Test wymuszonego pływania u myszy

Podsumowanie

Test wymuszonego pływania jest uznaną metodą eksperymentalną służącą do oceny potencjalnej skuteczności leków przeciwdepresyjnych u gryzoni. Zwierzęta doświadczalne umieszcza się w zbiorniku z wodą, a następnie kwantyfikuje zachowania ruchowe związane z próbą ucieczki. Opisano powszechnie stosowane procedury dla wersji tego testu wykonywanej na myszach.

Streszczenie

Test wymuszonego pływania jest behawioralnym testem dla gryzoni, stosowanym do oceny leków przeciwdepresyjnych, skuteczności przeciwdepresyjnej nowych związków oraz manipulacji eksperymentalnych mających na celu wywołanie lub zapobieganie stanom przypominającym depresję. Myszy umieszcza się w szczelnym, przezroczystym zbiorniku wypełnionym wodą, a następnie mierzy ich aktywność ruchową związaną z próbami ucieczki. Test wymuszonego pływania jest prosty w wiarygodnej realizacji i wymaga minimalnego specjalistycznego wyposażenia. Pomyślne przeprowadzenie testu wymuszonego pływania wymaga przestrzegania określonych szczegółów proceduralnych oraz minimalizacji nieuzasadnionego stresu u myszy. W opisie protokołu oraz w towarzyszącym filmie wyjaśniamy, jak przeprowadzić wersję tego testu dla myszy, kładąc nacisk na potencjalne pułapki, które mogą negatywnie wpłynąć na interpretację wyników, oraz na sposób ich unikania. Dodatkowo wyjaśniamy, w jaki sposób ocenia się zachowania przejawiane podczas testu.

Protokół

1. Materiały i metody

1.1. Zbiorniki z wodą

Walcowate zbiorniki (wysokość 30 cm x średnica 20 cm) wymagane do przeprowadzenia testu wymuszonego pływania (FST) u myszy w naszym laboratorium są wykonane z przezroczystego pleksiglasu, ponieważ materiał ten lepiej znosi częste przemieszczanie zbiorników oraz ewentualne uszkodzenia niż szkło. Poziom wody wynosi 15 cm od dna i powinien być zaznaczony na zbiorniku, aby zapewnić stałą objętość wody dla wszystkich myszy. Liczba zbiorników powinna być idealnie co najmniej dwukrotnie większa niż liczba myszy testowanych w jednym czasie, tak aby drugi zestaw zbiorników mógł być napełniany, podczas gdy pierwszy jest w użyciu. Wymiary zbiorników należy dobrać w taki sposób, aby myszy nie były w stanie dotknąć dna zbiornika ani stopami, ani ogonami podczas testu pływania. Wysokość zbiornika powinna być wystarczająca, aby zapobiec ucieczce myszy. Należy pamiętać, że średnica zbiornika i głębokość wody są istotnymi parametrami, które można dostosować w celu zmiany zachowania myszy (szczegółową analizę tych kwestii przedstawiono w publikacjach^1-3).

1.2. Termometr

Zaleca się stosowanie wodoodpornego termometru na podczerwień, ponieważ szybki pomiar temperatury skraca czas potrzebny na przeprowadzenie testu. Wystarczający do tego zadania będzie jednak również szklany termometr rtęciowy.

1.3. Timer

1.4. Urządzenie do rejestracji wideo

Używamy kamery wideo zamocowanej na statywie. Ponieważ test ten zazwyczaj obejmuje jednoczesne badanie wielu zwierząt, ocena na żywo będzie bardzo trudna i nie jest zalecana. Kamera wideo powinna nagrywać w rozdzielczości wystarczająco wysokiej, aby uzyskać obraz wysokiej jakości, który zostanie później wykorzystany do oceny behawioralnej. Przed rozpoczęciem testu należy zawsze upewnić się, że w kamerze znajduje się wystarczająca ilość pamięci do nagrywania. Używamy kamery wideo, która rejestruje obraz cyfrowo bez użycia nośników mechanicznych (np. kaset wideo), co umożliwia cyfrowy transfer nagrań. Jeśli na zbiornikach występują nadmierne odblaski, co może zdarzyć się w środowiskach laboratoryjnych z górnym oświetleniem fluorescencyjnym, warto zastosować w kamerze filtr polaryzacyjny.

