Test wymuszonego pływania myszy

Podsumowanie

Test wymuszonego pływania jest zatwierdzony jako eksperymentalne podejście do oceny potencjalnej skuteczności antydepresyjnej u gryzoni. Zwierzęta doświadczalne umieszcza się w zbiorniku z wodą i określa się ilościowo zachowania związane z mobilnością związaną z ucieczką. Opisano typowe procedury dla mysiej wersji tego testu.

Streszczenie

Test wymuszonego pływania to test behawioralny gryzoni używany do oceny leków przeciwdepresyjnych, skuteczności przeciwdepresyjnej nowych związków oraz eksperymentalnych manipulacji, które mają na celu odtworzenie lub zapobieganie stanom podobnym do depresji. Myszy umieszcza się w nieuniknionym przezroczystym zbiorniku, który jest wypełniony wodą, a ich zachowania związane z ucieczką są mierzone. Test wymuszonego pływania jest prosty do przeprowadzenia i wymaga minimalnej ilości specjalistycznego sprzętu. Pomyślne wdrożenie testu wymuszonego pływania wymaga przestrzegania pewnych szczegółów proceduralnych i zminimalizowania nieuzasadnionego stresu u myszy. W opisie protokołu i dołączonym filmie wyjaśniamy, jak przeprowadzić mysią wersję tego testu z naciskiem na potencjalne pułapki, które mogą być szkodliwe dla interpretacji wyników i jak ich uniknąć. Dodatkowo wyjaśniamy, w jaki sposób oceniane są zachowania przejawiające się w teście.

Protokół

1. Materiały i metoda

1.1. Zbiorniki na wodę

Cylindryczne zbiorniki (30 cm wysokości x 20 cm średnicy) wymagane do testu wymuszonego pływania myszy (FST) w naszym laboratorium są zbudowane z przezroczystej pleksi, ponieważ ten materiał jest w stanie wytrzymać częste ruchy zbiorników i wypadki lepiej niż szkło. Poziom wody znajduje się 15 cm od dna i powinien być oznaczony na zbiorniku, aby upewnić się, że objętość wody jest stała u myszy. Idealnie byłoby, gdyby liczba zbiorników była co najmniej dwa razy większa niż liczba myszy testowanych jednocześnie, tak aby drugi zestaw zbiorników na wodę mógł być napełniony, gdy pierwszy zestaw jest w użyciu. Wymiary zbiorników powinny być dobrane w taki sposób, aby myszy nie były w stanie dotknąć dna zbiornika, ani stopami, ani ogonami, podczas próby pływania. Wysokość zbiornika powinna być wystarczająco wysoka, aby myszy nie mogły uciec ze zbiornika. Należy pamiętać, że średnica zbiornika i głębokość wody są ważnymi parametrami, które można dostosować, aby zmienić zachowanie myszy (szczegółowa analiza tych problemów znajduje się w^{punktach 1-3}).

1.2. Termometr

Wodoodporny termometr na podczerwień jest preferowany, ponieważ szybki pomiar temperatury skraca czas potrzebny na przeprowadzenie testu. Jednak do tego zadania wystarczy również szklany termometr rtęciowy.

1.3. Licznik czasu

1.4. Urządzenie do nagrywania wideo

Używamy kamery wideo wspieranej przez statyw. Ponieważ test ten zwykle obejmuje wiele zwierząt testowanych w tym samym czasie, ocena na żywo będzie bardzo trudna i nie jest wskazana. Kamera wideo powinna nagrywać w wystarczająco wysokiej rozdzielczości, aby renderować wysokiej jakości obraz, który zostanie później wykorzystany do oceny behawioralnej. Przed rozpoczęciem testu zawsze upewnij się, że w aparacie jest wystarczająca ilość pamięci nagrywania. Korzystamy z kamery wideo, która nagrywa cyfrowo bez użycia nośników mechanicznych (np. kasety wideo), co pozwala na cyfrowy transfer filmów. Jeśli na zbiornikach występują nadmierne odbicia, które mogą wystąpić w środowisku laboratoryjnym z górnym oświetleniem fluorescencyjnym, możesz użyć filtra polaryzacyjnego z aparatem.

