Jednoczesna rejestracja sygnałów wapniowych z zidentyfikowanych neuronów i zachowań żerowania Drosophila melanogaster

Podsumowanie

Muszka owocówka, Drosophila melanogaster, wysuwa swój trąbek w celu żerowania w odpowiedzi na bodziec cukrowy działający na trąbek lub tarsus. Połączyłem obserwacje reakcji wysuwania trąbka (PER) z techniką obrazowania wapnia, co pozwala nam monitorować aktywność neuronów w mózgu równocześnie z obserwacją behawioralną.

Streszczenie

Aby badać sieci neuronalne pod kątem ich funkcji w zachowaniu, musimy przeanalizować sposób działania neuronów podczas generowania każdego wzorca behawioralnego. Zatem jednoczesne rejestrowanie aktywności neuronalnej i zachowania jest niezbędne do skorelowania aktywności mózgu z zachowaniem. Do takich analiz behawioralnych muszka owocówka, Drosophila melanogaster, pozwala nam na wprowadzenie genetycznie kodowanych wskaźników wapnia, takich jak GCaMP¹, w celu monitorowania aktywności neuronalnej, oraz na zastosowanie zaawansowanych manipulacji genetycznych w technikach optogenetycznych lub termogenetycznych, aby specyficznie aktywować zidentyfikowane neurony^2-5. Zastosowanie techniki termogenetycznej pozwoliło nam zidentyfikować kluczowe neurony odpowiedzialne za zachowanie żerowania (Flood et al., w trakcie recenzji). Jako główny element zachowania żerowania, dorosła mucha Drosophila wysuwa trąbkę w celu pobrania pokarmu⁶ (reakcja wysuwania trąbki; PER), reagując na słodki bodziec z komórek sensorycznych znajdujących się na trąbce lub tarsach. Łącząc protokół dla PER⁷ z techniką obrazowania wapnia⁸ przy użyciu GCaMP3.0^{1, 9}, opracowałem system eksperymentalny, w którym możemy monitorować aktywność neuronów w centrum żerowania – zwoju pod przełykowym (SOG), jednocześnie prowadząc obserwację behawioralną trąbki. Zaprojektowałem urządzenie („Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage”: „FLIES”), które mieści dorosłą muchę Drosophila, umożliwiając swobodny ruch trąbki podczas gdy mózg jest wystawiony na kąpiel do obrazowania Ca²⁺ za pomocą obiektywu imersyjnego. System FLIES nadaje się również do wielu rodzajów eksperymentów na żywych mózgach much, takich jak rejestracja elektrofizjologiczna czy obrazowanie morfologii synaptycznej w trybie time-lapse. Ponieważ wyniki z obrazowania na żywo mogą być bezpośrednio skorelowane z jednoczesnym zachowaniem PER, metodologia ta może stanowić doskonały system eksperymentalny do badania przetwarzania informacji w sieciach neuronalnych oraz tego, jak ta aktywność komórkowa jest powiązana z procesami plastyczności i pamięcią.

Protokół

1. Konstrukcja FLIES

1. Uformuj platformę z pokrywki szalki Falcon 35 mm, topiąc ściankę boczną i wycinając ją tak, aby uzyskać odpowiedni kąt i grubość (Rysunek 1a; Rysunek 2). Wywierć w platformie otwór na głowę muchy (Rysunek 1a,b), w taki sposób, aby części gębowe były swobodnie wystawione na zewnątrz komory (Rysunek 1a). Odetnij koniec końcówki Pipetman, dobierając rozmiar odpowiednio do obserwowanej muchy. Przyklej końcówkę do platformy, jak pokazano na Rysunku 1a, aby ukończyć urządzenie FLIES (Rysunek 2).

