Analiza morfologii dendrytów komórek Purkinjego w organotypowych kulturach skrawków

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół umożliwiający obrazowanie i ilościową ocenę morfologii drzewa dendrytycznego pojedynczych komórek Purkinjego hodowanych w organotypowych kulturach skrawków móżdżku. Protokół ten ma na celu wspieranie badań nad mechanizmami rozwoju dendrytów komórek Purkinjego.

Streszczenie

Komórki Purkinjego stanowią atrakcyjny system modelowy do badania rozwoju dendrytów, ponieważ posiadają one imponujące drzewo dendrytyczne, które jest ściśle zorientowane w płaszczyźnie strzałkowej i rozwija się głównie w okresie postnatalnym u małych gryzoni ³. Ponadto dostępnych jest kilka przeciwciał, które selektywnie i intensywnie znakują komórki Purkinjego wraz ze wszystkimi wypustkami, z czego najszerzej stosowane jest przeciwciało anty-Kalbindyna D28K. Do obserwacji dendrytów w żywych komórkach, poprzez laboratoria Jackson labs, dostępne są myszy wykazujące selektywną ekspresję EGFP w komórkach Purkinjego ¹¹. Organotypowe hodowle skrawków móżdżku umożliwiają łatwe manipulacje eksperymentalne w zakresie rozwoju dendrytów komórek Purkinjego, ponieważ większość ekspansji drzewa dendrytycznego tych komórek zachodzi właśnie w okresie hodowli ⁴. Przedstawiamy tutaj krótki, niezawodny i prosty protokół obrazowania i analizy morfologii dendrytów komórek Purkinjego hodowanych w organotypowych hodowlach skrawków móżdżku. W wielu przypadkach pożądana jest ilościowa ocena drzewa dendrytycznego komórki Purkinjego. Skupiamy się tutaj na dwóch parametrach: wielkości drzewa dendrytycznego oraz liczbie punktów rozgałęzień, które można szybko i łatwo określić w hodowlach skrawków móżdżku barwionych przeciwciałem anty-kalbindyną. Te dwa parametry stanowią niezawodny i czuły miernik zmian w drzewie dendrytycznym komórek Purkinjego. Na przykładzie traktowania aktywatorem kinazy białkowej C (PKC) PMA oraz receptorami metabotropowymi glutaminianu 1 (mGluR1) demonstrujemy, w jaki sposób wizualizuje się i ilościowo ocenia różnice w rozwoju dendrytów. Połączenie rozbudowanego drzewa dendrytycznego, selektywnych i intensywnych metod immunobarwienia, organotypowych hodowli skrawków obejmujących okres wzrostu dendrytów oraz modelu mysiego ze specyficzną ekspresją EGFP w komórkach Purkinjego sprawia, że komórki te są potężnym systemem modelowym do odkrywania mechanizmów rozwoju dendrytów.

Protokół

1. Przygotowanie organotypowych hodowli plastrów móżdżku

Hodowle plastrów móżdżku przygotowuje się z myszy w 8. dobie po urodzeniu P(8) przy użyciu metody inkubacji statycznej ¹⁰. W naszym laboratorium wykorzystujemy myszy B6CF1. W niektórych eksperymentach zastosowano również myszy transgeniczne, które selektywnie ekspresują EGFP w komórkach Purkinjego. Przygotowanie hodowli plastrów zajmuje około 30 minut na jednego młodszego osobnika, czyli 3 godziny dla miotu składającego się z 6 myszy. Wszystkie etapy są przeprowadzane w warunkach sterylnych w komorze z laminarnym przepływem powietrza przy użyciu wysterylizowanych narzędzi chirurgicznych.

