Wewnętrzne ucho myszy jest organem zmysłowym pochodzącym z placody, którego program rozwojowy realizowany jest podczas ciąży. Opisujemy technikę transferu genu in utero, składającą się z trzech etapów: brzusznej laparotomii myszy, mikrowstrzyknięcia do macicy oraz elektroporacji in vivo. Wykorzystujemy cyfrową mikroskopię wideo, aby zademonstrować kluczowe eksperymentalne techniki embriologiczne.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Transfer genów do rozwijającego się ucha wewnętrznego myszy za pomocą elektroporacji in vivo
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wewnętrzne ucho ssaków posiada 6 odrębnych nabłonków sensorycznych: 3 grzebienie (cristae) w ampullach kanałów półkolistych, plamki (maculae) w utriculę i saccule oraz narząd Cortiego w zwiniętej ślimacznicy. Grzebienie i plamki zawierają komórki rzęsate przedsionka, które przekształcają bodźce mechaniczne w celu obsługi specjalnego zmysłu równowagi, podczas gdy komórki rzęsate słuchowe w narządzie Cortiego są głównymi przetwornikami odpowiedzialnymi za słuch 1. Specyfikacja losu komórek w tych nabłonkach sensorycznych oraz morfogeneza kanałów półkolistych i ślimacznicy odbywają się podczas drugiego tygodnia gestacji u myszy i są w dużej mierze zakończone przed narodzinami 2,3. Badania rozwojowe wewnętrznego ucha myszy są rutynowo przeprowadzane poprzez pobieranie embrionów transgenicznych na różnych etapach embrionalnych lub ponatalnych, aby uzyskać wgląd w molekularne podstawy fenotypów komórkowych i/lub morfologicznych 4,5. Stawiamy hipotezę, że transfer genów do rozwijającego się wewnętrznego ucha myszy in utero w kontekście badań nad uzyskaniem i utratą funkcji stanowi uzupełniające podejście do tradycyjnej transgenezy myszy w badaniu mechanizmów genetycznych leżących u podstaw rozwoju wewnętrznego ucha ssaków6.
Przedstawiony tutaj paradygmat eksperymentalny do prowadzenia badań nad nienaturalną ekspresją genów w rozwijającym się uchu wewnętrznym myszy składa się z trzech głównych etapów: 1) laparotomii brzusznej; 2) mikroiniekcji przezmacicznej; oraz 3) elektroporacji in vivo. Laparotomia brzuszna jest chirurgiczną techniką przeżycia u myszy, która umożliwia wyewagowanie macicy w celu uzyskania dostępu eksperymentalnego do implantowanych embrionów7. Mikroiniekcja przezmaciczna polega na wykorzystaniu szlifowanych, szklanych kapilarnych mikropipet do wprowadzenia plazmidu ekspresyjnego do światła pęcherzyka słuchowego (otocysty). Elektroporacja in vivo polega na zastosowaniu prostokątnych impulsów prądu stałego w celu wprowadzenia plazmidu ekspresyjnego do komórek progenitorowych8-10.
Wcześniej opisaliśmy tę technikę transferu genów opartą na elektroporacji, zawierającą szczegółowe uwagi do każdego kroku protokołu11. Techniki eksperymentalnej embriologii myszy mogą być trudne do opanowania na podstawie samego tekstu i statycznych obrazów. W niniejszej pracy demonstrujemy 3 etapy procedury transferu genów. Co najważniejsze, wykorzystujemy cyfrową mikroskopię wideo, aby precyzyjnie pokazać, jak: 1) określić orientację zarodka in utero; 2) zmienić orientację zarodków w celu precyzyjnego skierowania wstrzykiwań do otocysty; 3) mikroiniekcjonować DNA wymieszane z roztworem barwnika śledzącego do otocysty w dniach embrionalnych 11.5 i 12.5; 4) elektroporować wstrzykniętą otocystę; oraz 5) znakować elektroporowane zarodki w celu selekcji postnatalnej po narodzinach. Przedstawiamy reprezentatywne przykłady pomyślnie przetransfekowanych ucha wewnętrznych; ilustracyjny przewodnik po najczęstszych przyczynach błędnego celowania w otocystę; omawiamy, jak unikać powszechnych błędów metodologicznych; oraz prezentujemy wytyczne dotyczące opracowania protokołu opieki nad zwierzętami w ramach transferu genów in utero.