1.5. Dzielniki

W naszym laboratorium mamy dwa zestawy przegród (35 cm wysokości x 22 cm szerokości x 22 cm głębokości). Są one prostokątne z trzema ścianami i są używane zarówno jako tło, jak i jako przegrody między zbiornikami, aby myszy nie widziały się nawzajem podczas testu i potencjalnie zmieniały swoje zachowanie. Jeden zestaw może być dla albinosów i zwierząt o jasnym umaszczeniu; Drugi zestaw może być jasny dla zwierząt o ciemnym kolorze, aby uzyskać wysoki kontrast. Eksperymentator powinien upewnić się, że powierzchnie przegród nie są nadmiernie odbijające światło, tak aby zmieniały obrazy z kamery lub renderowały duże różnice między poziomami oświetlenia.

1.6. Generator białego szumu

To jest potrzebne w środowiskach laboratoryjnych, w których słychać nagłe głośne dźwięki, które potencjalnie mogłyby przestraszyć zwierzęta. Generator hałasu zamaskuje takie przerywane, niepokojące dźwięki. Poziom głośności generatora białego szumu powinien być tak dobrany, aby przewyższał inne dźwięki otoczenia i nieoczekiwane dźwięki. W naszym pomieszczeniu doświadczalnym poziom hałasu otoczenia (bez włączonego generatora białego szumu) wynosi 60 dB. Całkowity poziom hałasu przy włączonym generatorze białego szumu w miejscu, w którym znajdują się zbiorniki, wynosi 70-72 dB. Należy jednak zauważyć, że liczby te są jedynie przykładowe, a każde laboratorium powinno wybrać odpowiedni poziom hałasu w zależności od swojego unikalnego środowiska i okoliczności.

1.7. Suszenie papieru i lampa grzewcza

Przed powrotem zwierząt do ich domowych klatek, ważne jest, aby delikatnie je osuszyć za pomocą ręczników papierowych i pomocne jest użycie lampy grzewczej (upewnij się, że temperatura ekspozycji nie przekracza 32°C), aby zapobiec hipotermii.

