Wampiryczna izolacja płynu zewnątrzkomórkowego z Caenorhabditis elegans

Podsumowanie

Organizm modelowy C. elegans wykorzystuje płyn pseudocelomiczny jako pasywny układ krążenia. Bezpośrednia analiza tego płynu nie była wcześniej możliwa. Przedstawiamy tutaj nową technikę bezpośredniego badania przestrzeni zewnątrzkomórkowej, wykorzystując systemowe sygnały wyciszania podczas odpowiedzi RNAi jako przykład potwierdzający zasadność tej metody.

Streszczenie

Genetycznie podatny organizm modelowy C. elegans dostarczył odpowiedzi na niezliczone pytania biologiczne, co było możliwe dzięki jego krótkiemu czasowi generacji, łatwości hodowli i niewielkim rozmiarom. Ten niewielki rozmiar uniemożliwił jednak zastosowanie wielu podejść technicznych spotykanych w innych systemach modelowych. Na przykład przetaczanie krwi w systemach ssaków oraz techniki szczepienia roślin pozwalają na badanie składu i sygnalizacji układu krwionośnego. Układ krwionośny nicieni, czyli pseudocoelom, do niedawna był niemożliwy do bezpośredniej analizy. Aby odpowiedzieć na pytania dotyczące sygnalizacji międzykomórkowej i składu układu krwionośnego, badacze C. elegans tradycyjnie polegali na analizie genetycznej, swoistej dla komórek/tkanek rekonstytucji funkcji oraz analizie mozaikowej. Techniki te pozwalają wnioskować o procesach zachodzących między komórkami, ale nie są uniwersalnie stosowalne w identyfikacji i charakterystyce cząsteczek zewnątrzkomórkowych. Przedstawiamy tutaj nowo opracowaną technikę bezpośredniej analizy płynu pseudocoelomicznego C. elegans. Technika ta rozpoczyna się od manipulacji genetycznej lub fizycznej w celu zwiększenia objętości płynu zewnątrzkomórkowego. Następnie zwierzęta poddawane są technice wampirycznej odwrotnej mikroiniekcji z wykorzystaniem zestawu do mikroiniekcji, który umożliwia precyzyjną kontrolę ciśnienia równowagi. Po wyizolowaniu płynu zewnątrzkomórkowego, zebrały materiał można analizować poprzez przeniesienie go do innych osobników lub za pomocą metod molekularnych. Aby zademonstrować skuteczność tej techniki, przedstawiamy szczegółowe podejście do analizy konkretnego przykładu cząsteczek sygnalizacyjnych zewnątrzkomórkowych – długich dsRNA podczas systemowej odpowiedzi RNAi. Choć charakterystyka systemowego RNAi służy jako przykład dowodu koncepcji, uważamy, że technika ta może być adaptowana do odpowiedzi na szereg pytań dotyczących składu i sygnalizacji układu krwionośnego.

Protokół

1. Przygotowanie materiałów

Materiały niezbędne do wampirycznej mikroiniekcji wstecznej są podobne do tych wymaganych w standardowych technikach mikroiniekcji stosowanych do tworzenia transgenicznych szczepów C. elegans ¹. Chociaż niektóre odczynniki (np. płytki do testów) przygotowuje się w dniu transferu eksperymentalnego, wiele materiałów musi zostać przygotowanych w sposób skoordynowany w ciągu 8 dni (harmonogram znajduje się w Tabeli 1). W związku z tym, przy stosowaniu tej techniki ważne jest staranne planowanie z wyprzedzeniem (niezbędne odczynniki i sprzęt wymieniono w Tabeli 2).

Dyskusja

Przedstawiliśmy tutaj nowatorską metodę umożliwiającą izolację i charakterystykę płynu zewnątrzkomórkowego z organizmu modelowego C. elegans. Technika ta rozpoczyna się od genetycznej lub fizycznej manipulacji nicieniami dawcami w celu zwiększenia całkowitej objętości ich płynu zewnątrzkomórkowego. Następnie płyn zewnątrzkomórkowy jest izolowany przy użyciu zmodyfikowanej techniki mikroiniekcji. Nicienie są montowane do mikroiniekcji przy użyciu suchych podkładek agarozowych, aby unieruchomić je podczas procedur.......