Przesiewy wysokoprzepustowe i niskoprzepustowe z wykorzystaniem nicieni korzeniowych Meloidogyne spp.

Podsumowanie

Opisano dwie odrębne metody przesiewania roślin pod kątem infekcji nicielami okrągłymi (nematodami) tworzącymi narośla korzeniowe. Opisane podejścia obejmują wysokoprzepustowe badania z użyciem nematod w sposób niedestrukcyjny, co ułatwia wykorzystanie tych roślin w programach hodowlanych.

Streszczenie

Nematody galasowe (rodzaj Meloidogyne) są obligatoryjnymi pasożytami roślin. Są one niezwykle polifagiczne i uznawane za jedne z najważniejszych ekonomicznie nematod pasożytniczych roślin. Mikroskopijna larwa drugiego stadium (J2), która przeszła jedno linienie wewnątrz jaja, stanowi stadium infekcyjne. Larwy J2 wykluwają się z jaj, przemieszczają się swobodnie w glebie w warstwie wody i lokalizują wierzchołki korzeni odpowiednich gatunków roślin. Po wniknięciu do korzenia rośliny migrują w stronę cylindra naczyniowego, gdzie tworzą miejsce żerowania i rozpoczynają pobieranie pokarmu za pomocą stylletów. Wielokomórkowe miejsce żerowania składa się z kilku powiększonych komórek wielojądrowych, zwanych „komórkami olbrzymimi”, które powstają z komórek przechodzących kariokinezę (powtarzającą się mitozę) bez cytokinezy. Sąsiednie komórki perycyklu dzielą się i zwiększają swoją objętość, co prowadzi do powstania typowej gali lub narośli korzeniowej, będącej charakterystycznym objawem infekcji nematodami galasowymi. Po rozpoczęciu żerowania larwy J2 stają się osiadłe i przechodzą trzy kolejne linienia, aby osiągnąć stadium dorosłe. Dorosła samica składa 150-250 jaj w galaretowatej macierzy na powierzchni lub poniżej powierzchni korzenia. Z jaj wykluwają się nowe infekcyjne larwy J2 i rozpoczynają nowy cykl. Cykl życiowy nematody galasowej dopełnia się w ciągu 4-6 tygodni w temperaturze 26-28°C.

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy tradycyjny protokół zakażania roślin uprawianych w doniczkach nicien korzeniakami oraz dwie metody służące do analiz wysokoprzepustowych. Pierwsza metoda wysokoprzepustowa jest stosowana w przypadku roślin o małych nasionach, takich jak pomidor, natomiast druga dotyczy roślin o dużych nasionach, takich jak vines i fasola zwyczajna. Duże nasiona umożliwiają przedłużony wzrost siewek przy minimalnej suplementacji składników odżywczych. Pierwsza analiza wysokoprzepustowa wykorzystuje siewki hodowane w piasku w tackach, natomiast w drugiej analizie rośliny są hodowane w woreczkach bez użycia gleby. Woreczek do wzrostu siewek wykonany jest z papierowego knota o wymiarach 15,5 x 12,5cm, złożonego u góry w celu utworzenia rynienki o głębokości 2 cm, w której umieszcza się nasiono lub siewkę. Papierowy knot znajduje się wewnątrz przezroczystego plastikowego woreczka. Takie woreczki umożliwiają bezpośrednią obserwację objawów infekcji nicieniowskiej, powstawania narośli korzeniowych oraz produkcji mas jaj pod powierzchnią przezroczystego opakowania. Obie metody pozwalają na wykorzystanie przesiewanych roślin po fenotypowaniu do krzyżowania lub produkcji nasion. Dodatkową zaletą stosowania woreczków do wzrostu jest niewielkie zapotrzebowanie na przestrzeń, ponieważ woreczki są przechowywane w plastikowych wiszących teczkach rozmieszczonych w regałach.

