Artykuł metodologiczny

Transfer genów do rozwijającego się ucha wewnętrznego myszy za pomocą elektroporacji in vivo

DOI:

10.3791/3653

⸱

30 czerwca 2012

 ,  , 
1Oregon Hearing Research Center, Oregon Health & Science University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ucho wewnętrzne myszy to narząd zmysłu wywodzący się z placode, którego program rozwojowy jest rozwijany podczas ciąży. Definiujemy technikę transferu genów in utero składającą się z trzech etapów: laparotomii brzusznej myszy, mikroiniekcji przezmacicznej i elektroporacji in vivo. Używamy cyfrowej mikroskopii wideo, aby zademonstrować kluczowe eksperymentalne techniki embriologiczne.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ucho wewnętrzne ssaków ma 6 różnych nabłonków czuciowych: 3 cristae w bańkach kanałów półkolistych; plamki w łagiewce i woreczku; oraz narząd Cortiego w zwiniętym ślimaku. Grzebienia i plamki żółte zawierają przedsionkowe komórki rzęsate, które przekazują bodźce mechaniczne, aby służyć szczególnemu zmysłowi równowagi, podczas gdy słuchowe komórki rzęsate w narządzie Cortiego są głównymi przetwornikami słuchu 1. Specyfikacja losów komórek w tych nabłonkach czuciowych i morfogeneza kanałów półkolistych i ślimaka zachodzi w drugim tygodniu ciąży u myszy i jest w dużej mierze zakończona przed urodzeniem 2,3. Badania rozwojowe ucha wewnętrznego myszy są rutynowo przeprowadzane poprzez pobieranie transgenicznych zarodków w różnych stadiach embrionalnych lub posturodzeniowych w celu uzyskania wglądu w molekularne podstawy fenotypów komórkowych i/lub morfologicznych 4,5. Stawiamy hipotezę, że transfer genów do rozwijającego się ucha wewnętrznego myszy w macicy w kontekście badań nad zyskiem i utratą funkcji stanowi uzupełniające podejście do tradycyjnej transgenezy myszy w celu zbadania mechanizmów genetycznych leżących u podstaw rozwoju ucha wewnętrznego ssaków6.

Eksperymentalny paradygmat do prowadzenia badań nad nieprawidłową ekspresją genów w rozwijającym się uchu wewnętrznym myszy dzieli się na trzy ogólne etapy: 1) laparotomia brzuszna; 2) mikroiniekcja przezmaciczna; oraz 3) elektroporacja in vivo. Laparotomia brzuszna jest techniką chirurgiczną pozwalającą na przeżycie myszy, która umożliwia eksternalizację macicy w celu uzyskania eksperymentalnego dostępu do zagnieżdżonych zarodków7. Mikroiniekcja przezmaciczna polega na użyciu skośnych, szklanych mikropipet kapilarnych w celu wprowadzenia plazmidu ekspresyjnego do światła pęcherzyka usznego lub otocysty. Elektroporacja in vivo polega na zastosowaniu impulsów prądu stałego o fali prostokątnej w celu wkierowania plazmidu ekspresyjnego do komórek progenitorowych8-10.

Wcześniej opisaliśmy tę technikę transferu genów opartą na elektroporacji i dołączyliśmy szczegółowe uwagi na temat każdego kroku protokołu11. Eksperymentalne techniki embriologiczne na myszach mogą być trudne do nauczenia się na podstawie samej prozy i nieruchomych obrazów. W niniejszej pracy pokazujemy 3 etapy procedury transferu genów. Co najważniejsze, wdrażamy cyfrową mikroskopię wideo, aby dokładnie pokazać, jak: 1) zidentyfikować orientację zarodka w macicy; 2) zmienić orientację zarodków w celu celowania w iniekcje do otocysty; 3) mikrowstrzyknąć DNA zmieszane z roztworem barwnika znacznikowego do otocysty w 11,5 i 12,5 dniu embrionalnym; 4) elektroporować wstrzykniętą otocystę; oraz 5) znakować elektropoturowane zarodki do selekcji postnatalnej po urodzeniu. Przedstawiamy reprezentatywne przykłady udanych transfekcji uszu wewnętrznych; obrazkowy przewodnik po najczęstszych przyczynach błędnego celowania w otocysty; omówić, w jaki sposób uniknąć typowych błędów metodologicznych; i przedstawić wytyczne dotyczące napisania protokołu opieki nad zwierzętami z transferem genów in utero.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Laparotomia brzuszna