Protokół
1. Laparotomia brzuszna
- Z narkozą poddać samicę, której embriony znajdują się w 11,5 dniu rozwoju embrionalnego (E11.5; południe dnia wykrycia czopu pochwowego uznaje się za dzień 0,5 rozwoju embrionalnego), poprzez domięśniowy zastrzyk roztworu anestetyka z pentobarbitalem sodu (7,5 μL na gram masy ciała). Roboczy roztwór anestetyka: 180 μL roztworu pentobarbitalu sodu o stężeniu 50 mg/mL; 100 μL etanolu bezwodnego; 320 μL wodnego roztworu siarczanu magnezu o stężeniu 65 mg/mL (moduluje napięcie macicy) oraz 400 μL glikolu propylenowego (nośnik mieszalny z komponentami wodnymi i organicznymi).
- Ocenić głębokość znieczulenia, przeprowadzając testy bodźców bólowych: ucisk łapy, ściśnięcie ogona oraz reakcję mrugania na dotyk policzka i wibrys. Na rogówki nałożyć sterylną maść oftalmiczną.
- Ogolić sierść brzuszną od obszaru nadłonowego do klatki piersiowej za pomocą nożyczek i precyzyjnej ostrzyczki (Oster ostrze #40). Zdezynfekować brzuch kolejno 70% etanolem, 10% powidonem jodowym (Betadine) i 70% etanolem. Położyć mysz brzuchem do dołu na sterylnej ściereczce, a następnie umieścić na podkładce grzewczej lub ciepłej płycie (37 °C) na 2-5 min.
- Wykonać nacięcie skóry brzucha w linii środkowej brzusznej za pomocą nożyczek z zaokrąglonymi końcówkami. Przedłużyć nacięcie do 10-14 mm. Zidentyfikować linea alba (białą linię), czyli beznaczyniowy, biały pas tkanki łącznej wzdłuż linii środkowej brzusznej ściany brzucha. Rozciąć linea alba nożyczkami z zaokrąglonymi końcówkami i przedłużyć nacięcie o 10-14 mm. Natychmiast przemyć jamę brzuszną uprzednio ogrzanym (37 °C) roztworem Ringer-laktańskim.
- Wyciągnąć dwa rogi macicy za pomocą kleszczyków pierścieniowych, nie wywierając nadmiernego nacisku na miejsca implantacji. Przemyć wyciągnięte rogi macicy uprzednio ogrzanym roztworem Ringer-laktańskim.
2. Mikrowstrzyknięcie transuteralne
- Wykonać grubościankową pipetę do mikroiniekcji z borokrzemianowego szkła o następujących parametrach: średnica zewnętrzna 12-16 μm i kąt ścięcia 20 stopni. W wyciągaczu do pipet Sutter P-97 z włóknem typu „small box” zastosować następujący program: heat = ramp test plus 3 units; pressure = 200; pull = 0; velocity = 46; time = 100). W urządzeniu do ścięcia Sutter BV-10 użyć ściernego dysku 104C (złotego) przeznaczonego do pipet o dużej średnicy. Resuspendować plazmid ekspresyjny w stężeniu 3-4 μg/μL w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym bez jonów wapnia (pH 7.2-7.4). Do skoncentrowanego DNA dodać krystaliczny fast green, delikatnie wymieszać w wstrząsarku vorteks przez 30 sekund i wirować przy 10 000 g przez 10 sekund. Minimalną ilość fast green wymaganą do wizualnej oceny skuteczności iniekcji określa się empirycznie. Wypełnić pipetę ze ścięciem od tyłu roztworem DNA/fast green. Podłączyć załadowaną pipetę do mikroiniekcji do uchwytu w iniektorze ciśnieniowym (Picospritzer, używając azotu o czystości >99% jako gazu zasilającego).