1.5. Przegrody

W naszym laboratorium dysponujemy dwoma zestawami przegród (wysokość 35 cm x szerokość 22 cm x głębokość 22 cm). Są to konstrukcje prostokątne z trzema ściankami, które służą zarówno jako tło, jak i oddzielenia między zbiornikami, aby zapobiec wzajemnemu widzeniu się myszy podczas testu i potencjalnej zmianie ich zachowania. Jeden zestaw może być czarny dla zwierząt albinotycznych i jasnych, a drugi jasny dla zwierząt o ciemnym ubarwieniu, aby zapewnić wysoki kontrast. Eksperymentator powinien upewnić się, że powierzchnie przegród nie są zbyt refleksyjne, co mogłoby zniekształcić obrazy z kamery lub spowodować znaczne różnice w poziomach oświetlenia.

1.6. Generator białego szumu

Jest to niezbędne w środowiskach laboratoryjnych, w których mogą wystąpić nagłe głośne dźwięki, mogące potencjalnie spłoszyć zwierzęta. Generator szumów zmaskuje takie przerywane, zakłócające dźwięki. Poziom głośności generatora białego szumu powinien być dobrany tak, aby był wyższy niż inne hałasy otoczenia i dźwięki nieoczekiwane. W naszym pomieszczeniu eksperymentalnym poziom hałasu otoczenia (bez włączonego generatora białego szumu) wynosi 60 dB. Całkowity poziom hałasu przy włączonym generatorze białego szumu w miejscu, w którym znajdują się zbiorniki, wynosi 70-72 dB. Należy jednak zauważyć, że wartości te podano wyłącznie jako przykład, a każde laboratorium powinno dobrać odpowiedni poziom hałasu zgodnie ze swoim specyficznym środowiskiem i okolicznościami.

1.7. Suszenie papieru i lampa grzewcza

Przed powrotem zwierząt do ich klatek macierzystych należy je delikatnie osuszyć ręcznikami papierowymi; pomocne może być zastosowanie lampy grzewczej (należy upewnić się, że temperatura ekspozycji nie przekracza 32°C), aby zapobiec hipotermii.

