Procedura demonstruje metodologię elastografii rezonansu magnetycznego w celu monitorowania wyników inżynierii tkankowej konstruktów adypogennych i osteogennych poprzez nieinwazyjną lokalną ocenę właściwości mechanicznych z wykorzystaniem mikroskopowej elastografii rezonansu magnetycznego (μMRE).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Metodologia elastografii rezonansu magnetycznego w ocenie wzrostu konstruktów inżynierii tkankowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Tradycyjne badania mechaniczne często prowadzą do zniszczenia próbki, a w przypadku długoterminowych badań nad konstruktami z inżynierii tkankowej stosowanie niszczących metod oceny jest nieakceptowalne. Zaproponowaną alternatywą jest wykorzystanie procesu obrazowania zwanego elastografią rezonansu magnetycznego. Elastografia jest nieniszczącą metodą określania efektów inżynieryjnych poprzez pomiar lokalnych wartości właściwości mechanicznych (np. zespolonego modułu ścinania), które są kluczowymi markerami identyfikującymi strukturę i funkcjonalność tkanki. Jako nieinwazyjny środek oceny, monitorowanie konstruktów inżynieryjnych za pomocą technik obrazowania, takich jak obrazowanie rezonansem magnetycznym (MRI), budzi coraz większe zainteresowanie w ciągu ostatniej dekady1. Na przykład techniki rezonansu magnetycznego (MR), takie jak dyfuzja i relaksometria, pozwoliły na scharakteryzowanie zmian właściwości chemicznych i fizycznych podczas rozwoju inżynieryjnej tkanki2. Metoda zaproponowana w poniższym protokole wykorzystuje mikroskopową elastografię rezonansu magnetycznego (μMRE) jako nieinwazyjną technikę opartą na MR do pomiaru właściwości mechanicznych małych tkanek miękkich3. MRE uzyskuje się poprzez sprzęgnięcie sonicznego aktuatora mechanicznego z badaną tkanką i rejestrację propagacji fal ścinających za pomocą skanera MR4. Niedawno μMRE zastosowano w inżynierii tkankowej w celu pozyskania istotnych informacji o wzroście, które tradycyjnie mierzy się za pomocą niszczących makroskopowych technik mechanicznych5. W poniższej procedurze elastografię uzyskuje się poprzez obrazowanie konstruktów inżynieryjnych z wykorzystaniem zmodyfikowanej sekwencji spin-echo Hana sprzężonej z aktuatorem mechanicznym. Jak pokazano na Rysunku 1, zmodyfikowana sekwencja synchronizuje akwizycję obrazu z transmisją zewnętrznych fal ścinających; następnie ruch jest uwrażliwiany poprzez zastosowanie oscylujących par bipolarnych. Po zebraniu obrazów z dodatnią i ujemną sensybilizacją ruchu, zespolone dzielenie danych pozwala uzyskać obraz fali ścinającej. Następnie obraz jest analizowany przy użyciu algorytmu inwersji w celu wygenerowania mapy sztywności ścinania6. Wykazano, że otrzymane pomiary w każdym wokselu silnie korelują (R2>0,9914) z danymi zebranymi za pomocą dynamicznej analizy mechanicznej7. W niniejszym badaniu elastografia została zintegrowana z procesem rozwoju tkanki w celu monitorowania różnicowania ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (hMSC) w konstrukty adipogenne i osteogenne, co przedstawiono na Rysunku 2.
Protokół
1. Przygotowanie konstrukcji tkankowej
Proces przygotowania konstruktu tkankowego składa się z trzech głównych etapów: namnożenia populacji komórek, wysiewu komórek na rusztowanie z biomateriału oraz różnicowania z wykorzystaniem chemicznych cząsteczek sygnałowych. Procedura przygotowania konstruktu opiera się na metodach opracowanych przez Dennis et al., Hong et al. oraz Marion i Mao8,9,10.
- Po wyhodowaniu i namnożeniu linii komórkowej, wysiej ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (hMSCs) na gąbkę żelatynową (średnica 4 mm, grubość 3,5 mm) z gęstością 1x106 komórek/ml dla tworzenia kości oraz 3x106 komórek/ml dla tworzenia tkanki tłuszczowej.