2. Przygotowanie muchy do obserwacji

1. Jeśli wymagane jest głodzenie, należy głodzić dorosłą muchę przez 24 godziny w temperaturze 25 °C przed eksperymentem, umieszczając ją w fiolce zawierającej jedynie wilgotny ręcznik papierowy.
2. Należy znieczulić muchę, umieszczając ją w plastikowej probówce o pojemności 15ml stojącej na lodzie.
3. Za pomocą pincety należy wsunąć muchę do komory urządzenia FLIES i delikatnie ją docisnąć, aż przestanie się poruszać. Następnie należy włożyć korek, aby utrzymać muchę na miejscu (Rysunek 1a,b).
4. Należy uszczelnić części proksymalne trąbki (rostrum) przylegające do wewnętrznej krawędzi otworu; od zewnątrz należy nanieść niewielką ilość utwardzanego światłem kleju (Tetric EvoFlow) na boki oraz powyżej rostrum (strzałki na Rysunku 3). Klej należy nanieść również od wewnątrz urządzenia FLIES w przestrzeni między grzbietową częścią głowy a wewnętrzną krawędzią otworu (Rysunek 1b). Aby umożliwić swobodne poruszanie się rostrum, należy zachować ostrożność, aby klej nie dotknął rostrum, używając do jego rozprowadzenia rzęsy (lub czegoś podobnego). Na koniec należy utwardzić klej, stosując najsłabsze naświetlanie światłem niebieskim wystarczające do polimeryzacji, aby uniknąć uszkodzenia muchy w wyniku nadmiernego nagrzania. Następnie należy usunąć korek.
5. W celu stabilizacji głowy muchy można zastosować nitkę do utrzymania rostrum w częściowo uniesionej pozycji (strzałka na Rysunku 3), co zapobiega uderzaniu części gardzielowej o SOG i odsłania brzuszną część SOG, szczególnie podczas obrazowania terminali presynaptycznych neuronów Gr5a⁸, które są przykryte częścią gardzieli przy całkowicie wciągniętej trąbce.
6. Powierzchnię platformy należy wypełnić bezzcukrowym roztworem soli zawierającym (w mM): NaCl 140; KCl 2; MgCl₂ 4,5; CaCl₂ 1,5 oraz HEPES-NaOH 5 o pH 7,1¹⁰. Ten roztwór soli pozbawiony sacharozy ma toniczność zbliżoną do powszechnie stosowanych roztworów zawierających sacharozę, takich jak HL3.1¹¹.
7. Torebkę głowy należy otworzyć za pomocą ostrza wolframowego i pincety z zaostrzonymi końcówkami działającymi jak nożyczki, która jest urządzeniem wykonanym na zamówienie, pierwotnie zaprojektowanym przez dr. Kageyukiego Yamaokę z Japonii, służącym do odcinania kutykuli i tchawki w celu odsłonięcia SOG (Rysunek 4). Brzuszna krawędź kutykuli głowy powinna zostać wycięta jak najdalej brzusznie, podczas gdy cięcie krawędzi grzbietowej nie było tak krytyczne. Najpierw należy wykonać nacięcie przez krawędź tylną za pomocą ostrza wolframowego. Następnie należy przeciąć krawędzie boczne i przednie za pomocą zaostrzonej pincety. Wycięty fragment kutykuli należy unieść pincetą i usunąć. Czułki oraz nerwy czułkowe należy wyciąć zaostrzoną pincetą.
8. Aby uniknąć artefaktów ruchowych podczas pomiarów, mózg musi zostać ustabilizowany poprzez usunięcie niektórych części muchy. Najpierw należy selektywnie usunąć worki powietrzne między SOG a kutykulą. Należy przeciąć przełyk na końcu w stronę gardzieli oraz na końcu wchodzącym do SOG, aby usunąć połączenie między gardzielą a mózgiem. Następnie należy wyciągnąć mięsień 16¹², a na koniec oddzielić wszystkie tchawki łączące mózg z kutykulą.
9. Urządzenie FLIES ustawiamy na stoliku mikroskopu Olympus BX51WI połączonego z konfokalnym systemem mikroskopowym z dyskiem obrotowym (Improvision w PerkinElmer) (Rysunek 5). Obiektyw imersyjny w wodzie, np. 40X/0.8 N.A, zanurza się w kąpieli (Rysunek 6).

3. Obrazowanie Ca²⁺ w mózgu

1. Obrazowanie Ca²⁺ z wykorzystaniem GCaMP3.0^{1, 9} przeprowadzono metodą opracowaną przez Marella et al.⁸ (Rysunek 6). Używając konfokalnego mikroskopu z dyskiem obrotowym (Improvision), wykonano pojedynczy przekrój optyczny z częstotliwością 4Hz i czasem ekspozycji 122ms przy użyciu lasera wzbudzającego o długości fali 491nm, skupiając się na obszarze zainteresowania (ciele neuronu ruchowego, neuronie pośredniczącym lub zakończeniach presynaptycznych neuronów sensorycznych smaku) za pomocą oprogramowania Velocity, wersja 4.3 (Improvision).

4. Stymulacja trąbki

1. Naciągnij 100mM wodny roztwór sacharozy do igły hipodermicznej z małym knotem (wykonanym z japońskiego papieru Washi, patrz Tabela specyficznych odczynników) wystającym z końcówki (Rycina 7).
2. Wypuść małą kroplę roztworu sacharozy na knot, a następnie ją wciągnij, bezpośrednio przed przyłożeniem nasączonego knotu z papieru Washi do końcówki trąbki. Knot z papieru Washi należy przyłożyć tylko na chwilę, aby uniknąć nasycenia (Rycina 8). Monitoruj zachowanie odruchu wysuwania trąbki (Proboscis Extension Response, PER) za pomocą kamery CCD przymocowanej do mikroskopu sekcyjnego (Rycina 5) równocześnie z obrazowaniem Ca²⁺. Dane należy zebrać w ciągu jednej godziny od rozpoczęcia sekcji, ponieważ w tych warunkach odruch PER nie utrzymuje się dłużej niż godzinę.