Protokół

1. Wzrost siewek pomidora w doniczkach i tackach

1. W przypadku testów doniczkowych nasiona pomidora wysiewa się do pojedynczej doniczki w glebie bogatej w materię organiczną, takiej jak Sunshine mix. Rośliny należy utrzymywać w szklarni w temperaturze 22-28°C. Po wykiełkowaniu rośliny nawozi się raz w tygodniu preparatem Miracle-Gro.
2. Około dwóch tygodni po wykiełkowaniu, w stadium dwóch liści właściwych, siewki przesadza się pojedynczo do doniczek (o średnicy 10 cm i głębokości 17 cm) wypełnionych sterylną glebą piaszczystą składającą się w 90% z piasku i w 10% z mieszanki organicznej. Należy dodać nawóz o spowolnionym uwalnianiu Osmocote i utrzymywać rośliny w szklarni w temperaturze 22-28°C przez dwa tygodnie. Następnie należy kontynuować nawożenie roślin raz w tygodniu preparatem Miracle-Gro.
3. W przypadku przesiewów wysokoprzepustowych nasiona wysiewa się bezpośrednio do tacek w glebie piaszczystej, przykrywa tackę folią spożywczą do momentu wykiełkowania i utrzymuje w warunkach opisanych powyżej. Po wykiełkowaniu dodaje się nawóz o spowolnionym uwalnianiu Osmocote i nawozi rośliny raz w tygodniu preparatem Miracle-Gro.

2. Wzrost rośliny wilczego bobu w woreczkach do siewek

1. Nasiona są albo kiełkowane w szalce Petri wyścielonej kilkoma warstwami papieru Kimwipe, a następnie przenoszone pojedynczo do woreczków, albo umieszczane bezpośrednio w papierowej bruździe woreczka i tam kiełkowane.
2. Woreczki umieszcza się w plastikowych wiszących teczkach, po dwa w każdej, a teczki układa się pionowo w regale. Regal należy umieścić w komorze z kontrolowanym środowiskiem, utrzymując temperaturę 25-28 °C oraz cykl 16 h światła / 8 h ciemności. Regały można również utrzymywać w szklarni, jednak wymagają one przykrycia folią lub sztywnym papierem z obu stron łodyg roślin, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia grzybami.
3. Woreczki należy podlewać raz lub dwa razy dziennie wodą z odwróconej osmozy. Około 10 do 14 dni po wysiewie, gdy rozwinie się odpowiedni system korzeniowy z wierzchołkami korzeni trzeciorzędowych (Rysunek 1), siewki są gotowe do inokulacji.

3. Ekstrakcja jaj nicieni

Ekstrakcja jaj z zainfekowanych korzeni została zmodyfikowana na podstawie protokołu opracowanego przez Hussey i Barkera (1973).

1. Na trzy do czterech dni przed inokulacją nicieniami, wyekstrahuj jaja nicieni korzeniowych z zainfekowanych korzeni pomidora. Przed rozpoczęciem ekstrakcji jaj dokładnie umyj obszar roboczy gorącą wodą, aby uniknąć kontaminacji. W gorącej wodzie umyj również blender, dwa wiadra, wspornik z drucianej siatki, gumowy młotek, trzy sita o oczkach 425, 90 i 25 μm, cylinder miarowy oraz nożyczki.
2. Ułóż sita jedno na drugim w następującej kolejności (od góry do dołu): 425, 90 i 25 μm. Jaja zostaną zebrane na dolnym sicie o oczkach 25 μm. Umieść sita na wsporniku z drucianej siatki w zlewie. Pod siatką ustaw wiadro, aby zbierać przefiltrowany roztwór.
3. Odetnij i wyrzuć wierzchołki zainfekowanej rośliny (roślin), służącej jako źródło inokulum. Ostrożnie wyjmij roślinę z doniczki. Umyj korzenie, zanurzając je w plastikowym wiadrze wypełnionym wodą. Płucz korzenie dalej pod bieżącą wodą, aż cząstki gleby zostaną z nich całkowicie usunięte.
4. Pokrój korzenie nożyczkami na małe kawałki. Usuń korzeń palowy.
5. Umieść posiekane korzenie z jednej rośliny w dużym plastikowym słoiku z pokrywką, dodaj niewielką ilość 10% roztworu wybielacza, aby przykryć korzenie, i zamknij pokrywkę.
6. Wstrząsaj słoikiem z korzeniami przez 2 min.
7. Otwórz słoik i wlej korzenie na górne sito, a następnie przemyj je wężem z zamontowaną dyszą rozpylającą. Płucz dokładnie, aż całkowicie zniknie zapach wybielacza. Użyj młotka, aby opukać boki sit, zapobiegając zapychaniu się oczek.
8. Zdejmij górne sito i wypłucz zanieczyszczenia pozostałe na drugim sicie.
9. Zdejmij drugie sito i zbierz z ostatniego sita drobne zanieczyszczenia, w których znajdują się jaja. Delikatnym strumieniem wody z butelki przesuń zanieczyszczenia na jedną stronę sita. Zbierz zanieczyszczenia i jaja do czystego zlewki z minimalną ilością wody.
10. Przefiltruj jeszcze raz wodę zebraną w wiadrze przez sito 25 μm, aby zebrać ewentualne jaja, które mogły przejść. Dokładnie wypłucz wodą i zbierz do tej samej zlewki.
11. Wyrzuć resztki roślinne z górnego sita i dokładnie umyj wszystkie trzy sita wodą pod ciśnieniem. Nie dotykaj siatki sit, ponieważ może to zniekształcić wielkość oczek.