- W celu różnicowania hMSCs w stronę adipocytów, po osiągnięciu przez komórki konfluencji na rusztowaniu, zastosuj pożywkę indukującą adipogenezę składającą się z 1 μM deksametazonu, 0,5 μM izobutylmetylksantyny, 10 μg/ml ludzkiej insuliny rekombinowanej oraz 200 μM indometacyny w pożywce do namnażania komórek. Po trzech dniach wymień pożywkę na pożywkę do namnażania z dodatkiem 10 μg/ml ludzkiej insuliny rekombinowanej na 24 godziny, a następnie powróć do pożywki indukującej. Powtórz ten cykl trzy razy, a następnie wymieniaj pożywkę wyłącznie na pożywkę utrzymującą co dwa dni.
- Aby indukować osteogenezę, przygotuj pożywkę indukującą osteogenezę, uzyskując końcowe stężenie 0,1 μM deksametazonu, 50 μM L-askorbinianu-2-fosforanu oraz 10 mM β-glicero-fosforanu w pożywce do namnażania komórek. Wymieniaj na świeżą pożywkę osteogenną co dwa dni.
2. Charakterystyka siłownika
Charakterystyka siłownika jest kluczowym etapem eksperymentu MRE. Metoda MRE opiera się na propagacji mechanicznych fal ścinających w celu oceny lokalnych wartości właściwości mechanicznych; w związku z tym wibracje mechaniczne te muszą zostać wygenerowane i scharakteryzowane w badanej tkance przy użyciu siłownika piezoelektrycznego. Ilustracyjny przykład procesu charakterystyki przedstawiono na rysunku 3. Celem tej procedury jest optymalizacja ruchu siłownika w celu wygenerowania bezpiecznych fal ścinających o znaczących amplitudach (~250 micron).
- Przed rozpoczęciem eksperymentu należy wprowadzić 0,5% żel agaryzowy do probówki o średnicy 10 mm, aby otoczyć konstrukcję. Temperatura żelu powinna wynosić około 37 °C, aby zminimalizować uszkodzenia konstrukcji.
- Po odczekaniu pięciu minut w temperaturze pokojowej do stężenia żelu agaryzowego, należy wprowadzić końcówkę piezoelektrycznego silnika zginającego w powierzchnię żelu.
- Probówkę zawierającą próbkę i aktuator należy przymocować do sztywnego wspornika, a wiązkę wibrometru laserowego Dopplera skierować na końcówkę aktuatora mechanicznego. Należy dostosować ustawienie systemu w celu optymalizacji sygnału odbitego, w razie potrzeby stosując taśmę refleksyjną.
- W oparciu o oczekiwaną częstotliwość rezonansową aktuatora mechanicznego, należy ustawić generator funkcji na skanowanie pożądanego zakresu częstotliwości (w tym eksperymencie od 20 do 2000 Hz), stosując napięcie robocze 20 Vpp z sygnałem szumu białego.
- Należy przeanalizować charakterystykę widma w programie Polytec Vibrosoft, aby zidentyfikować częstotliwość rezonansową układu, a w programie ustawić FFT oraz prędkość na osi y.
- W celu pomiaru przemieszczenia należy ustawić aktuator tak, aby generował ciągłą sinusoidę o wskazanej częstotliwości rezonansowej przy napięciu roboczym 200 Vpp, a następnie odnotować przemieszczenie przekazywane na powierzchnię żelu. W programie Vibrosoft należy ustawić wyświetlanie FFT z przemieszczeniem na osi y.
3. Pozyskiwanie obrazów
- Po zakończeniu charakterystyki siłownika umieść próbkę i siłownik w centrum skanera MRI. W przypadku eksperymentów z konstruktami tkankowymi należy użyć małej i bardziej czułej cewki RF (w tym eksperymencie 10 mm) do nadawania i odbierania sygnału RF. (Przedstawiona procedura wykorzystuje magnes z pionową szczeliną 9.4 T wyposażony w gradienty trójosiowe, 100 G/cm).
- Wykonaj obraz zwiadowczy (scout image) w celu zidentyfikowania położenia konstruktu.