5. Reprezentatywne wyniki

Zgłoszono, że motoneurony mięśni protraktorów rostrum – pary głównych mięśni odpowiedzialnych za unoszenie rostrum w celu wysunięcia trąbki – wykazują silne reakcje na bodźce słodkie¹³. Rysunek 9 przedstawia sygnały Ca²⁺ za pośrednictwem GCaMP3.0^{1, 9} wyrażanego przez sterownik Gal 4, E49¹³, w ciele komórkowym motoneuronu. Jak pokazano na wideo, zaobserwowano silną PER synchronicznie ze wzrostem sygnału Ca²⁺.

Rycina 1. Schemat platformy do obrazowania na żywo i elektrofizjologii mózgu muchy (FLIES). a, Platforma FLIES jest skonstruowana w taki sposób, aby kąt ścianki umożliwiał proste wysunięcie głowy muchy. Trzy segmenty trąbki muchy są oznaczone kolorami; rostrum jest magenta. Mucha jest wprowadzana do komory za pomocą pęsety, a odcięty fragment końcówki Pipetmana jest wkładany do tylnej części komory, aby zapobiec ucieczce muchy. b, Otwór jest wywiercony tak, aby dopasować go do głowy muchy. Pozostałe szczeliny są uszczelniane utwardzanym światłem klejem, zgodnie z oznaczeniem, aby zapewnić brak przecieków. Po utwardzeniu kleju fragment końcówki Pipetmana służący jako korek zostaje usunięty. Do układu FLIES wlewa się sól fizjologiczną w taki sposób, aby powierzchnia mózgu była całkowicie pokryta. Należy upewnić się, że sól fizjologiczna nie wycieka na przedni koniec głowy muchy. Zacieniowany obszar otoczony przerywaną linią na panelu b pokazuje część przeznaczoną do wycięcia podczas sekcji.

Rycina 2. Fotografia MUCH. Ścianka z kleju (z pistoletu do kleju) w kształcie półksiężyca służy do kontrolowania przepływu roztworu soli fizjologicznej podczas perfuzji oraz do zmniejszenia ilości zużytego roztworu.

Rycina 3. Widok z przodu muchy zamontowanej w FLIES. Na tym obrazie przedstawiono sposób osadzenia muchy w urządzeniu FLIES oraz sposób aplikacji utwardzanego światłem kleju wokół głowy muchy (strzałki) w celu utworzenia szczelnej bariery odpornej na sól fizjologiczną. Jeśli jakakolwiek sól fizjologiczna przedostanie się do trąbki muchy, eksperyment zakończy się niepowodzeniem. Nitka (groty strzałek) przymocowana do stolika służy do utrzymania trąbki w odpowiedniej pozycji, aby nie została ona całkowicie wciągnięta. W przeciwnym razie blokowałaby ona bardziej brzuszna część SOG i powodowała artefakty ruchowe.

Rysunek 4. Widok z góry na muchy z przeprowadzonym rozcięciem. Na obrazie przedstawiono odsłonięty SOG muchy po usunięciu kutykuli. Przełyk, mięsień 16 i tchawki połączone z mózgiem, a także wybrane pęcherzyki powietrzne zostały również usunięte, aby zapobiec przeszkadzaniu w badaniu mózgu, co mogłoby prowadzić do powstania artefaktów w sygnałach wapniowych.

Rysunek 5. Aparatura monitorująca. Aparatura ta składa się z mikroskopu Olympus BX51WI połączonego z systemem konfokalnego mikroskopu z dyskiem obrotowym (Improvision) oraz zamontowanego z boku mikroskopu Nikon SMZ800. Taki układ umożliwia obrazowanie na żywo aktywności mózgu podczas zachowań PER.

Rycina 6. Zdjęcia przedstawiające widok z boku FLIES. Cienka warstwa roztworu soli fizjologicznej znajduje się pomiędzy obiektywem imersyjnym w wodzie 40X a muchą.

Rycina 7. Schemat wykonania knota z papieru Washi. Papier Gampi-Washi to tradycyjny japoński pergamin, który jest niezwykle cienki i gładki (Haibara, Japonia). Jest on również bardzo wytrzymały i może zatrzymać dużą ilość cieczy. Papier Washi należy wyciąć w kształt trapezu o bardzo konkretnych wymiarach: szerokości 0,3 mm i 0,7 mm oraz długości 4-5 mm (a). Trapez ten jest następnie wsuwany stroną 0,7 mm do końcówki igły hipodermicznej 23 G i może zostać ustabilizowany poprzez włożenie szpilki entomologicznej, zgiętej w kształt litery V (b). c, Papier Washi staje się przezroczysty po wystawieniu na działanie cieczy, co czyni go idealnym do tego eksperymentu.