1. Móżdżek szczeniąt myszy w wieku P8 jest wycinany z mózgu w lodowatym medium przygotowawczym (MEM (Gibco nr katalogowy 11012) z glutamax 1:100, pH 7.3) przy użyciu stereomikroskopu.
2. Móżdżek jest cięty na plastry o grubości 350 μm w orientacji strzałkowej za pomocą ciachacza do tkanek McIlwain.
3. Plastry są umieszczane na wkładkach do hodowli komórkowych Millipore (ok. 6 plastrów na wkładkę, Millipore PICM03050) i inkubowane w płytkach 6-dołkowych z 0,75 ml na dołek medium inkubacyjnego (48,35 ml MEM, 25 ml Eagle Medium, 25 ml surowicy konia, 1 ml glutamax I, 0,65 ml sterylnego 10% roztworu glukozy, pH 7.3) w nawilżonej atmosferze z 5% CO₂ w temperaturze 37 °C. Wszystkie odczynniki do hodowli tkanek pochodziły z Gibco, Invitrogen.
4. Traktowanie farmakologiczne jest zazwyczaj rozpoczynane w 3. dniu in vitro (DIV3) poprzez dodanie leku w pożądanym stężeniu do medium hodowlanego. Forbol 12-myristate 13-acetate (PMA) oraz (RS)-3,5-dihydroksyfenyloglicyna (DHPG) pochodziły z Tocris, UK. Ponieważ wiele leków wymaga zastosowania DMSO lub etanolu do przygotowania roztworu zapasowego (np. PMA), należy zadbać o to, aby całkowita ilość rozpuszczalnika dodanego do medium hodowlanego nie przekraczała 1% (7,5 μl na dołek). Leki są odnawiane wraz ze zmianą medium hodowlanego co 2^nd lub 3^rd dzień.

2. Fixacja i immunostaining organotypowych kultur plastrów móżdżka

Istotną zaletą móżdżku jest dostępność przeciwciał, które specyficznie i intensywnie barwią główne neurony móżdżku, tzn. komórki Purkinjego oraz komórki ziarniste. Morfologię dendrytów komórek Purkinjego można uwidocznić poprzez immunobarwienie przeciwciałami anty-kalbindyna D28K.

1. W celu utrwalenia kultur usuwa się pożywkę i ostrożnie dodaje 3 ml zimnej 4% paraformaldehydu w 0,1M buforze fosforanowym (pH 7,4) na każdą studzienkę zawierającą wkładkę Millicell z przytwierdzonymi do membrany skrawkami móżdżku. Kultury utrwala się przez noc, następnie usuwa utrwalacz i płucze kultury buforem fosforanowym.
2. Do immunobarwienia stosuje się następujące przeciwciała: królicze anty-kalbindyna D-28K (Swant, Bellinzona, Szwajcaria) w rozcieńczeniu 1:1000 do selektywnej wizualizacji komórek Purkinjego oraz monoklonalne anty-NeuN (Chemicon, Millipore) w rozcieńczeniu 1:500 do selektywnej wizualizacji komórek ziarnistych ¹². Królicze anty-GFP pochodziło z firmy Abcam, UK. Fluorescencyjne przeciwciała wtórne Alexa pochodziły z firmy Molecular Probes, Invitrogen.
3. Kultury poddaje się permeabilizacji i blokowaniu poprzez dodanie 3% normalnego surowiczego osocza koziego + 0,3% TritonX100 w 0,1 M buforze fosforanowym (roztwór blokujący). Przeciwciała anty-kalbindyna D28K i anty-NeuN rozcieńcza się w roztworze blokującym, a następnie kultury inkubuje się z roztworem blokującym zawierającym przeciwciała przez noc w temperaturze 4 °C przy lekkim mieszaniu. Wszystkie rozcieńczenia podano jako % (v/v); Triton X100 pobierano z 10% roztworu zapasowego w celu ułatwienia pipetowania.
4. Kultury płucze się 3x 0,1 M buforem fosforanowym, a następnie inkubuje z odpowiednimi przeciwciałami wtórnymi, np. kozimi anty-króliczymi Alexa 568 oraz kozimi anty-mysimi Alexa 488 rozcieńczonymi 1:500 w 0,1M buforze fosforanowym + 0,1% TritonX100 przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie kultury płucze się 3x 0,1M buforem fosforanowym.
5. zabarwione skrawki usuwa się ze studzienki hodowlanej za pomocą pędzla, a następnie osadza na szkiełkach Superfrost plus i przykrywa szkiełkami nakrywkowymi z zastosowaniem odpowiedniego medium montażowego, np. Mowiol. Kultury można teraz obserwować pod zwykłym mikroskopem z wyposażeniem do epifluorescencji lub pod mikroskopem konfokalnym.