4. Wykluwanie jaj nicieni

1. Wyłóż czysty metalowy koszyczek kilkoma warstwami ręczników papierowych Kimwipe i umieść go na szklanej płytce Petriego. Zachowaj 1-cm odstęp między dnem koszyczka a płytką.
2. Wlej wyekstrahowane jaja nicieni na papier w drucianym koszyczku. Dodaj tyle cieczy, aby dno drucianego koszyczka dotykało powierzchni wody, ale nie było w niej zanurzone. Przykryj całość plastikową pokrywką.
3. Codziennie sprawdzaj stopień odparowania wody i dolewaj wody do płytki Petriego tak, aby dno koszyczka dotykało tafli wody. Zapobiegnie to wysychaniu jaj.
4. Co drugi dzień zbieraj wodę zawierającą J2 z płytek Petriego do zlewki. Jeśli nie zostanie ona użyta natychmiast, napowietrzaj zebrany inokulum w temperaturze pokojowej, korzystając z laboratoryjnego zasilania powietrzem lub pompy akwariowej. Zużyj napowietrzone inokulum w ciągu 2 dni. J2 można zbierać z układu wylęgania przez okres 6-8 dni.

5. Infekcja korzeni pomidora w doniczkach lub tackach oraz ocena infekcji

1. Wykorzystaj trzy alikwoty zebranych nicieni, aby zliczyć liczbę J2 za pomocą szkiełka liczącego lub szalki, oblicz średnią i określ pożądaną objętość do inokulacji. Zazwyczaj stosuje się 3000 J2 na roślinę w doniczkach oraz 500 J2 dla roślin hodowanych w tackach do siewek.
2. Mieszaj inokulum na magnetycznej mieszalce z wytrząsaniem przy niskiej prędkości.
3. Przed inokulacją roślin upewnij się, że gleba jest wilgotna, ale nie zbyt mokra. W przypadku inokulacji w doniczkach, wykonaj ołówkiem trzy otwory o głębokości około połowy doniczki w piasku wokół systemu korzeniowego każdego pomidora (Rycina 2). Zainokuluj każdą roślinę, wprowadzając J2 do trzech otworów za pomocą pipety. Następnie zakryj otwory.
4. W przypadku wysokoprzepustowych przesiewów w tackach, użyj zmodyfikowanej igły z uszczelnioną końcówką i otworami bocznymi, przyklejonej do końcówki pipety 5-ml wraz z pipetorem (Rycina 3), aby wprowadzić J2 do gleby. Alternatywnie nicienie można wprowadzić zgodnie z krokiem 5.3.
5. Utrzymuj rośliny w szklarni w temperaturze 24-27°C przez sześć do ośmiu tygodni. Kontynuuj nawożenie dwa razy w miesiącu preparatem Miracle-Gro.
6. W celu oceny infekcji ostrożnie wyjmij rośliny z doniczek i wymyj korzenie (zgodnie z opisem w kroku 3.3).
7. Zabarw masy jaj na niebiesko, zanurzając korzenie w roztworze 1 mg/L erioglaucyny przez 15 min.
8. Opłucz korzenie w wodzie i dokonaj oceny, licząc zabarwione masy jaj w poszczególnych systemach korzeniowych. Do wizualizacji mas jaj można użyć podświetlanej lupy biurkowej.
9. Jeśli przesiewane rośliny są potrzebne do dalszych badań genetycznych, nie odcinaj nadziemnych części roślin przed myciem korzeni do oceny. Po zabarwieniu i zliczeniu mas jaj przesadź siewki do gleby organicznej, mocno przytnij pędy, aby zmniejszyć transpirację i utrzymuj je w szklarni.