- Oświetlić macicę światłem halogenowym o niskim natężeniu w celu wizualizacji zarodka w miejscu implantacji. Zidentyfikować bijące serce, pęcherzyki mózgowe, pączki kończyn, powstającą 4tą komorę romboidalną mózgu tylnego oraz oko. Przepłukiwać macicę co 2 minuty uprzednio ogrzanym roztworem Ringera z mleczanem w celu utrzymania nawilżenia. Wywierać delikatny nacisk na macicę, aby zmienić orientację zarodka i zidentyfikować wymienione powyżej punkty orientacyjne.
- Zorientować zarodek w celu zidentyfikowania głównej żyły głownej, której gałęzie przednia i tylna flankują obszar mezenchymy, w którym znajduje się otocysta. Sama otocysta nie jest widoczna podczas oświetlania macicy. Otocysta znajduje się w połowie drogi między przednią a tylną gałęzią głównej żyły głownej, które wraz z głównym pniem żyły tworzą kształt słupków bramki na boisku do futbolu amerykańskiego. Otocysta znajduje się pomiędzy tymi słupkami.
- Wprowadzić pipetę do iniekcji przez macicę po trajektorii zgodnej z domniemaną lokalizacją otocysty. Po przejściu przez macicę wykonać jeden impuls mikroinjektorem, aby zwizualizować barwnik śledzący i przybliżyć położenie czubka pipety. Przesunąć pipetę pod kontrolą mikrometru i ponownie wykonać impuls, aby ocenić głębokość. Przesunąć pipetę dalej w kierunku bocznej mezenchymy głowy i powtarzać impulsy. Prawidłowe trafienie w otocystę ujawni zwężony kształt przewodu endolimfatycznego grzbietowo oraz kształt muszli małża w obrębie przedsionka. Zwolnić nacisk na macicę, wyjąć pipetę z zarodka/macicy jednym ruchem i natychmiast przepłukać macicę uprzednio ogrzanym roztworem Ringera z mleczanem.
3. Elektroporacja in vivo
- Przepłucz macicę roztworem Ringer’a z mleczanem. Świeżo podany roztwór Ringer’a z mleczanem jest niezbędny do zapewnienia sprzężenia elektrycznego między elektrodami łopatkowymi a macicą. Nawilż wolframowe powierzchnie elektrod roztworem Ringer’a z mleczanem. Wycentruj wstrzykniętą otocystę w obrębie pola działania elektrod. Delikatnie dociśnij macicę elektrodami do elektroporacji. Katoda styka się ze ścianą macicy bocznie w stosunku do wstrzykniętej otocysty, a anoda styka się ze ścianą macicy sąsiadującej z niewstrzykniętą otocystą. Uruchom serię impulsów prostokątnych za pomocą przełącznika nożnego elektroporatora. Parametry elektroporacji to: 5 impulsów o czasie trwania 50 ms przy napięciu 43 V na impuls oraz przerwa międzyimpulsowa wynosząca 950 ms. Natychmiast po podaniu serii impulsów przepłucz macicę. Zapisz wartość prądu podanego do tkanki: wartość 60–100 mA jest wystarczająca do transfekcji progenitorów nabłonka słuchowego. Wstrzyknij substancję i przeprowadź elektroporację u 4–6 zarodków w stadium E11.5 na jedną matkę.
- Wykonaj drugą, niezależną transuteryczną mikroiniekcję wodnego dekstranu fluorescencyjnego (Alexa Fluor 488, jeśli plazmid ekspresyjny koduje czerwone białko fluorescencyjne, lub Alexa Fluor 594, jeśli plazmid ekspresyjny koduje zielone białko fluorescencyjne) do 4th komorę tych embrionów, których ucha wewnętrzne zostały prawidłowo zainfekowane i którym podczas elektroporacji podano prąd o natężeniu co najmniej 60 mA na impuls. Fluorescencyjny dekstran będzie wykrywalny po urodzeniu w tylnym mózgowiu, co umożliwi selekcję szczeniąt, których ucha wewnętrzne poddano manipulacjom podczas embriogenezy (patrz 3.5).