2. Procedury behawioralne

1. Ogólny plan eksperymentalny powinien uwzględniać odpowiednią kontrybilansację zmiennych specyficznych dla danego badania. Na przykład w naszych eksperymentach staramy się, aby każda grupa była reprezentowana w równym stopniu w każdej sesji FST (tj. jeśli istnieją cztery grupy badawcze, każda z nich będzie reprezentowana w każdej sesji). Ponadto myszy są rotowane w taki sposób, aby zwierzęta z każdej grupy badawczej były umieszczane w innym zbiorniku w każdej sesji.
2. Ustaw kamerę oraz przegrody na pozycjach. Kamera powinna znajdować się jak najbliżej, aby uzyskać najwyższą możliwą rozdzielczość obrazu myszy.
3. Zbiorniki należy napełnić wodą z kranu o temperaturze pokojowej (23-25°C) do wyznaczonego poziomu, który jest zaznaczony na ściankach zbiornika. Jeśli w placówce nie ma stałego dostępu do ciepłej/zimnej wody, można przygotować ciepłą wodę i/lub lód, aby szybko doprowadzić wodę do odpowiedniej temperatury. Temperaturę wody należy sprawdzić termometrem na podczerwień. Alternatywnie, jeśli temperatury ciepłej i zimnej wody w placówce są stałe, można nanieść na zbiornik dwie zaznaczenia – jedno dla poziomu ciepłej wody i drugie dla dodania zimnej wody – aby szybko zbliżyć się do poprawnej końcowej temperatury wody.
4. Przed wprowadzeniem myszy do pomieszczenia testowego należy uruchomić generator białego szumu, jeśli jest on stosowany. Poziom białego szumu powinien być jedynie wystarczający do zamaskowania hałasów zewnętrznych. Należy unikać wysokiej głośności i upewnić się, że dla wszystkich zwierząt stosowany jest ten sam poziom białego szumu.
5. Wprowadzić zwierzęta do pomieszczenia testowego. Jeśli pomieszczenie hodowlane, w którym przebywają zwierzęta, oraz pomieszczenie testowe są sąsiadujące lub znajdują się bardzo blisko siebie, warunki otoczenia są podobne, a zakłócenia podczas przenoszenia klatki są minimalne, okres aklimatyzacji nie będzie konieczny. W przeciwnym razie należy umieścić zwierzęta w pomieszczeniu testowym na okres aklimatyzacji (zazwyczaj co najmniej jedną godzinę). Jeśli okres aklimatyzacji jest konieczny, należy upewnić się, że zwierzęta aklimatyzowane nie będą pod wpływem myszy testowanych w tym samym czasie w tym samym pomieszczeniu. Należy pamiętać, że sygnały węchowe i ultradźwiękowe mogą być wyczuwalne przez inne zwierzęta umieszczone w tym samym pomieszczeniu.
6. Rozpocząć nagrywanie wideo przed umieszczeniem zwierząt w zbiornikach z wodą.
7. Chwycić zwierzę za ogon i delikatnie oraz powoli umieścić w wodzie. Gdy mysz znajdzie się w wodzie, należy powoli puścić ogon. Zazwyczaj zastosowanie tej procedury zapobiega zanurzeniu głowy zwierzęcia pod wodą.
8. Umieścić myszy w zbiornikach w takiej kolejności, aby zminimalizować przeszkody w nagrywaniu. Kolejność ta powinna być oczywiście ustalona w powiązaniu z kontrybilansacją grup i innymi wymogami specyficznymi dla planu eksperymentalnego.
9. Gdy wszystkie myszy znajdą się w zbiornikach, należy uruchomić odliczanie na stoperze. Standardowy czas testu FST dla myszy wynosi sześć minut.
10. Podczas testu należy zachować rozsądną odległość od zwierząt i nie wykonywać żadnych ruchów ani nie wydawać dźwięków, które mogłyby zostać zauważone przez zwierzęta. Myszy mogą swobodnie unosić się na wodzie, jednak w przypadku nowej szczepu myszy lub nowego związku testowanego bez wcześniejszej wiedzy o jego wpływie na zachowanie pływackie, eksperymentator powinien uważniej monitorować zwierzęta. W przeciwieństwie do szczurów, myszy zazwyczaj nie nurkują podczas FST, jednak w przypadku nurkowania mysz należy wyjąć ze zbiornika. Jeśli eksperymentator opuści pomieszczenie, myszy powinny być monitorowane za pomocą wideo na wypadek, gdyby mysz nie była w stanie utrzymać zachowania pływania i unoszenia się, aby w razie potrzeby przerwać test.
11. Po zakończeniu sześciominutowego okresu testowego należy zatrzymać nagrywanie. W naszym laboratorium na samym końcu każdego nagrania pokazujemy przed kamerą notatkę identyfikującą zwierzęta. Przy zastosowaniu tego podejścia osoba dokonująca późniejszej oceny nagrania nie będzie znała tożsamości zwierząt, ponieważ tożsamość jest ujawniana dopiero na samym końcu nagrania. Zapobiega to problemom z identyfikacją i prowadzeniem dokumentacji, które mogą wystąpić później w odniesieniu do nagrań. Niezależnie od stosowanej strategii prowadzenia dokumentacji, powinna ona jasno identyfikować zwierzęta i jednocześnie zapobiegać posiadaniu wiedzy o przypisaniu do grup przez osobę oceniającą test.
12. Wyjąć zwierzęta z wody za ogony w tej samej kolejności, w jakiej zostały umieszczone, delikatnie osuszyć je papierem chłonnym i umieścić z powrotem w ich domowej klatce.