- Ustaw parametry akwizycji. Typowy skan strzałkowy in vitro będzie miał czas repetycji 1000 ms, czas echa 20-40 ms, grubość warstwy 0.5-1.0 mm oraz pole widzenia 12x10 mm2 przy rozmiarze macierzy 128x128 pikseli.
- W przypadku parametrów elastografii ustaw częstotliwość siłownika na wartość wyznaczoną podczas charakterystyki wibrometrem laserowym Dopplera. W niniejszym badaniu wymagana była jedna para bipolarna z amplitudą gradientu 50 G/cm. Inne parametry do dostrojenia obejmują opóźnienie, które dla początkowej akwizycji powinno zostać ustawione na zero milisekund.
- Przełącz generator funkcji w tryb seryjny (burst mode) i dostosuj jego parametry tak, aby były zgodne z parametrami akwizycji elastografii, w tym częstotliwość i liczbę cykli. Ponadto ustaw generator funkcji na wyzwalanie zewnętrzne.
- Dla obrazu strzałkowego ustaw sensybilizację na ruch w dodatnim kierunku warstwy i rozpocznij skanowanie. Po akwizycji sprawdź obraz i zmień sensybilizację na ujemny kierunek warstwy.
- Uruchom program MATLAB, który wykona dzielenie zespolone w celu wygenerowania obrazu fali poprzecznej.
- Oceń obraz pod kątem obecności fal poprzecznych oraz możliwych artefaktów, takich jak zawijanie fazy (phase wrapping).
- Jeśli korekty obrazu nie są konieczne, dostosuj rozmiar tablicy parametrów do ośmiu równomiernie rozmieszczonych wartości w zakresie od zera sekund do pełnego okresu wyznaczonej częstotliwości rezonansowej.
- Wykonaj skan w orientacji warstwy dodatniej i ujemnej.
- Po pozyskaniu obrazów użyj programu MATLAB zaprojektowanego do generowania danych o fali poprzecznej z serii obrazów.
4. Przetwarzanie obrazów z eksperymentu MRE
- Ostatnim krokiem MRE jest obliczenie sztywności ścinania na podstawie obrazów fal ścinających. Następnie wprowadza się dane do programu MATLAB, który przeanalizuje trójwymiarowy zestaw danych (2 przestrzenne, 1 czasowe).
Uwaga: Przy założeniu płaskiej fali poprzecznej równania ruchu ulegają rozdzieleniu, co pozwala na oszacowanie zespolonego modułu ścinania jako funkcji przemieszczenia i jego laplasjanu. Algorytm przybliża drugie pochodne przestrzenne za pomocą różnic skończonych i oblicza moduł ścinania dla każdego piksela z osobna. Z tej liczby zespolonej można wyprowadzić wiele parametrów mechanicznych, takich jak prędkość fali poprzecznej, tłumienie fali, sztywność ścinania, sprężystość ścinania, lepkość ścinania itp. Algorytm umożliwia również wybór obszarów zainteresowania, dla których obliczane jest średnie i odchylenie standardowe każdego parametru.
- Parametry obrazowania należy określić na początku programu. Dodatkowo można dostosować górną granicę elastogramu, aby zoptymalizować kontrast w próbce.
Uwaga: Program dostarcza wyniki pośrednie (falę po filtrach dolnoprzepustowych, falę po filtrowaniu kierunkowym, czasową transformatę FFT, profile liniowe itp.), które pomagają użytkownikowi ocenić wierność odzyskiwania danych.
- Niektóre parametry można dostosować na podstawie tych informacji, np. poziomy filtrów dolnoprzepustowych, częstotliwość czasową ruchu, kierunek propagacji fali itp. Odchylenie standardowe parametru w konkretnym obszarze zainteresowania jest również wskaźnikiem jakości obliczeń.
5. Reprezentatywne wyniki
Rysunek 4 przedstawia zmiany właściwości mechanicznych w ciągu czterech tygodni rozwoju konstruktów osteogennych i adipogennych. MRE przeprowadzono w zakresie 730-820 Hz. Choć obie zasiane gąbki startowały z poziomu około 3 kPa, tkanki kierowane w stronę osteogenną osiągnęły sztywność 22 kPa, podczas gdy w przypadku tkanek kierowanych w stronę adipogenną sztywność spadła do 1 kPa. Co więcej, konstrukty osteogenne wykazały znaczny spadek rozmiaru w porównaniu stanu początkowego do końcowego badania. Dodatkowe właściwości wynikające z badania elastograficznego przedstawiono w Tabeli 1.