3. Obserwacja pojedynczych komórek Purkinjego w organotypowych kulturach skrawków

1. Po immunobarwieniu kalbindyną D28k całyy cytoplazma komórek Purkinjego jest intensywnie zabarwiona, w tym dendryty i akson. Ze względu na gęste ułożenie komórek Purkinjego w warstwie komórek Purkinjego, drzewa dendrytyczne większości tych komórek nakładają się na siebie, co utrudnia badanie pełnego drzewa pojedynczej komórki. Jednakże, z powodu śmierci części komórek Purkinjego podczas procesu przygotowania, w wielu kulturach występują obszary o zmniejszonej gęstości tych komórek. W takich obszarach możliwe jest znalezienie komórek Purkinjego z pełnym drzewem dendrytycznym, które nie nakłada się na inne komórki. W tych komórkach drzewo dendrytyczne może być oglądane i analizowane z jakością porównywalną do barwienia metodą Golgiego. Ponieważ w móżdżku komórki Purkinjego są jedynym typem komórek wykazującym ekspresję kalbindyny D28K, komórki te są identyfikowane jako komórki Purkinjego.
2. Alternatywną metodą jest wykorzystanie kultur pochodzących od myszy B6;FVB-Tg(Pcp2-EGFP)146.244Yuza/J (zwanych tutaj myszami Pcp2-EGFP, dostępnych w Jackson Laboratories), które wykazują ekspresję EGFP pod specyficznym dla komórek Purkinjego promotorem L7 ¹¹. W takich kulturach skrawków żywe komórki Purkinjego mogą być wizualizowane dzięki ekspresji EGFP. Możliwe jest również śledzenie morfologii dendrytycznej pojedynczej komórki w czasie. Alternatywnie, po fiksacji, komórki Purkinjego wykazujące ekspresję EGFP mogą zostać poddane immunobarwieniu przeciwciałem anty-GFP. Obie metody nadają się do barwienia dendrytów, ciał komórkowych i aksonów komórek Purkinjego w kulturach organotypowych. Ponieważ promotor L7 u myszy Pcp2-EGFP nie jest eksprimowany w każdej komórce Purkinjego i występują różnice w częstotliwości ekspresji między myszami (Kapfhammer, dane nie przedstawione), kultury skrawków pochodzące od tych zwierząt ułatwiają wizualizację i pomiar komórek Purkinjego, których drzewa dendrytyczne nakładają się na drzewa innych komórek Purkinjego. Takie drzewa dendrytyczne można oglądać indywidualnie, gdy sąsiednie komórki Purkinjego z nakładającymi się drzewami dendrytycznymi nie wykazują ekspresji GFP (Rysunek 1A, B).