3. Analiza behawioralna

1. Wersja testu FST dla myszy trwa zazwyczaj od początku do końca sześć minut. Jednakże, zazwyczaj analizuje się tylko ostatnie cztery minuty testu. Wynika to z faktu, że większość myszy jest bardzo aktywna na początku FST, a potencjalne efekty traktowania mogą zostać zamaskowane podczas pierwszych dwóch minut.
2. W naszym laboratorium przesyłamy pliki wideo bezpośrednio z kamery na komputer PC i tam przeprowadzamy analizę.
3. Podczas analizy behawioralnej mierzy się czas, w którym każda mysz jest mobilna. Całkowity czas mobilności jest następnie odejmowany od 240 sekund czasu testu, a wynik określa się jako czas unieruchomienia. Chociaż możliwe jest bezpośrednie pomiar czasu unieruchomienia, w naszym laboratorium stwierdziliśmy, że łatwiej jest wykrywać i mierzyć ruchy aktywne niż brak takich ruchów.
4. Najważniejszym aspektem analizy behawioralnej i zazwyczaj największym źródłem zmienności między obserwatorami w FST jest prawidłowa identyfikacja ruchów zaliczanych jako rzeczywista (bona fide) mobilność. Nasza definicja operacyjna mobilności w FST to wszelkie ruchy inne niż te niezbędne do utrzymania równowagi ciała i głowy nad powierzchnią wody⁴. Myszy zazwyczaj łatwo utrzymują się na wodzie, jednak nadal wykonują niewielkie ruchy, aby zrównoważyć ciało i trzymać głowę ponad wodą. Zachowania te nie są próbą ucieczki i nie powinny być punktowane jako mobilność. Ponadto, po pojedynczym epizodzie mobilności, mimo że myszy są w zasadzie unieruchomione, mogą nadal dryfować w wodzie w wyniku pędu. Ruchy te również nie powinny być punktowane jako mobilność.
5. W naszym laboratorium do pomiarów czasu używamy oprogramowania do stopera ekranowego (Xnote Stopwatch, dnSoft Research Group). Na ekranie używane są dwa osobne stopery. Pierwszy stoper odlicza czas wstecz od 240 sekund i powiadamia obserwatora o zakończeniu okresu analizy behawioralnej. Drugi stoper mierzy czas spędzony w stanie mobilności. Niektóre oprogramowania do stoperów mają możliwość przypisania klawiszy do funkcji startu i stopu, dzięki czemu stoperami ekranowymi można sterować za pomocą klawiatury. W naszym laboratorium zamiast zwykłej klawiatury używamy urządzenia wejściowego znanego jako „gamepad” do sterowania stoperami.
6. Podczas korzystania z komputera PC do kwantyfikacji unieruchomienia, jeśli testowanych jest więcej niż jedna mysz i są one widoczne na ekranie, zaleca się zasłonięcie pozostałych zwierząt (można użyć innego okna programu lub fizycznie zasłonić ekran papierem), aby ich ruchy nie rozpraszały obserwatora.
7. Jeśli używany jest stoper ekranowy, należy upewnić się, że zasłonięto wszystkie cyfry stopera z wyjątkiem ułamków milisekund. Powodem jest zapobieganie błędowi poznawczemu obserwatora, przy jednoczesnym zachowaniu możliwości ustalenia, czy stoper pracuje, czy nie. Ponieważ obserwator, mimo że nie zna przypisania zwierząt do grup, ma ogólne pojęcie o poziomie mobilności myszy, może wystąpić pewien błąd, jeśli będzie mógł zobaczyć całkowity czas mobilności upływający dla danej myszy przed zakończeniem sesji analizy. Zasłaniając stoper, obserwator będzie wiedział jedynie, czy stoper jest włączony czy wyłączony w danym momencie, ale nie będzie znał całkowitego upływu czasu, a zatem nie będzie ulegać żadnym błędom poznawczym.
8. Przed rozpoczęciem zbierania danych od zwierząt testowych należy przeprowadzić test niezawodności międzyobserwatorami dla każdego nowego obserwatora. W naszym laboratorium każdy nowy obserwator najpierw ogląda proces punktowania wykonywany przez doświadczonego obserwatora. Po tym, jak nowy obserwator nabierze pewności w różnicowaniu mobilności od unieruchomienia, przystępuje do punktowania pod nadzorem doświadczonego obserwatora, który wskazuje wszelkie błędy. Po pomyślnym zakończeniu tej fazy nowy obserwator analizuje określony zestaw filmów z FST, które przechowujemy w laboratorium do celów szkoleniowych. Dopiero po uzyskaniu wysokiego poziomu korelacji międzyobserwatorskiej z doświadczonym obserwatorem badacz rozpoczyna analizę filmów FST w rzeczywistych eksperymentach. Archiwizujemy dane z tych analiz szkoleniowych, aby stanowiły wewnętrzny standard laboratorium do przyszłych zastosowań. Zaobserwowaliśmy różnice między szczepami w sposobie wyrażania zachowań mobilności (i unieruchomienia) oraz różnice w średnim czasie unieruchomienia między płciami. Gdy w laboratorium testowany jest nowy szczep, płeć lub genetycznie zmodyfikowany model myszy, konieczne jest ponowne przeprowadzenie tego typu analizy niezawodności.