6. Zakażanie korzeni rośliny wiązki w woreczkach i ocena zakażenia

1. Policzyć inokulum nicieni i mieszać na magnetycznym mieszadle zgodnie z wcześniejszym opisem.
2. Wyjąć woreczki z wiszących folderów i położyć na powierzchni poziomej. Każdy woreczek zaszczepić 1500 J2 w 5 ml. Podnieść plastikową pokrywę woreczka i równomiernie rozprowadzić nicienie na powierzchni korzeni.
3. Przez 24 h po inokulacji przechowywać woreczki w pozycji poziomej, przykryte ciemnym papierem w celu odcięcia światła, a następnie umieścić je ponownie w wiszących folderach w komorze wzrostowej.
4. Podlewać rośliny w razie potrzeby, raz lub dwa razy dziennie, połową stężenia roztworu Hoaglanda (Hoagland & Arnon, 1950; Tabela 1) do czasu zaobserwowania reakcji na nawóz, zazwyczaj w postaci intensywniejszego zazielenienia liści i bardziej wigornego wzrostu pędów. Zazwyczaj rośliny podlewa się połową stężenia roztworu Hoaglanda przez 3 kolejne dni. Następnie utrzymywać wilgotność woreczków za pomocą wody.
5. Około 30 dni (zakres 28-35 dni) po inokulacji nasączyć każdy woreczek około 10-20 ml erioglaucyny w stężeniu 75 mg/L. Pozostawić woreczki zalane barwnikiem w pozycji poziomej przez noc.
6. Odsączyć woreczki i ocenić systemy korzeniowe, licząc masy jaj pod oświetloną lupą biurkową.
7. Jeśli wyselekcjonowane rośliny są potrzebne do dalszych badań genetycznych lub prac hodowlanych, ostrożnie wyciągnąć korzenie z papieru, przesadzić do doniczek z glebą organiczną i utrzymywać w szklarni.

7. Reprezentatywne wyniki

Odpowiednie stadia roślin pomidora i vinesy dla inokulacji nicieniami w dwóch opisanych systemach przedstawiono na Rysunkach 1 i 2. Ponadto przykłady dobrze zainfekowanych korzeni pomidora i vinesy przedstawiono na Rysunkach 4 i 5. Jak w większości testów odporności na choroby, zaleca się użycie co najmniej 6–10 roślin na genotyp do inokulacji nicieniami w celu obliczenia średniego stopnia infekcji. Zmienność infekcji nicieniowej między roślinami tego samego genotypu można zmniejszyć, stosując jednolitą wielkość roślin oraz precyzyjną ilość i sposób podania inokulum.

Stosowanie tacek i woreczków do wzrostu umożliwia przesiewanie od setek do tysięcy roślin na niewielkiej powierzchni uprawnej. Woreczki do wzrostu pozwalają również na szybką i wydajną nieniszczącą ocenę infekcji nicieni korzennych bez konieczności mycia korzeni (Rycina 4).

Rycina 1. Dwutygodniowa roślina rośliny z grupy Vigna grown w woreczku, gotowa do inokulacji nicieniami korzeniowymi.