- Przepłucz rogi macicy płynem Ringera z mleczanem. Wprowadź rogi macicy z powrotem do jamy brzusznej. Przepłucz jamę macicy 2–4 ml podgrzanego roztworu Ringera z mleczanem, pozwalając nadmiarowi płynu wypłynąć przez miejsce nacięcia na sterylną obłożkę. Zastąp obłożkę suchym, sterylnym materiałem. Zaszyj ścianę brzusną, używając igły nietnącej oraz wchłanialnej nici 6-0. W przypadku zarówno ściany brzusznej, jak i skóry, zaleca się zastosowanie szwu ciągłego z blokowaniem co drugiego przełożenia.
- Osusz futro samic i podaj niesteroidowy lek przeciwzapalny, taki jak Meloxicam, w formie iniekcji podskórnej. Umieść samicę w wstępnie ogrzanej klatce pooperacyjnej na sterylnym podkładzie. Monitoruj i zapisuj częstość oddechów samic, drożność miejsca nacięcia oraz sprawdzaj, czy z pochwy nie wydostaje się krwawa wydzielina. Krwawienie występuje rzadko, lecz w przypadku jego wystąpienia i braku ustąpienia, przeprowadź eutanazję samicy, gdy ta nadal znajduje się pod wpływem anestezji. Odnotuj czas odzyskania przytomności i podjęcia prób poruszania się. Przenieś samicę z powrotem do kolonii myszy, gdy pojawi się u niej oznaka jedzenia i picia oraz gdy zacznie budować gniazdo. Zazwyczaj dzieje się to w ciągu 12 godzin.
- W dniu narodzin (0. dzień postnatalny) oświetl region tylnego mózgu każdego szczenięcia w lądzie, aby wykryć fluorescencyjny dekstran, używając stereomikroskopu fluorescencyjnego z odpowiednim zestawem filtrów GFP lub Texas Red. Do karmiącej matki zwróć tylko te szczenięta, które wykazują oznakowanie tylnego mózgu.
4. Reprezentatywne wyniki
Rysunek 1. Elektroporacyjnie indukowany transfer genów do rozwijającego się ślimaka. Do otocysty w stadium E11.5 wstrzyknięto plazmid ekspresyjny kodujący wzmocnione zielone białko fluorescencyjne (EGFP) i przeprowadzono elektroporację (parametry serii impulsów: pięć impulsów o napięciu 43 V, czas trwania impulsu 50 msec i przerwa międzyimpulsowa 950 msec). A) Reprezentatywne ucho wewnętrzne szczura w 6. dobie po urodzeniu (P6), którego otocysta została wstrzyknięta i poddana elektroporacji w stadium E11.5, wykazujące ekspresję EGFP od podstawy do środkowego zwoju ślimaka. Ścianę boczną ślimaka usunięto jedynie ze środkowego zwoju i wierzchołka. Progenitory E11.5, z których powstaje wierzchołek, nie zostały przetransfekowane. B) Immunobarwienie całego preparatu ślimaka z (A) z użyciem markera komórek rzęskowych, miozyny 7a (Myo7a), wskazuje, że ekspresja EGFP podąża za przebiegiem organum Corti i jest w dużym stopniu zlokalizowana w nabłonku sensorycznym zawierającym komórki rzęskowe. C) Reprezentatywne ucho wewnętrzne zarodka w stadium E18.5, którego otocysta została wstrzyknięta i poddana elektroporacji w stadium E11.5. Projekcja konfokalna wykazuje ekspresję EGFP w Myo7a-dodatnich sensorycznych komórkach rzęskowych. D) Projekcja konfokalna nabłonka sensorycznego ślimaka z organum Corti w stadium E18.5, wskazująca ekspresję EGFP w wewnętrznych komórkach rzęskowych (ihc), zewnętrznych komórkach rzęskowych (ohc), wewnętrznych komórkach falangialnych (ipc), komórkach filarowych (pc) oraz komórkach Deitersa (dc). Pasek skali w (B) odnosi się do (A).