4. Reprezentatywne wyniki

Istnieją wyraźne różnice między genetycznie odmiennymi liniami myszy inbredalnych i outbredalnych pod kątem ich bazowej bezruchości oraz reakcji na konkretny lek^5-11. Przykładowo, zidentyfikowaliśmy zróżnicowane reakcje o charakterze przeciwdepresyjnym na lit w panelu linii myszy (Rycina 1)⁵. Szczegóły eksperymentalne tego doświadczenia zostały opublikowane w pracy Can et al., 2011⁵.

Rycina 1. Czas unieruchomienia (w sekundach) w teście wymuszonego pływania, pięć godzin po pojedynczej iniekcji d.o. soli fizjologicznej, 200, 300 lub 400 mg/kg w różnych inbredowych i outbredowych szczepach myszy. *:p<0.05, **:p<0.01, ***:p<0.001 oznaczają istotną różnicę w porównaniu z grupą soli fizjologicznej, test post hoc Dunnetta. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. Liczba zwierząt w grupie dla każdego szczepu wynosi 6-8 (Rycina powielona z⁵).

Nie wszystkie szczepy myszy nadają się do testu wymuszonego pływania (FST). Niektóre szczepy, takie jak Black Swiss, NIH Swiss i FVB/NJ, wykazują niewielką lub niemal całkowitą nieobecność unieruchomienia w warunkach kontrolnych, co reprezentuje tzw. efekt podłogowy (Rysunek 1)⁵. Brak bazowego unieruchomienia w praktyce uniemożliwia wykrycie efektu przeciwdepresyjnego wynikającego z manipulacji eksperymentalnych. Możliwe jest również, choć zdarza się to bardzo rzadko, że niektóre szczepy myszy zachowują się w sposób nietypowy i nurkują w zbiorniku podczas testu, mimo że potrafią pływać. Jednym z takich szczepów jest DBA/1OlaHsd (niepublikowana obserwacja w naszym laboratorium). Takie szczepy nie nadają się do FST. Ze względu na to ryzyko nurkowania, choćby niewielkie, podczas testowania nowego szczepu, który nie był wcześniej badany w FST, lub myszy z nową manipulacją genetyczną, konieczna jest uważna obserwacja początkowych prób, aby uratować myszy, jeśli zaczną one przejawiać potencjalnie szkodliwe zachowania.

W opisanym tutaj schemacie doświadczalnym jednocześnie badanych jest wiele zwierząt (do pięciu). Chociaż stosowane przez nas przegrody uniemożliwiają myszom widzenie się podczas testu, a generator białego szumu tłumi wokalizacje słyszalne, nasza konfiguracja nie zapobiega przekazywaniu wszystkich sygnałów ultradźwiękowych lub zapachowych. Choć jest to mało prawdopodobne ze względu na charakter testu, sygnały te mogłyby wpływać na zachowanie myszy. Jednym z rozwiązań tego problemu byłoby badanie zwierząt indywidualnie. Podejście to niesie jednak ze sobą własne problemy. Przykładowo, zazwyczaj zwierzęta badane w każdej sesji pochodzą z tej samej klatki domowej, co umożliwia randomizację i kontrbalansowanie zmiennych eksperymentalnych. Badanie myszy indywidualnie oznaczałoby wyjmowanie z klatki domowej jednej myszy na raz, co powodowałoby powtarzający się stres i zaburzenie hierarchii społecznej w klatce wśród pozostałych zwierząt. Kolejną kwestią przy badaniu pojedynczych osobników są ograniczenia czasowe. Badanie jednej myszy na raz wydłużyłoby eksperyment do wielu godzin, co doprowadziłoby do sytuacji, w której myszy byłyby badane w różnych momentach cyklu dobowego. Może to wywołać zakłócające efekty związane z porą dnia. Badacze powinni mieć na uwadze te kwestie podczas projektowania swoich eksperymentów.

Dyskusja

Test wymuszonego pływania (FST, czasami nazywany testem pływania Porsolta) został opracowany pierwotnie dla szczurów, a następnie zmodyfikowany dla myszy przez Porsolta i współpracowników^12,13. Oprócz opisanego powyżej protokołu, który sprawdza się w naszym laboratorium, opublikowano szereg w dużej mierze subtelnych modyfikacji testu (pełny przegląd znajduje się u Hascoëta i Bourina¹). Jest to powszechnie stosowany test służący do oceny skuteczności leków przeciwdepresyjnych oraz efektów różnych man...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zbiorniki z wodą
Termometr
Stoper
Kamera wideo
Generator białego szumu (opcjonalnie)
Papier osuszający