Izolacja i ekspansja komórek nowotworowych glejaka wielopostaciowego człowieka z wykorzystaniem testu neurosferycznego

Podsumowanie

Niniejszy protokół wideo demonstruje izolację i ekspansję komórek macierzystych z chirurgicznie wyciętej tkanki guza glejaka wielopostaciowego (GBM) u człowieka przy użyciu metody hodowli neurosfer.

Streszczenie

Komórki macierzystopodobne zostały wyizolowane z takich nowotworów jak rak piersi, płuca, jelita grubego, prostaty oraz mózgu. Krytyczną kwestią we wszystkich tych nowotworach, zwłaszcza w przypadku wielopostaciowego glejaka (GBM), jest identyfikacja i izolacja populacji komórek inicjujących nowotwór w celu zbadania ich roli w powstawaniu, progresji i nawrotach choroby. Zrozumienie populacji komórek inicjujących nowotwór dostarczy wskazówek do znalezienia skutecznych metod terapeutycznych dla tych typów nowotworów. Test neurosfer (NSA), ze względu na swoją prostotę i powtarzalność, jest preferowaną metodą izolacji i propagacji wielu z tych komórek nowotworowych. Niniejszy protokół przedstawia metodę hodowli neurosfer w celu izolacji i namnażania komórek macierzystopodobnych z chirurgicznie wyresekowanej tkanki ludzkiego nowotworu GBM. Procedury obejmują wstępne trawienie chemiczne i mechaniczną dysocjację tkanki nowotworowej, a następnie wysianie otrzymanej zawiesiny pojedynczych komórek w kulturze NSA. Po 7–10 dniach można zaobserwować pierwotne neurosfery o średnicy 150–200 μm, które są gotowe do dalszego pasażowania i namnażania.

Protokół

1. Pobieranie pierwotnej tkanki GBM

1. Guz glejaka wielopostaciowego (GBM) jest pobierany od pacjenta zdiagnozowanego w kierunku tego nowotworu i przechodzącego operację.
2. Należy ustalić szczegóły z zespołem neurochirurgicznym. Neurochirurg umieści wycięty guz GBM w probówce o odpowiedniej wielkości zawierającej pożywkę podstawową dla neuralnych komórek macierzystych (NSC) uzupełnioną o 10-15% antybiotyków (penicylina/streptomycyna). Laboratorium musi dostarczyć zimną pożywkę na salę operacyjną. Alternatywnie, w tym celu można również zastosować zimną minimalną pożywkę niezbędną buforowaną HEPES (HEM) lub roztwór soli fizjologicznej (PBS) z wysokim stężeniem antybiotyków.
3. Wycięta tkanka guza jest dostarczana do laboratorium w lodzie i umieszczana w komorze z laminarnym przepływem powietrza.

2. Dysocjacja guza pierwotnego do zawiesiny pojedynczych komórek

1. Nadmiar oryginalnego medium/PBS usuwa się z probówki Falcon, a próbkę przemywa 2-3 razy 5-10ml PBS/podstawowego medium NSC, aby usunąć krew i zanieczyszczenia. PBS/medium usuwa się, a tkankę guza GBM przenosi do szalki Petriego.
2. Tkankę tnie się na małe fragmenty, a następnie rozdrabnia za pomocą ostrza skalpela nr 10 na bardzo małe kawałki, aby zwiększyć powierzchnię kontaktu dla procesu trypsynizacji. Rozdrabnianie może trwać od 1 do 3 minut, w zależności od wielkości guza.
3. Rozdrobnioną tkankę poddaje się trypsynizacji w 3-5ml uprzednio ogrzanej 0,05% trypsyny-EDTA przez 10-15 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37°C. Do przeniesienia małych fragmentów guza wraz z trypsyną do probówki Falcon 15ml używa się pipety elektronicznej.
4. Po okresie inkubacji dodaje się równą objętość inhibitora trypsyny z soi, aby zatrzymać enzymatyczną reakcję trypsyny.
5. Inaktywację trypsyny zapewnia się poprzez kilkukrotne pipetowanie zawiesiny w górę i w dół. Następnie zawiesinę pelletuje się poprzez wirowanie przy 800rpm (110g) przez 5min.
6. Nadpłyn odrzuca się, a fragmenty tkanki resuspenduje w 1ml sterylnego podstawowego medium NSC. Agregaty rozdziela się poprzez delikatne pipetowanie w górę i w dół (3-7 razy), aż do uzyskania gładkiej, mlecznej zawiesiny pojedynczych komórek. Liczba cykli pipetowania zależy bezpośrednio od wielkości cząstek w rozdrobnionej tkance. Należy unikać długotrwałej i gwałtownej dysocjacji mechanicznej, ponieważ może ona prowadzić do śmierci komórek i zmniejszenia liczby tworzonych sfer.
7. Aby usunąć niedysocjowane fragmenty i zanieczyszczenia, do probówki dodaje się 10-15 ml medium podstawowego, a zawiesinę komórkową filtruje przez sitko komórkowe 40 mikronów do probówki 50ml.
8. Przefiltrowaną zawiesinę wiruje się przy 800rpm (110g) przez 5min. Następnie odrzuca się nadpłyn.
9. Pellet komórek resuspenduje się w 1-2ml pełnego medium NSC w celu policzenia komórek.