2. Procedury behawioralne

1. Ogólny projekt eksperymentu powinien odzwierciedlać prawidłowe równoważenie zmiennych specyficznych dla eksperymentu. Na przykład w naszych eksperymentach staramy się reprezentować każdą grupę w równym stopniu podczas każdej sesji FST (tj. jeśli są cztery grupy terapeutyczne, każda z nich będzie reprezentowana w każdej sesji). Ponadto myszy są obracane, tak że myszy z każdej grupy leczonej są umieszczane w innym zbiorniku podczas każdej sesji.
2. Umieść kamerę i przegrody na miejscu. Kamera powinna znajdować się jak najbliżej, aby uzyskać jak najwyższą rozdzielczość myszy.
3. Zbiorniki należy napełniać wodą z kranu o temperaturze pokojowej (23-25°C) do określonego poziomu, który jest oznaczony na ściankach zbiornika. Jeśli w Twoim obiekcie nie ma stałej ciepłej/zimnej wody, możesz przygotować gorącą wodę i/lub lód, aby szybko doprowadzić wodę do odpowiedniej temperatury. Sprawdź temperaturę wody za pomocą termometru na podczerwień. Alternatywnie, jeśli temperatura ciepłej i zimnej wody w Twoim obiekcie jest stała, możesz narysować na zbiorniku dwa znaki – jeden dla poziomu ciepłej wody, a drugi znak dla dodania zimnej wody – aby szybko zbliżyć się do prawidłowej końcowej temperatury wody.
4. Uruchom generator białego szumu, jeśli jest używany, zanim myszy zostaną wprowadzone do pomieszczenia testowego. Poziom białego szumu powinien być wystarczający tylko do zamaskowania dźwięków zewnętrznych. Unikaj dużej głośności i upewnij się, że ten sam poziom białego szumu jest używany dla wszystkich zwierząt.
5. Przyprowadź zwierzęta do pomieszczenia testowego. Jeżeli pomieszczenie kolonijne, w którym przebywają zwierzęta, i pomieszczenie do przeprowadzania badań przylegają do siebie lub znajdują się bardzo blisko siebie, warunki otoczenia są podobne, a zakłócenia podczas przemieszczania się klatki są minimalne, wówczas okres aklimatyzacji nie będzie konieczny. W przeciwnym razie należy umieścić zwierzęta w pomieszczeniu do przeprowadzania testów na okres aklimatyzacji (zazwyczaj co najmniej jedną godzinę). Jeśli konieczny jest okres aklimatyzacji, upewnij się, że zaaklimatyzowane zwierzęta nie będą miały wpływu na myszy testowane w tym samym czasie w tym samym pomieszczeniu. Należy pamiętać, że sygnały węchowe i ultradźwiękowe mogą być wyczuwane przez inne zwierzęta znajdujące się w tym samym pomieszczeniu.
6. Rozpocznij nagrywanie wideo przed umieszczeniem zwierząt w zbiornikach na wodę.
7. Trzymaj zwierzę za ogon i delikatnie i powoli umieść je w wodzie. Gdy myszy znajdą się w wodzie, powoli puść ogon. Zazwyczaj zastosowanie tej procedury zapobiegnie zanurzeniu głowy zwierzęcia pod wodą.
8. Umieść myszy w zbiornikach w kolejności, w której przeszkoda w nagrywaniu zostanie zminimalizowana. Ta kolejność, oczywiście, powinna być ustalona w połączeniu z równoważeniem grup i innymi wymaganiami specyficznymi dla twojego projektu eksperymentalnego.
9. Gdy wszystkie myszy znajdą się w zbiornikach, rozpocznij odliczanie na stoperze. Zwykle długość testu dla myszy wynosi sześć minut w FST.
10. Podczas badania upewnij się, że znajdujesz się w rozsądnej odległości od zwierząt i nie wykonujesz żadnych ruchów ani nie hałasujesz, które mogą zostać zauważone przez zwierzęta. Myszy mogą łatwo unosić się w wodzie, jednak jeśli testowany jest nowy szczep myszy lub nowy związek bez wcześniejszej wiedzy na temat ich wpływu na zachowanie podczas pływania, eksperymentator powinien dokładniej monitorować zwierzęta. W przeciwieństwie do szczurów, myszy zazwyczaj nie nurkują podczas FST, jednak w przypadku nurkowania mysz powinna zostać usunięta z butli. Jeśli eksperymentator opuści pomieszczenie, myszy powinny być monitorowane za pomocą wideo w przypadku, gdy mysz nie jest w stanie utrzymać pływania i unoszenia się w powietrzu, a w razie potrzeby przerwać test.
11. Po upływie sześciominutowego okresu testowego zatrzymaj nagrywanie. W naszym laboratorium pokazujemy notatkę przed kamerą, która identyfikuje zwierzęta na samym końcu każdego nagrania. W przypadku zastosowania tego podejścia osoba, która następnie oceni nagranie, nie będzie znała tożsamości zwierząt, ponieważ tożsamość jest pokazana dopiero na samym końcu nagrania. Zapobiega to wszelkim problemom z identyfikacją i prowadzeniem dokumentacji, które mogą wystąpić później w związku z nagraniami. Niezależnie od stosowanej strategii prowadzenia dokumentacji, powinna ona wyraźnie identyfikować zwierzęta, a także uniemożliwiać osobie, która później punktuje test, posiadanie wiedzy na temat zadań grupowych.
12. Wyjmij zwierzęta z wody za ogony w tej samej kolejności, w jakiej je włożyłeś, delikatnie osusz je papierem do suszenia i umieść z powrotem w klatce domowej.