4. Pomiar rozmiaru drzewa dendrytycznego i liczby punktów rozgałęzień komórek Purkinjego

1. Wielkość drzewa dendrytycznego. Dzięki fluorescencyjnemu znakowaniu komórek Purkinjego wielkość drzewa dendrytycznego danej komórki można łatwo zmierzyć, o ile nie nakłada się ono na inne komórki. Ponieważ immunobarwienie kalbindyną znakuje wszystkie komórki Purkinjego, identyfikacja komórek z nienakładającymi się drzewami dendrytycznymi może być trudna. W takim przypadku zaleca się stosowanie Pcp2-EGFP, aby ułatwić identyfikację odpowiedniej liczby komórek Purkinjego z nienakładającymi się drzewami dendrytycznymi. Po zidentyfikowaniu komórki Purkinjego z nienakładającym się drzewem dendrytycznym, ogląda się ją przez obiektyw 20x i rejestruje obraz za pomocą kamery cyfrowej. Obraz ten można następnie przeanalizować za pomocą programu do analizy obrazu. Używamy programu Image Pro plus, który pozwala na obrysowanie drzewa dendrytycznego komórki jednym kliknięciem myszy przy użyciu narzędzia magiczna różdżka w trybie pomiaru (Rysunek 2A). Program oblicza następnie powierzchnię zajmowaną przez drzewo dendrytyczne i eksportuje ją do programu MS Excel. Analizę statystyczną danych przeprowadza się za pomocą oprogramowania GraphPad Prism (patrz poniżej).
2. Liczba punktów rozgałęzień. Ze względu na silnie rozgałęzioną i delikatną morfologię drzewa dendrytycznego komórki Purkinjego, punkty rozgałęzień muszą być liczone ręcznie. Plik obrazu komórek Purkinjego wykonany przy powiększeniu 20x jest powiększany w programie Adobe Photoshop tak, aby zajmował większość ekranu. Następnie każdy punkt rozgałęzień jest liczony i zaznaczany jasnym punktem (Rysunek 2B).

5. Reprezentatywne wyniki

Monitorowanie rozwoju drzewa dendrytycznego komórek Purkinjego w okresie hodowli
Organotypowe hodowle skrawków pochodzące od myszy Pcp2-EGFP, które wykazują ekspresję EGFP specyficznie w komórkach Purkinjego, pozwalają na badanie morfologii poszczególnych komórek przez wiele dni hodowli. W ten sposób można w przejrzysty sposób udokumentować wzrost i rozwój drzewa dendrytycznego w okresie hodowli. Żywe, zidentyfikowane komórki Purkinjego były fotografowane co 2^gi lub 3^ci dzień hodowli przy użyciu obiektywu 10x. Wybrano obiektyw o małym powiększeniu, aby uniknąć i zminimalizować uszkodzenia fototoksyczne komórek wywołane oświetleniem światłem fluorescencyjnym. Rysunek 3 przedstawia dwa przykłady komórek Purkinjego sfotografowanych w żywych hodowlach. Pierwsza komórka była śledzona od 2 dnia in vitro do 7 dnia in vitro (Rysunek 3, A-C). Wyraźnie widać, że drzewo dendrytyczne tej komórki w tym okresie czasu wypuszcza kilka nowych gałęzi i zwiększa swój rozmiar. W drugim przykładzie komórka Purkinjego była śledzona od 4. do 11. dnia in vitro (Rysunek 3, D-F). Małe drzewo dendrytyczne obecne w DIV4 ulega znacznemu rozszerzeniu w tym okresie. Oba przykłady pokazują, że większość drzewa dendrytycznego komórek Purkinjego obecnego pod koniec okresu hodowli rzeczywiście rozwinęła się w kulturze.