3. Liczenie i wysiew komórek

1. Do probówki eppendorfa o pojemności 1 ml dodaje się 10 μL zawiesiny komórkowej do 90 μL 0,04% błękitu trypanu.
   Uwaga: można stosować również inne odpowiednie rozcieńczenia komórek.
2. Zawiesinę miesza się, pipetując ją w górę i w dół. Następnie 10 μL mieszaniny komórek z błękitem trypanu przenosi się do hemocytometru w celu oznaczenia gęstości komórek.
3. Komórki wysiewa się do odpowiednich naczyń hodowlanych w pełnej pożywce NSC (mieszanina podstawowej pożywki NSC i suplementu proliferacyjnego NSC w stosunku 9:1) uzupełnionej o 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml bFGF oraz 1 μl/ml 0,2% heparyny (2 μg/ml). Dla kolb T25, T80 i T175 stosuje się odpowiednio 5, 20 i 40 ml pożywki. Aby zmniejszyć ryzyko kontaminacji, do pożywki można dodać antybiotyki w stężeniu 1:100.
4. Kolbę umieszcza się w inkubatorze ustawionym na 37°C i 5% CO₂.

4. Pasażowanie i ekspansja sfer pochodzących z GBM:

1. Gdy neurosfery osiągną średnicę średnio 150-200 μm, hodowla jest gotowa do pasażowania. Zawartość każdej kolby należy przenieść do sterylnej probówki do hodowli tkanek o odpowiedniej wielkości i odwirować przy 800 rpm (110 g) przez 5 min w temperaturze pokojowej.
2. Należy usunąć nadsącz, a osad resuspenderować w 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA.
3. Aby uzyskać optymalną trypsynizację, zawiesinę komórkową inkubuje się w łaźni wodnej w temperaturze 37°C przez 2-3 min. Aby zatrzymać działanie trypsyny, do zawiesiny komórkowej dodaje się taką samą objętość inhibitora trypsyny sojowej, a następnie zawiesinę delikatnie pipetuje się w górę i w dół.
4. Zawiesinę komórkową wiruje się przy 800 rpm (110g) przez 5 min. Następnie usuwa się nadsącz, a komórki resuspenderuje w 1 ml pożywki NSC.
5. Liczbę komórek ocenia się zgodnie z opisem powyżej.
6. Komórki wysiewa się w stężeniu 5x10⁴ komórek/ml w pełnej pożywce NSC uzupełnionej o czynniki wzrostu, wykorzystując naczynia do hodowli tkanek o odpowiedniej wielkości, zgodnie z opisem w poprzedniej części.
7. Wtórne neurosfery tworzą się w ciągu 7-10 dni podczas inkubacji w temperaturze 37°C w wilgotnym inkubatorze z 5% CO₂.

5. Reprezentatywne wyniki:

Po wysianiu pojedynczych komórek pozyskanych z tkanki guza GBM, nowotworowe komórki macierzystopodobne proliferują i w ciągu 3-4 dni tworzą niewielkie skupiska złożone z kilku komórek (patrz wideo i Rysunek 1). Wraz ze wzrostem skupiska te przyjmują bardziej sferyczny kształt, tak że po 7-8 dniach tworzą się prawidłowe sfery widoczne w kontraście fazowym o średnicy średnio 150-200 mikronów (patrz wideo i Rysunek 2). Przy większym powiększeniu zdrowe sfery zazwyczaj wykazują obecność mikrokolców na obwodzie. Pojawienie się dużych skupisk przypominających sfery w ciągu 1-2 dni po rozpoczęciu hodowli wynika z obecności niezdysocjowanych agregatów na początku hodowli i nie powinno być mylone z prawdziwymi sferami. Ilość zanieczyszczeń w pierwotnej hodowli sfer nowotworowych różni się w zależności od początkowego źródła tkanki oraz tego, czy obejmuje ona otaczającą tkankę mózgową. Prawidłowe techniki przygotowania tkanki, w tym dysocjacja enzymatyczna i mechaniczna oraz późniejsza filtracja próbki z odpowiednią ilością pożywki, mogą skutkować mniejszą ilością zanieczyszczeń w hodowli.