3. Analiza zachowania

1. Myszowa wersja FST trwa zazwyczaj, od początku do końca, sześć minut. Jednak na ogół analizowane są tylko ostatnie cztery minuty testu. Wynika to z faktu, że większość myszy jest bardzo aktywna na początku FST, a potencjalne efekty leczenia mogą być przysłonięte w ciągu pierwszych dwóch minut.
2. W naszym laboratorium przesyłamy pliki wideo bezpośrednio z kamery do komputera i przeprowadzamy analizę na komputerze.
3. Podczas analizy behawioralnej mierzony jest czas, w którym każda mysz spędza na urządzeniach mobilnych. Całkowity czas mobilności jest następnie odejmowany od 240 sekund czasu testu, a następnie określany jako czas unieruchomienia. Chociaż możliwy jest bezpośredni pomiar czasu bezruchu, w naszym laboratorium stwierdziliśmy, że łatwiej jest wykryć i zmierzyć aktywne ruchy niż ich brak.
4. Najważniejszym aspektem analizy behawioralnej i zwykle największym źródłem zmienności między obserwatorami w FST jest prawidłowa identyfikacja ruchów, które są liczone jako mobilność w dobrej wierze. Nasza operacyjna definicja mobilności w FST to wszelkie ruchy inne niż te, które są niezbędne do zrównoważenia ciała i utrzymania głowy nad wodą⁴. Myszy na ogół łatwo unoszą się w wodzie, jednak nadal wykazują niewielkie ruchy, aby zrównoważyć swoje ciała i utrzymać głowy nad wodą. Te zachowania nie są próbą ucieczki i nie powinny być oceniane jako mobilność. Ponadto, po pojedynczym napadzie mobilności, mimo że zasadniczo nieruchomy, myszy mogą nadal dryfować w wodzie w wyniku pędu. Ruchy te również nie powinny być oceniane jako mobilność.
5. W naszym laboratorium do pomiarów czasu używamy oprogramowania stopera ekranowego (Xnote Stopwatch, dnSoft Research Group). Na ekranie używane są dwa oddzielne stopery. Pierwszy stoper odlicza od 240 sekund i alarmuje obserwatora o zakończeniu okresu analizy behawioralnej. Drugi stoper mierzy czas spędzony na telefonie. Niektóre programy stopera mają możliwość przypisania do funkcji uruchamiania i zatrzymywania, dzięki czemu stoperami na ekranie można sterować za pomocą klawiatury. W naszym laboratorium, zamiast zwykłej klawiatury, używamy urządzenia wejściowego powszechnie znanego jako "gamepad" do sterowania stoperami.
6. W przypadku korzystania z komputera do ilościowego określania bezruchu, jeśli na ekranie jest więcej niż jedna testowana mysz, dobrym pomysłem jest zakrycie innych zwierząt (można użyć innego okna programu lub fizycznie zakryć ekran papierem), aby ich ruchy nie rozpraszały obserwatora.
7. Jeśli używany jest stoper ekranowy, upewnij się, że obejmuje on wszystkie ułamki dziesiętne z wyjątkiem milisekund. Powodem tego jest zapobieganie stronniczości obserwatora, a jednocześnie umożliwienie określenia, czy zegarek działa, czy nie. Ponieważ obserwator, choć ślepy na grupowe przypisania zwierząt, będzie miał ogólne pojęcie o poziomie mobilności u myszy, może wystąpić pewne odchylenie, jeśli pozwoli mu się zobaczyć całkowity czas mobilności, jaki upłynął dla tej konkretnej myszy przed zakończeniem sesji analizy. Zasłaniając stoper, będzie wiedziała tylko, czy stoper jest włączony czy wyłączony w dowolnym momencie, ale nie będzie znała całkowitego czasu, który upłynął, a zatem nie będzie miała wpływu na żadne odchylenia.
8. Badanie wiarygodności z udziałem wszystkich obserwatorów powinno być przeprowadzone dla każdego nowego obserwatora przed rozpoczęciem zbierania danych od badanych zwierząt. W naszym laboratorium każdy nowy obserwator najpierw obserwuje, jak doświadczony obserwator zdobywa punkty. Po tym, jak nowy obserwator nabierze pewności siebie, aby odróżnić mobilność od bezruchu, zdobywa punkty, a doświadczony obserwator obserwuje i wytyka wszelkie błędy. Po pomyślnym zakończeniu tej fazy nowy obserwator przeanalizuje określony zestaw filmów FST, które przechowujemy w naszym laboratorium w celach szkoleniowych. Dopiero po uzyskaniu wysokiego poziomu korelacji między obserwatorami a doświadczonym obserwatorem, badacz zaczyna analizować filmy FST w rzeczywistych eksperymentach. Dane z tych analiz szkoleniowych archiwizujemy, aby stanowić wewnętrzny standard dla laboratorium do wykorzystania w przyszłości. Zaobserwowaliśmy różnice między szczepami w sposobie, w jaki wyrażają zachowania związane z mobilnością (i bezruchowością) oraz średnim czasem bezruchu między płciami. Kiedy nowy szczep, płeć lub genetycznie zmodyfikowany model myszy jest testowany w laboratorium, konieczne jest ponowne przeprowadzenie tego typu analizy niezawodności.