Rozwój drzewa dendrytycznego komórek Purkinjego jest hamowany przez stymulację PKC lub mGluR1
Organotypowe hodowle skrawków móżdżku hodowano przez 11 dni. Począwszy od 2^nd dnia in vitro, niektóre hodowle traktowano PMA (50 nM), estrem forbolowym stymulującym PKC, lub DHPG (10 μM), agonistą mGluR1, aż do momentu utrwalenia hodowli. Wcześniej wykazano, że oba związki hamują i ograniczają wzrost dendrytów komórek Purkinjego ⁷, ⁸, ⁹, ⁵. W nieleczonych skrawkach kontrolnych komórki Purkinjego wytworzyły typowe, duże i silnie rozgałęzione drzewo dendrytyczne, które z wizualizowano za pomocą immunostynowania przeciwciałem anty-Kalbindyna (Rysunek 4A) lub w hodowlach z komórkami Purkinjego wykazującymi ekspresję EGFP, za pomocą immunostynowania przeciwciałem anty-GFP (Rysunek 4D). W hodowlach traktowanych PMA morfologia drzewa dendrytycznego uległa głębokiej zmianie. Dendryty wydawały się pogrubione i posiadały jedynie kilka krótkich odgałęzień bocznych. Wiele komórek Purkinjego, w przeciwieństwie do hodowli kontrolnych, nie było już jednobiegunowych, z jednym głównym dendrytem wychodzącym z ciała komórki, lecz wytworzyło dwa lub więcej dendrytów głównych (Rysunek 4B, E). Obszar zajmowany przez drzewo dendrytyczne był wyraźnie zmniejszony (patrz. poniżej). Podobna sytuacja miała miejsce w hodowlach traktowanych DHPG. Drzewo dendrytyczne komórek Purkinjego było znacznie zredukowane pod względem rozmiaru, a rozgałęzienie było wyraźnie ograniczone (Rysunek 4C, F). Wystąpiły jednak również pewne różnice jakościowe w porównaniu z hodowlami traktowanymi PMA. Nie zaobserwowano pogrubienia gałęzi dendrytycznych, a dendryty główne posiadały wiele bardzo krótkich dendrytów wtórnych (Rysunek 4C, F), co sugeruje, że zdarzenia sygnałowe zachodzące w komórkach Purkinjego traktowanych PMA i DHPG mogą być podobne, ale nie identyczne.

Ilościowa ocena wielkości drzewa dendrytycznego i liczby punktów rozgałęzień komórek Purkinjego W celu ilościowej oceny mierzy się wielkość drzewa dendrytycznego komórek Purkinjego oraz liczbę punktów rozgałęzień na jedną komórkę Purkinjego zgodnie z powyższym opisem. Wyniki z co najmniej trzech niezależnych eksperymentów są łączone, przy czym analizie musi zostać poddanych minimum 20 komórek. Średnią wartość powierzchni zajmowanej przez drzewa dendrytyczne w eksperymentach kontrolnych przyjmuje się za 100%, a wartości dla pozostałych eksperymentów wyraża się odpowiednio jako wartości procentowe. Analizę statystyczną danych przeprowadzono przy użyciu oprogramowania GraphPad Prism. Ponieważ nie zakładamy, że wszystkie wyznaczone wartości pochodzą z rozkładu Gaussa, stosujemy testy statystyczne, które nie wymagają takiego rozkładu wartości pomiarowych. Do porównywania wielu warunków i testowania istotności statystycznej wykorzystujemy test Kruskala-Wallisa, a następnie odpowiednią procedurę testów post hoc dla statystyki opartej na rangach, np. zaimplementowaną w teście post hoc Dunna w programie GraphPad Prism. Wyniki są zazwyczaj prezentowane w formie wykresów słupkowych. Przykład takiej oceny statystycznej przedstawiono na Rysunku 5. Zarówno analiza wielkości drzewa dendrytycznego (Rysunek 5A), jak i liczby punktów rozgałęzień na komórkę Purkinjego (Rysunek 5B) wykazują wyraźne różnice między grupą kontrolną a grupami traktowanymi DHPG lub PMA. Oba parametry różniły się z istotnością statystyczną p<0.001 zgodnie z testem Kruskala-Wallisa.

Rysunek 1. Komórka Purkinjego znakowana EGFP. U myszy Pcp2-EGFP nie wszystkie komórki Purkinjego wykazują ekspresję EGFP. W związku z tym drzewa dendrytyczne niektórych komórek Purkinjegich mogą być obserwowane pojedynczo, gdy wykazują one ekspresję EGFP (kanał EGFP na A), podczas gdy sąsiednie komórki Purkinjego o nakładających się drzewach dendrytycznych nie wykazują tej ekspresji (wynik negatywny w kanale EGFP na A, wynik pozytywny w barwieniu anty-Kalbindyna w kanale czerwonym na B). Pasek skali = 50 μm.