Rysunek 1. Pierwotna hodowla sfer GBM 4 dni po wysianiu. Macierzystopodobne komórki nowotworowe proliferują i tworzą małe skupiska komórek w ciągu 3-4 dni. Powiększenie pierwotne; 20x.

Rysunek 2. Hodowla sfer GBM z pierwszego pasażu 8 dni po wysianiu. Powiększenie oryginalne; 20x.

Dyskusja

W celu izolacji neuralnych komórek macierzystych i progenitorowych z normalnych mózgów dorosłych i płodowych^{1, 2, 3, 4}, a także komórek nowotworowych o charakterze macierzystym z tkanek rakowych, takich jak płuca⁵, prostata⁶, pierś⁷ i mózg^{8, 9}, często stosowanym rozwiązaniem jest test neurosfer. Dzięki temu prostemu i powtarzalnemu badaniu można wygenerować nieokreśloną liczbę komórek z wyciętą tkanki nowotworowej, które wykazują cechy podobne do somatycznych komórek macierzystych: wielopotencjalność ex vivo, zdolność do tworzenia nowych guzów po implantacji oraz zdolność do samoodnawiania. Komórki te mogą być wykorzystane do badania podstawowej biologii komórek nowotworowych, w tym oddziaływań międzykomórkowych, różnicowania, migracji, inwazji i śmierci komórkowej. Ponadto izolowane komórki nowotworowe o charakterze macierzystym stanowią niezwykle cenne narzędzie do badania sposobów powstawania, progresji i nawrotów nowotworów, a także do odkrywania leżących u ich podstaw mechanizmów komórkowych, co w przyszłości może dostarczyć informacji na temat opcji terapeutycznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Podłoże podstawowe NeuroCult NSC (ludzkie)	Podłoże	Stem Cell Technologies	05750
Suplementy do proliferacji NeuroCult NSC (ludzkie)	Suplement do podłoża	Stem Cell Technologies	05753
%0,05 trypsyny-EDTA	Odczynnik	GIBCO, by Life Technologies	25300-062
*MEM	Odczynnik	GIBCO, by Life Technologies	41500-018	składnik HEM
*HEPES	Odczynnik	Sigma-Aldrich	H4034	składnik HEM
*Woda destylowana	Odczynnik	GIBCO, by Life Technologies	15230-147
**DNaza I	Odczynnik	Roche Group	104159
**Inhibitor trypsyny z soi	Odczynnik	Sigma-Aldrich	T6522
Pen/Strep	Odczynnik	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
Ostrze skalpela nr 10	Narzędzie chirurgiczne	BD Biosciences	371610
Szalka Petriego	Naczynie hodowlane	BD Biosciences	353003
Mała pęseta	Narzędzia chirurgiczne	Fine Science Tools	11050-10
Sito do komórek	Sito	BD Biosciences	352340
Kolba T25	Naczynie hodowlane	Nalge Nunc international	136196
Kolba T80	Naczynie hodowlane	Nalge Nunc international	178905
Probówki 15 ml	Naczynie hodowlane	BD Biosciences	352096
Probówki 50 ml	Naczynie hodowlane	BD Biosciences	352070
EGF	Czynnik wzrostu	R&D Systems	2028-EG
b-FGF	Czynnik wzrostu	R&D Systems	3139-FB
Heparyna	Czynnik wzrostu	Sigma-Aldrich	H4784	Rekonstytuowana w PBS
* Aby przygotować HEM, zmieszać pakiet MEM 1x10L i 160 ml 1M HEPES, a następnie dopełnić objętość do 8,75 L wodą destylowaną. Ustawić końcowe pH na 7,4 i przechowywać w temperaturze 4°C.
** Aby przygotować roztwór inhibitora trypsyny, najpierw przygotować 10 ml roztworu DNazy I (100 mg DNazy rozpuszczonej w 100 ml HEM), a następnie dodać 0,14 g inhibitora trypsyny do roztworu DNazy i na koniec dopełnić objętość do 1 litra za pomocą HEM. Alikwoty produktu końcowego przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20°C.