Rysunek 1. Proces akwizycji obrazów w elastografii rezonansu magnetycznego. Podczas akwizycji obrazu sekwencja impulsów (a) steruje synchronizacją (b) generatora funkcji z impulsami gradientów bipolarnych skanera MRI. Po akwizycji gradientów bipolarnych przełączanych w orientacjach dodatniej i ujemnej, (c) obraz fali ścinającej jest generowany przy użyciu dzielenia zespolonego.
Rysunek 2. Schemat procesu MRE dla konstruktów z inżynierii tkankowej. Najpierw komórki (a) są hodowane i namnażane do wielkości populacji niezbędnej dla projektowanego badania. Następnie komórki są wysiewane (b) na rusztowanie z biomateriału i stosuje się odczynniki chemiczne w celu indukcji różnicowania. Rusztowania są charakteryzowane metodą MRE, której pierwszym krokiem (c) jest wyznaczenie częstotliwości rezonansowej aktuatora sprzężonego z konstruktem. Następnie pozyskiwane są obrazy MRI (d) w celu wygenerowania obrazu fali poprzecznej (e). Na koniec stosuje się algorytm w celu uzyskania elastogramu (f), który mapuje sztywność konstruktu. Równolegle konstrukty są przecinane w celu oceny histologicznej (g), aby potwierdzić różnicowanie.
Rysunek 3. Procedura charakterystyki siłownika. Rusztowanie żelatynowe jest zamknięte w 0,5% żelu agarozowym. Aby scharakteryzować ruch przenoszony do próbki, do układu wysyłany jest najpierw szum biały (1a), a powstały ruch jest wykrywany za pomocą laserowego wibrometru dopplerowskiego (1b). Po określeniu częstotliwości rezonansowej, wysyłany jest ciągły sygnał sinusoidalny o częstotliwości rezonansowej (2a), aby określić przemieszczenie (2b) przeniesione do środowiska żelatynowego.
Rysunek 4. Mapa rozwoju konstruktów w okresie czterech tygodni. Konstrukty adipogenne (A) i osteogenne (O) przedstawiono od lewej do prawej wraz z odpowiadającymi im obrazami amplitudy i fali poprzecznej, elastogramem oraz średnią sztywnością ścinania. Mapa kolorów elastogramu odpowiada schematowi kolorystycznemu wykresu słupkowego, a słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe w obrębie obszaru zainteresowania każdego konstruktu.
Tabela 1. Właściwości mechaniczne konstruktów tłuszczowych i kostnych w czterotygodniowym okresie wzrostu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszej procedurze zaprezentowano proces MRE dla konstruktów inżynierii tkankowej, od przygotowania komórek po generowanie elastogramu. Dzięki zastosowaniu nieniszczącej metody oceny mechanicznej w procesie inżynierii tkankowej możliwe jest obecnie ocenianie zmian w konstruktach na wielu etapach ich rozwoju. Ponadto MRE uzupełnia inne metody MR służące do monitorowania konstruktów inżynierii tkankowej, takie jak dyfuzja, transfer magnetyzacji oraz analiza przesunięcia chemicznego1.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Badania te były częściowo wspierane przez NIH RO3-EB007299-02 oraz NSF EPSCoR First Award.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Zestaw MSCGM-Bullet | Odczynnik | Lonza Inc. | PT-3001 | Przechowywać w 4°C |
| 1X DPBS | Odczynnik | Invitrogen | 21600-010 | |
| 0,05% Trypsyna-EDTA | Odczynnik | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | Przechowywać w -20°C |
| Deksametazon | Odczynnik | Sigma-Aldrich | D2915 | |
| 3-izobutyl-1-metyloksantyna | Odczynnik | Sigma-Aldrich | I5879 | Przechowywać w -20°C |
| Insulina z trzustki bydlęcej | Odczynnik | Sigma-Aldrich | I6634 | Przechowywać w -20°C |