4. Reprezentatywne wyniki

Istnieją wyraźne różnice między genetycznie odrębnymi szczepami myszy wsobnych i niekrewniaczych pod względem ich wyjściowej bezruchu i reakcji na konkretny lek^5-11. Na przykład zidentyfikowaliśmy zróżnicowane reakcje podobne do leków przeciwdepresyjnych na lit w panelu szczepów myszy (Figura 1)⁵. Szczegóły eksperymentalne tego eksperymentu zostały opublikowane w Can et al., 2011⁵.

Rysunek 1. Czas unieruchomienia (w sekundach) w teście wymuszonego pływania, pięć godzin po pojedynczym wstrzyknięciu dożylnego soli fizjologicznej, 200, 300 lub 400 mg/kg w różnych szczepach myszy wsobnych i niekrewniaczych. *:p<0,05, **:p<0,01, ***:p<0,001 oznaczają istotną różnicę w porównaniu z grupą soli fizjologicznej, test post hoc Dunnetta. Dane są wyrażone jako średnia ± SEM. Liczba zwierząt w grupie dla każdego szczepu wynosi 6-8 (rysunek odtworzony z⁵).

Nie wszystkie odmiany myszy nadają się do FST. Niektóre szczepy, takie jak Black Swiss, NIH Swiss i FVB/NJ, wykazują niewielki lub prawie zerowy bezruch w warunkach kontrolnych, co stanowi efekt podłogi (ryc. 1)⁵. Brak wyjściowego unieruchomienia skutecznie uniemożliwia wykrycie antydepresyjnego działania manipulacji eksperymentalnych. Możliwe jest również, choć bardzo rzadko, że niektóre szczepy myszy mogą zachowywać się nienormalnie i zanurzać się w zbiorniku podczas testu, mimo że mogą unosić się na wodzie. Jednym z takich szczepów jest DBA/1OlaHsd (niepublikowana obserwacja w naszym laboratorium). Takie szczepy nie nadają się do FST. Ze względu na to ryzyko, jakkolwiek niewielkie, podczas testowania nowego szczepu, który nie był wcześniej testowany w FST lub myszy posiadającej nową manipulację genetyczną, konieczne jest uważne obserwowanie wstępnych prób, aby uratować myszy, jeśli zaangażują się w potencjalnie szkodliwe zachowania.

W opisanym tutaj eksperymentalnym projekcie, wiele zwierząt (do pięciu) jest testowanych w tym samym czasie. Podczas gdy używane przez nas dzielniki uniemożliwiają myszom widzenie się nawzajem podczas testu, a generator białego szumu tłumi słyszalne wokalizacje, nasza konfiguracja nie zapobiega przekazywaniu wszystkich sygnałów ultradźwiękowych lub węchowych. Chociaż jest to mało prawdopodobne, biorąc pod uwagę charakter testu, mogą one wpływać na zachowanie myszy. Jednym z rozwiązań tego problemu byłoby indywidualne testowanie zwierząt. Takie podejście ma jednak swoje własne problemy. Na przykład zazwyczaj zwierzęta testowane podczas każdej sesji pochodzą z tej samej klatki domowej. Pozwala to na randomizację i równoważenie zmiennych eksperymentalnych. Testowanie myszy pojedynczo oznaczałoby wyjmowanie jednej myszy na raz z klatki domowej. Spowoduje to powtarzający się stres i zaburzenie hierarchii społecznej w klatce wśród innych pozostawionych w tyle. Kolejną kwestią związaną z testowaniem pojedynczo są ograniczenia czasowe. Testowanie jednej myszy na raz wydłuży eksperyment do wielu godzin, co doprowadzi do sytuacji, w której myszy będą testowane w różnych momentach cyklu okołodobowego. Może to powodować mylące efekty pory dnia. Naukowcy powinni mieć na uwadze te kwestie podczas projektowania swoich eksperymentów.

Dyskusja

FST (czasami nazywany testem pływania Porsolt) został opracowany najpierw dla szczurów, a następnie zmodyfikowany dla myszy przez Porsolta i współpracowników^12,13. Oprócz wyżej opisanego protokołu, który okazał się skuteczny w naszym laboratorium, opublikowano szereg w dużej mierze subtelnych modyfikacji testów (zobacz Hascoët i Bourin w celu uzyskania pełnego przeglądu¹). Jest to powszechny test stosowany do oceny skuteczności leków przeciwdepresyjnych oraz skutków różnych manipulacji behawioralnyc...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zbiorniki
Termometr
Timer
Kamera
Generator białego szumu (opcjonalnie)
Papier