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Transfer genów do rozwijającego się ucha wewnętrznego myszy: Ucho wewnętrzne myszy rozwija się z placody słuchowej podczas pierwszego tygodnia rozwoju po implantacji12,13. Do 9,5 dnia embrionalnego (E9.5) placoda ulega inwaginacji i przekształca się w wypełniony płynem pęcherzyk zwany otocystą2. Prekursory słuchowe w pęcherzyku dają początek komórkom sensorycznym i niesensorycznym w dojrzałym uchu wewnętrznym, a także neuronom unerwiającym mechanicznie wrażliwe komórki rzęsiste w na...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy wydawnictwu Humana Press za zgodę na publikację rysunku przedstawiającego wykonanie pipety do mikroiniekcji, który pierwotnie pojawił się na stronie 130 w pozycji bibliograficznej 11; Larry'emu Dlugasowi i Stevenowi Wongowi z Departamentu Komunikacji Edukacyjnej OHSU za realizację wideo; Larry'emu Dlugasowi za projekt i montaż wideo; Adamowi M. O'Quinnowi, Starszemu Projektantowi w Trion/Envirco, za zaprojektowanie naszej niestandardowej poziomej komory z laminarnym przepływem powietrza oraz Lesowi Goldsmithowi za dostarczenie schematu technicznego; Victorowi Monterroso, MV, MS, PhD oraz Tomowi Chatkuptowi, DVM, z Departamentu Medycyny Porównawczej OHSU, za pomoc w opracowaniu protokołu opieki nad zwierzętami, technik chirurgicznych i schematu profilaktycznej analgezji; Marcelowi Perret-Gentil, DVM, MS, za udostępnienie materiałów dotyczących technik szwów weterynaryjnych; Edwardowi Porsovowi, MS, za zaprojektowanie stacji roboczej do mikroskopii wideo w programie Adobe Premiere Pro; oraz Leah White i Jonasowi Hinckleyowi z LNS Captioning (Portland, OR). Praca ta była finansowana z grantów National Institute on Deafness and other Communication Disorders: DC R01 008595 oraz DC R01 008595-04S2 (dla JB) oraz P30 DC005983 (Oregon Hearing Research Center Core Grant, Peter Gillespie, Główny Badacz).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Mikrokasetka do sterylizacji | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9900a | 8 x 8,5 x 1,25 cala |
| Nożyczki z zaokrąglonymi końcówkami | Fine Science Tools | 14109-09 | |
| Kleszczyki pierścieniowe | Fine Science Tools | 11106-09 | śr. wew. 4,8 mm/śr. zew. 6 mm |
| Pinceta Adsona do tkanek | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Igłotrzymacz | Fine Science Tools | 12502-12 | |
| Taca na strzykawki do testów alergicznych | BD Biosciences | 305536 | |
| Szew 6-0 | Syneture | GL-889 | nici chirurgiczne do zespolenia przewodu pokarmowego o rozmiarze 0,7 metr. |
| roztwór Ringera z mleczanem’do wstrzykiwań USP | Baxter International Inc. | 2B2323 | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Kapilara z borokrzemianowego szkła | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
| Roztwór sodowy Nembutalu | OVATION Pharmaceuticals | NDC 67386-501-52 | |
| MgSO4.7H2O | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Propylenoglikol | Fisher Scientific | P355-1 | |
| Etanol | Sigma-Aldrich | E7023-500 | |
| Meloksykam | Boehringer Ingelheim | NADA 141-219 | |
| Wyciągacz mikropipet | Sutter Instrument Co. | P-97 | filament w pudełku FB255B; należy zapoznać się z publikacją Pipette Cookbook firmy Sutter Instruments |
| Mikro–Ukośnik elektrod | Sutter Instrument Co. | BV-10 | tarcza do fazowania 104C dla dużych pipet; skonsultuj z właścicielem’Podręcznik teorii fazowania |
| Statyw na mikropipety | Warner Instruments | MP-S15T | Dla pipety o średnicy zewnętrznej 1,5 mm oraz żeńskiego portu ciśnieniowego do drenów Picospritzer. |
| Elektroda pęsetowa | Protech International, Inc. | CUY650P5 | średnica zewnętrzna 5 mm |