Rycina 2. Pomiar parametrów dendrytycznych komórek Purkinjego. (A). Rozmiar drzewa dendrytycznego można łatwo zmierzyć, obrysowując kontur komórki Purkinjego za pomocą jednego kliknięcia myszą w oprogramowaniu do analizy obrazu Image Pro plus, wykorzystując narzędzie magiczna różdżka. Narzędzie magiczna różdżka jest używane w taki sposób, aby całe drzewo dendrytyczne, wliczając w to somę komórki i wszystkie odnogi dendrytyczne, zostało całkowicie otoczone linią. (B). Liczbę punktów rozgałęzień zlicza się ręcznie na obrazach komórek Purkinjego. Każdy punkt rozgałęzień jest zaznaczony żółtą kropką. Pasek skali = 50 μm.

Rycina 3. Monitorowanie rozwoju drzewa dendrytycznego komórki Purkinjego. Zidentyfikowane komórki Purkinjego były wielokrotnie fotografowane w celu monitorowania wzrostu drzewa dendrytycznego. (A-C): Drzewo dendrytyczne komórki Purkinjego rosnące i rozwijające się od 2. dnia in vitro (DIV) do DIV7. W tym okresie hodowli obserwuje się ciągły wzrost i rozgałęzianie dendrytów. (D-F): Drzewo dendrytyczne komórki Purkinjego rosnące i rozwijające się od DIV4 do DIV11. Drzewo dendrytyczne ulega znacznemu rozszerzeniu w tym okresie hodowli. Pasek skali = 50 μm.

Rysunek 4. Rozwój drzewa dendrytycznego komórek Purkinjego jest hamowany przez stymulację PKC lub mGluR1. (A), (D): Nieleczone komórki kontrolne z dobrze rozwiniętym drzewem dendrytycznym. (B), (E): Po 9 dniach traktowania PMA dendryty wydają się pogrubione, a drzewo dendrytyczne jest znacznie zredukowane pod względem rozmiaru. Komórki często tracą polaryzację i stają się bipolarne (E). (C), (F): Po 9 dniach traktowania DHPG drzewo dendrytyczne jest znacznie zredukowane pod względem rozmiaru. W przeciwieństwie do traktowania PMA, na dendrytach pierwotnych i wtórnych obecnych jest wiele bardzo cienkich i krótkich odgałęzień bocznych. Komórki często tracą polaryzację i stają się bipolarne (F). Komórki Purkinjego zwizualizowano za pomocą immunostaining anty-Kalbindyną w (A - C) oraz za pomocą ekspresji EGFP w kulturach pochodzących od myszy Pcp2-EGFP w (D - F). Pasek skali = 50 μm.

Rycina 5. Ilościowa ocena wielkości drzewa dendrytycznego i rozgałęzień komórek Purkinjego. Pomiary ilościowe wykazują, że zarówno wielkość drzewa dendrytycznego (górny wykres słupkowy), jak i liczba punktów rozgałęzień (dolny wykres słupkowy) są znacznie zredukowane po zastosowaniu PMA lub DHPG. Różnice między drzewami dendrytycznymi w grupie kontrolnej a drzewami dendrytycznymi komórek Purkinjego z kultur poddanych działaniu preparatów były istotne przy p<0,001.

Dyskusja

Metody przedstawione w niniejszym opracowaniu pozwalają na badanie rozwoju dendrytów komórek Purkinjego w organotypowych kulturach skrawków móżdżku oraz na ilościową ocenę ekspansji dendrytów komórek Purkinjego poprzez pomiar wielkości drzewa dendrytycznego i liczby punktów rozgałęzień dendrytów. Oczywiście możliwa jest bardziej szczegółowa i zaawansowana analiza ilościowa dendrytów komórek Purkinjego, np. poprzez wyznaczenie całkowitej długości dendrytów, przeprowadzenie analizy Sholla lub określenie wymiaru fraktalnego...