Rycina 8. Stymulacja trąbki much na systemie FLIES za pomocą knotka z papieru Washi. Knotek z papieru Washi umieszczony na końcówce igły hipodermicznej jest przykładany na krótką chwilę przy użyciu manipulatora typu Joystick obsługiwanego jedną ręką. Igła jest połączona za pomocą elastycznej rurki z injektorem obsługiwanym drugą ręką, służącym do zasysania i podawania roztworu sacharozy.

Rycina 9. Reprezentatywne wyniki. a, zachowanie PER zarejestrowane za pomocą kamery CCD zainstalowanej na stereomikroskopie. Widoki frontalne głodnej muchy z wysuniętą proboscis (strzałki) przed stymulacją, w trakcie stymulacji oraz po stymulacji knotem zawierającym 100 mM wodny roztwór sacharozy (grot strzałki). Oświetlenie zapewnia laser 491 nm używany do fluorescencji GCaMP. b, odpowiedź GCaMP 3.0 indukowana sacharozą w neuronie ruchowym mięśnia protraktora rostrum w stanie głodu. Górny panel: przed stymulacją; dolny panel: bezpośrednio po stymulacji. Pasek skali: 10 μm. c, kwantyfikacja odpowiedzi GCaMP 3.0 indukowanej sacharozą. Neuron ruchowy reaguje na bodziec w postaci sacharozy gwałtownym wzrostem fluorescencji, po którym następuje trwająca kilka sekund faza powrotu do poziomu bazowego.

Dyskusja

Układ FLIES umożliwia jednoczesną rejestrację sygnałów Ca²⁺ oraz zachowania PER. Nawet przy mózgu eksponowanym na sól fizjologiczną obserwowano prawidłowe zachowanie PER. Zastosowanie knota z papieru Gampi-Washi zamiast knota z chusteczki Kimwipe, stosowanego w oryginalnej metodzie kapilarnej7, ułatwia uzyskanie wysoce powtarzalnego i stabilnego zachowania PER oraz eliminuje konieczność nabywania wprawy w tworzeniu i wyborze odpowiedniego knota z Kimwipe. Powyższe wskazówki eksperymentalne pozwoliły nam skutecznie uniknąć zakłóceń spowodowanych ruchami trąbki, co doprowadziło do bardzo stabilnej rejestracji sygnałów Ca²⁺ przy niskim poziomie szumów. Sporadycznie usuwanie tkanek było niewystarczające, aby odpowiednio odsłonić komórki lub stłumić ruchy, co prowadziło do słabych wyników. Jednak po nabyciu odpowiednich umiejętności, ponad 80 % preparatów dawało dobre wyniki. Metodologia ta nie służy wyłącznie do obrazowania Ca²⁺, ale może zostać dostosowana do każdego rodzaju obrazowania żywych komórek przy jednoczesnej obserwacji zachowania PER. Na przykład, możemy uzyskać dostęp do dowolnej komórki za pomocą elektrody w celu bezpośredniej rejestracji aktywności. W połączeniu z mikroskopią dwufotonową jesteśmy w stanie przeprowadzić obrazowanie poklatkowe struktury synaptycznej, którą można powiązać ze zmianami behawioralnymi. Zatem ta metoda obrazowania mózgu z obserwacją behawioralną jest cenna nie tylko dla funkcjonalnej analizy sieci neuronalnej, ale może służyć jako potężne narzędzie do korelacji plastyczności synaptycznej¹⁴ z mechanizmami leżącymi u podstaw pamięci.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Tetric EvoFlow	Ivoclar vivadent	M04115	Klej utwardzany światłem
Mikroskop BX51WI	Olympus Corporation	BX51WI	Z obiektywem imersyjnym wodnym 40X (N.A. 0.8)
System konfokalnego mikroskopu z dyskiem obrotowym	PerkinElmer, Inc.		Z laserem 491 nm
Stereomikroskop	Nikon Instruments	SMZ-800	Zamocowany do wysięgnika. Widok stereo dostępny podczas nagrywania wideo
Papier Gampi-Washi	Haibara, Japonia		Specjalny rodzaj tradycyjnego papieru japońskiego
Kamera CCD	Imaging Source	DFK41AU02	1/2" 1080 × 960 pikseli SONY CCD
Manipulator z joystickiem	Narishige International	MN-151
Iniektor	Narishige International	IM-5B