| Indometacyna | Odczynnik | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Β-glicerynian | Odczynnik | Sigma-Aldrich | G9891 | |
| L-Kwas askorbiniowy 2-fosforan | Odczynnik | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Gelfoam | Rusztowanie | Pharmacia Corporation (Pfizer) | 09-0315-08 | |
| Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste | Linia komórkowa | Lonza Inc. | PT-2501 | |
| Skaner MR 9.4T | Urządzenie | Agilent Technologies | 400MHz WB | |
| Cewka Litz 10mm | Urządzenie | Doty Scientific | ||
| Laserowy wibrometr dopplerowski | Urządzenie | Polytec | PDV-100 | |
| Vibrosoft (20) | Oprogramowanie | Polytec | ||
| Generator funkcji | Urządzenie | Agilent Technologies | AFG 3022B | |
| Wzmacniacz | Urządzenie | Piezo Inc. | EPA-104-115 | |
| Piezoelektryczny silnik zginający | Urządzenie | Piezo Inc. | T234-A4Cl-203X | |
| Komputer-Linux | Urządzenie | Intel | Procesor: Intel Core 2 Duo E8400, Pamięć: 2G | |
| Komputer-Windows | Urządzenie | Intel | Procesor: Intel Core 2 Duo E8400, Pamięć: 2G | |
| MATLAB | Oprogramowanie | Mathworks | 2009b |
Bibliografia
- Xu, H., Othman, S. F., Magin, R. L. Monitoring tissue engineering using magnetic resonance imaging. J. Biosci. Bioeng. 106, 515-527 (2008).
- Xu, H., Othman, S. F., Hong, L., Peptan, I. A., Magin, R. L. Magnetic resonance microscopy for monitoring osteogenesis in tissue-engineered construct in vitro. Phys. Med. Biol. 51, 719-732 (2006).
- Othman, S. F., Xu, H., Royston, T. J., Magin, R. L. Microscopic magnetic resonance elastography (microMRE. Magn. Reson. Med. 54, 605-615 (2005).
- Muthupillai, R., Lomas, D. J., Rossman, P. J., Greenleaf, J. F., Manduca, A., Ehman, R. L. Magnetic resonance elastography by direct visualization of propagating acoustic strain waves. Science. 269, 1854-1857 (1995).
- Othman, S. F., Curtis, E. T., Plautz, S. A., Pannier, A. P., Xu, H. Magnetic resonance elastography monitoring of tissue engineered constructs. NMR Biomed. , Forthcoming (2011).
- Oliphant, T. E., Manduca, A., Ehman, R. L., Greenleaf, J. F. Complex-valued stiffness reconstruction for magnetic resonance elastography by algebraic inversion of the differential equation. Magn. Reson. Med. 45, 299-310 (2001).
- Ringleb, S. I., Chen, Q., Lake, D. S., Manduca, A., Ehman, R. L., An, K. Quantitative shear wave: comparison to a dynamic shear material test. Magn. Reson. Med. 53, 1197-1201 (2005).
- Hong, L., Peptan, I., Clark, P., Mao, J. J. Ex vivo adipose tissue engineering by human marrow stromal cell seeded gelatin sponge. Ann. Biomed. Eng. 33, 511-517 (2005).
- Dennis, J. E., Haynesworth, S. E., Young, R. G., Caplan, A. I. Osteogenesis in marrow-derived mesenchymal cell porous ceramic composites transplanted subcutaneously: effect of fibronectin and laminin on cell retention and rate of osteogenic expression. Cell Transplant. 1, 23-32 (1992).
- Marion, N. W., Mao, J. J. Mesenchymal stem cells and tissue engineering. Methods Enzymol. 420, 339-361 (2006).
- Rydberg, J., Grimm, R., Kruse, S., Felmlee, J., McCracken, P., Ehman, R. L. Fast spin-echo magnetic resonance elastography of the brain. Proceedings of the International Society of Magnetic Resonance in Medicine, Glasgow, Scotland, , 1647-1647 (2001).
- Kruse, S. A., Grim, R. C., Lake, D. S., Manduca, A., Ehman, R. L. Fast EPI based 3D MR elastography of the brain. Proceedings of the International Society for Magnetic Resonance in Medicine, Seattle, Washington, , 3385-3385 (2006).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