| Elektroporator z falą prostokątną | Protech International, Inc. | CUY21EDIT | Zalecane użycie pedału nożnego |
| PICOSPRITZER III | Parker Hannifin Corporation | 051-0500-900 | Zalecane użycie pedału nożnego |
| Mikromanipulator z sterowaniem ręcznym | Harvard Apparatus | 640056 | |
| Dygestorium z poziomym przepływem laminarnym | Envirco | Własne modyfikacje LF 630-10554. Schemat dygestorium znajduje się w informacjach uzupełniających. | |
| Stereofluorescenceowy mikroskop operacyjny Leica z silnikiem świetlnym Lumencor SOLA | Bartels and Stout oraz Lumencor | MZ10F z silnikiem oświetleniowym Lumencor SOLA | Zaleca się stosowanie pedałów nożnych do ustawiania ostrości w MZ10F oraz do wyzwalania źródła światła SOLA. |
| dekstran Alexa Fluor 594 | Invitrogen | D22913 | 10 mg/ml, wodny |
| Dekstran Alexa Fluor 488 | Invitrogen | D22910 | 10 mg/ml, wodny |
| Enviro-dri | Shepherd Specialty Papers | www.ssponline.com |
Bibliografia
- Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
- Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear. Int. J. Dev. Biol. 51, 521-533 (2007).
- Kelley, M. W. Regulation of cell fate in the sensory epithelia of the inner ear. Nat. Rev. Neurosci. 7, 837-849 (2006).
- Ohyama, T. BMP signaling is necessary for patterning the sensory and nonsensory regions of the developing mammalian cochlea. J. Neurosci. 30, 15044-15051 (2010).
- Pan, W., Jin, Y., Stanger, B., Kiernan, A. E. Notch signaling is required for the generation of hair cells and supporting cells in the mammalian inner ear. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15798-15803 (2010).
- Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Mitchell, J. C., Ricci, A. J., Brigande, J. V. Functional auditory hair cells produced in the mammalian cochlea by in utero gene transfer. Nature. 455, 537-541 (2008).
- Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edn, The National Academy Press. (2010).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1027-1032 (2007).
- Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Med. Biol. Eng. Comput. 44, 5-14 (2006).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Brigande, J. V., Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Jungwirth, J. J., Bresee, C. S. Electroporation-mediated gene transfer to the developing mouse inner ear. Methods Mol. Biol. 493, 125-139 (2009).
- Morsli, H., Choo, D., Ryan, A., Johnson, R., Wu, D. K. Development of the mouse inner ear and origin of its sensory organs. J. Neurosci. 18, 3327-3335 (1998).
- Sher, A. E. The embryonic and postnatal development of the inner ear of the mouse. Acta. Otolaryngol. , Suppl 285. 1-77 (1971).
- Sheffield, A. M. Viral vector tropism for supporting cells in the developing murine cochlea. Hear Res. 277, 28-36 (2011).
- Bedrosian, J. C. In vivo delivery of recombinant viruses to the fetal murine cochlea: transduction characteristics and long-term effects on auditory function. Mol. Ther. 14, 328-335 (2006).
- Reisinger, E. Probing the functional equivalence of otoferlin and synaptotagmin 1 in exocytosis. J. Neurosci. 31, 4886-4895 (2011).
- Magnani, E., Bartling, L., Hake, S. From Gateway to MultiSite Gateway in one recombination event. BMC Mol. Biol. 7, 46(2006).
- Perret-Gentil, M. Principles of Veterinary Suturing. , The University of Texas at San Antonio. Forthcoming.
- Oesterle, A. P-1000 & P-97 Pipette Cookbook. , Sutter. (2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
