczenie danych w programie MATLAB, który oceni trójwymiarowy zbiór danych (2 przestrzenne, 1 czasowy).

Uwaga: Zakładając płaską falę ścinającą, równania ruchu rozłączają się, co pozwala na oszacowanie modułu ścinania o wartości zespolonej jako funkcji przemieszczenia i jego Laplace'a. Algorytm aproksymuje przestrzenne pochodne sekundowe o skończonej różnicy i oblicza moduł ścinania na zasadzie piksel po pikselu. Z tej liczby zespolonej można wywnioskować wiele parametrów mechanicznych, takich jak prędkość fali ścinającej, tłumienie fali, sztywność na ścinanie, elastyczność na ścinanie, lepkość ścinania itp. Algorytm pozwala również na wybór obszarów zainteresowania, dla których obliczana jest średnia i odchylenie standardowe każdego parametru.

2. Parametry obrazowania należy określić na początku programu. Dodatkowo górna granica elastogramu może być regulowana w celu optymalizacji kontrastu w próbce.

Uwaga: Program dostarcza wyniki pośrednie (fala po filtrach dolnoprzepustowych, fala po filtrowaniu kierunkowym, czasowe FFT, profile linii, itp.), które pomagają użytkownikowi oszacować wierność odzyskiwania.

3. Na podstawie tych informacji można dostosować niektóre parametry, takie jak poziomy filtrów dolnoprzepustowych, czasowa częstotliwość ruchu, kierunek rozchodzenia się fali itp. Odchylenie standardowe parametru w określonym obszarze zainteresowania jest również wskaźnikiem jakości obliczeń.

5. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 4 pokazuje zmianę właściwości mechanicznych w ciągu czterech tygodni rozwoju konstruktu osteogennego i adipogennego. MRE prowadzono na częstotliwościach 730-820 Hz. Podczas gdy obie gąbki z nasionami zaczynały od około 3 kPa, osteogenne tkanki skierowane powodowały sztywność 22 kPa; natomiast tkanki tłuszczowe ukierunkowane na zmniejszenie sztywności do 1 kPa. Co więcej, konstrukty osteogenne wykazały znaczny spadek wielkości w porównaniu od początku do końca badania. Dodatkowe właściwości uzyskane z badania elastografii przedstawiono w tabeli 1.

Rysunek 1. Proces akwizycji obrazu do elastografii rezonansu magnetycznego. Podczas akwizycji obrazu sekwencja impulsów (a) steruje synchronizacją (b) generatora funkcyjnego z impulsami gradientów bipolarnych skanera MRI. Po uzyskaniu gradientów dwubiegunowych przełączanych w orientacji dodatniej i ujemnej, (c) powstaje obraz fali poprzecznej przy użyciu zespolonego podziału.

Rysunek 2. Diagram przepływu procesu MRE dla konstruktów inżynierii tkankowej. Po pierwsze, komórki (a) są najpierw hodowane i rozwijane do wielkości populacji niezbędnej dla projektowanego projektu. Następnie komórki są wysiewane (b) na rusztowaniu z biomateriału, a odczynniki chemiczne są nakładane w celu różnicowania sygnałów. Rusztowania charakteryzują się MRE, którego pierwszym krokiem (c) jest wyznaczenie częstotliwości rezonansowej siłownika sprzężonego z konstrukcją. Następnie pobierane są obrazy MRI (d) w celu wygenerowania obrazu fali poprzecznej (e). Na koniec stosuje się algorytm w celu uzyskania elastogramu (f), który odwzorowuje sztywność konstrukcji. Równolegle konstrukty są dzielone na sekcje w celu oceny histologicznej (g) w celu walidacji różnicowania.

Rysunek 3. Procedura charakterystyki siłownika. Rusztowanie żelatynowe jest otoczone 0,5% żelem agarozowym. Aby scharakteryzować ruch przenoszony do próbki, najpierw wysyłany jest biały szum do systemu (1a), a powstały ruch jest wykrywany za pomocą laserowego wibrometru dopplerowskiego (1b). Po określeniu częstotliwości rezonansowej wysyłany jest ciągły sygnał sinusoidalny w rezonansie (2a) w celu określenia przemieszczenia (2b) przenoszonego do środowiska żelatynowego.

Rysunek 4. Zbuduj mapę rozwoju w ciągu czterech tygodni. Konstrukty adipogenne (A) i osteogenne (O) są pokazane od lewej do prawej z odpowiednimi obrazami wielkości i fali ścinającej, elastogramem i średnią sztywnością ścinającą. Mapa kolorów elastogramu odpowiada schematowi kolorów wykresu słupkowego, a słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe w obszarze zainteresowania każdej konstrukcji.

Tabela 1. Właściwości mechaniczne konstruktów tłuszczowych i kostnych w ciągu czterech tygodni wzrostu.

Discussion

W tej procedurze demonstrowany jest proces MRE dla konstruktów inżynierii tkankowej od przygotowania komórek do wygenerowania elastogramu. Dzięki zastosowaniu nieniszczącej metody oceny mechanicznej do procesu inżynierii tkankowej, możliwa jest obecnie ocena zmian w konstrukcjach inżynieryjnych na wielu etapach rozwoju. Ponadto MRE uzupełnia inne metody MR do monitorowania konstruktów inżynierii tkankowej, takie jak dyfuzja, transfer namagnesowania i analiza przesunięć chemicznych¹.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Odczynnik MSCGM-Bullet Kit		Lonza Inc.	PT-3001	Sklep pod adresem 4° C
1X DPBS	Odczynnik	Invitrogen	21600-010
0,05% Odczynnik Trypsyna-EDTA		GIBCO, firmy Life Technologies	25300-054	Sklep pod adresem -20° C
Odczynnik deksametazonu		Sigma-Aldrich	D2915
3-izobutylo-1-metyloksantyna		Odczynnik Sigma-Aldrich	I5879	Przechowywać w temperaturze -20° C
Odczynnik do insuliny trzustki bydlęcej		Sigma-Aldrich	I6634	Przechowywać w temperaturze -20° Odczynnik C
Indometacyna		Sigma-Aldrich	I7378
Β-Odczynnik glicerofosforanowy		Sigma-Aldrich	G9891
Odczynnik	2-fosforanowy kwasu L-askorbinowego	Sigma-Aldrich	A8960
Rusztowanie	z pianki żelowej	Pharmacia Corporation (Pfizer)	09-0315-08
Ludzki mezenchymalny trzpień komórki	Linia komórkowa	Lonza Inc.	PT-2501
9.4T Sprzęt skanera MR		Agilent Technologies		400MHz WB
10mm Litz Coil	Equipment	Doty Scientific
Laser Doppler Vibrometer	Equipment	Polytec	PDV-100
Vibrosoft (20)	Software	Polytec
Sprzęt do generatora funkcyjnego		Agilent Technologies	AFG 3022B
Sprzęt wzmacniacza		Piezo Inc.	EPA-104-115
Sprzęt do gięcia piezoelektrycznego		Piezo Inc.	T234-A4CL-203X
Sprzęt komputerowo-Linux	Procesor	Intel		: Intel Core 2 Duo E8400, Pamięć: 2G
Sprzęt komputerowy-Windows	Procesor	Intel		: Intel Core 2 Duo E8400, Pamięć: 2G
Oprogramowanie MATLAB		Mathworks		2009b