Rysunek 2. Trzytygodniowa roślina pomidora przygotowana do inokulacji nicieniami korzeniowymi.

Rysunek 3. Zmodyfikowana igła i końcówka pipety używane do wysokoprzepustowego zaszczepiania nicieni. Dół igły został uszczelniony, a w jej korpusie za pomocą wiązki laserowej wywiercono trzy zestawy otworów. Następnie zmodyfikowaną igłę przyklejono do końcówki pipety o pojemności 5 ml.

Rycina 4. System korzeniowy pomidora zainfekowany nicieniami glebowymi (root-knot nematodes).

Rycina 5. System korzeniowy rośliny z gatunku cowpea z masami jaj zabarwionymi erioglaucyną 30 dni po inokulacji, hodowany w temperaturze 28 °C.

Dyskusja

Istnieją dwa krytyczne kroki dla pomyślnego przesiewu nicieni: przygotowanie wysoce infekcyjnego inokulum oraz użycie roślin na odpowiednim etapie rozwojowym. Stopień wykluwania się jaj nicieni korzeniowych jest bardzo zmienny i mieści się w przedziale od 5% do 50%. Dlatego w celu uzyskania optymalnego poziomu wykluć i wysoko infekcyjnych J2, należy zwrócić szczególną uwagę na procedury ekstrakcji jaj i ich wykluwania. Jaja powinny być eksponowane na podchloryn sodu przez minimalny czas, a podchloryn należy dokładnie wypłukać z mieszaniny korzeniowej. Podczas wykluwania jaj zawiesina zawierająca jaja nie powinna być zanurzona w wodzie. Ponadto należy unikać przedostawania się jaj do znajdującej się poniżej szalki Petriego, w której zbierane są wyklute larwy. Jednym ze sposobów uniknięcia przedostania się jaj podczas procesu wykluwania jest niepolewanie wodą bezpośrednio chusteczki Kimwipe, ponieważ papier może się przerwać. Zamiast tego należy wlewać wodę bezpośrednio do szalki Petriego.

Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy użyć świeżo wyklutych stadiów J2. Jeśli wskaźnik wylęgu jest niski i wymagana jest większa ilość inokulum, stadia J2 można przechowywać w temperaturze 15°C przez dłuższy czas. Przed inokulacją należy ogrzać przechowywane inokulum do temperatury pokojowej, aby ożywić nicienie. Nie należy jednak przechowywać stadiów J2 przez zbyt długi czas, nawet w temperaturze 15°C, ponieważ głodne stadia J2 nie będą efektywnie infekować.

Młode siewki stanowią najlepszy etap rozwojowy dla inokulacji nicieniami glebowymi z rodzaju Root-knot. Należy jednak zrównoważyć to z wytworzeniem odpowiedniego systemu korzeniowego, który zapewni dostateczną liczbę wierzchołków korzeni jako punktów wniknięcia dla J2. Utrzymanie optymalnych warunków wzrostu roślin jest również kluczowe dla przeprowadzanych badań przesiewowych. Należy unikać nadmiernego podlewania roślin, szczególnie tych hodowanych w woreczkach. Nadmierne podlewanie woreczków, objawiające się stojącą wodą na ich dnie, może sprzyjać wzrostowi grzybów i pogorszyć stan zdrowotny korzeni.

Dzięki obu testom można przeprowadzić dalszą ocenę infekcji nicieni oraz obliczyć liczbę jaj na system korzeniowy oraz liczbę jaj na gram świeżego korzenia. W przypadku testów na pomidorach poszczególne korzenie są ważone, a jaja ekstrahowane zgodnie z opisem przygotowania inokulum (sekcja 3). Przy przetwarzaniu dużej liczby próbek roślinnych, poszczególne systemy korzeniowe można zmielić w blenderze w celu ekstrakcji jaj. Liczbę jaj należy policzyć w co najmniej trzech alikwotach, a następnie obliczyć liczbę jaj na gram świeżego systemu korzeniowego. W przypadku testów w saszetkach system korzeniowy jest oddzielany od papierowej wkładki, ważony, a następnie jaja są ekstrahowane.