  1. Znieczulenie matki, której zarodki znajdują się w 11,5 dniu zarodkowym (E11,5; południe w dniu wykrycia czopa pochwowego przypada na 0,5 dzień rozwoju zarodka) poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie roztworu znieczulającego pentobarbitalu sodu (7,5 μl na gram masy ciała). Roboczy roztwór znieczulający: 180 μl 50 mg/ml pentobarbitalu roztworu sodu; 100 μl absolutnego alkoholu etylowego; 320 μL wodnego roztworu siarczanu magnezu o stężeniu 65 mg/ml (moduluje napięcie macicy); oraz 400 μl glikolu propylenowego (nośnik mieszalny ze składnikami wodnymi i organicznymi).
  2. Oceń kompletność znieczulenia, przeprowadzając testy na szkodliwe bodźce: ściskanie łapy, szczypanie ogona i reakcja mrugania na dotyk policzków i wibracji. Nałóż sterylną maść okulistyczną na rogówkę.
  3. Ogol sierść na brzuchu od okolicy nadłonowej do klatki piersiowej za pomocą nożyc i cienkiego ostrza (ostrze Oster #40). Dezynfekuj jamę brzuszną kolejno 70% etanolem, 10% jodonem powidonu (Betadine) i 70% etanolem. Połóż mysz brzuchem do dołu na sterylnej zasłonie, a następnie połóż na poduszce grzewczej lub ciepłej płycie (37 °C) na 2-5 minut.
  4. Naciąć skórę brzucha w brzusznej linii środkowej nożyczkami z końcówką kulkową. Przedłuż nacięcie o 10-14 mm. Zidentyfikuj linea alba, naczyniowy, biały pas tkanki łącznej wzdłuż brzusznej linii środkowej ściany brzucha. Naciąć linea alba nożyczkami z końcówką kulkową i przedłużyć nacięcie o 10-14 mm. Natychmiast przepłukać jamę brzuszną podgrzanym (37 °C) roztworem Ringera z mleczanami.
  5. Uzewnętrznij dwa rogi macicy za pomocą kleszczy pierścieniowych, nie wywierając nadmiernego nacisku na miejsca implantacji. Przepłukać uzewnętrznione rogi macicy wstępnie podgrzanym, mleczanowym roztworem Ringera.

2. Mikroiniekcja przezmaciczna

  1. Wykonać grubościenną, kapilarną pipetę do mikroiniekcji ze szkła borokrzemianowego o następujących właściwościach: średnica zewnętrzna 12-16 μm i skos 20 stopni. W ściągaczu do pipet Sutter P-97 z małym filamentem w pudełku użyj następującego programu: ciepło = test rampy plus 3 jednostki; ciśnienie = 200; ciąg = 0; prędkość = 46; czas = 100). W przypadku ukosowarki Sutter BV-10 należy używać tarczy ściernej 104C (złotej) do pipet o dużej średnicy. Zawiesić plazmid ekspresyjny na poziomie 3-4 μg/μL w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem wapnia (pH 7,2-7,4). Dodaj krystaliczną, szybką zieleń do skoncentrowanego DNA, delikatnie wiruj przez 30 sekund i wiruj z prędkością 10 000 g przez 10 sekund. Minimalna ilość szybkiej zieleni wymagana do wizualnego śledzenia skuteczności wstrzyknięcia jest określana empirycznie. Napełnij pipetę ze skosem roztworem DNA/szybkim zielonym roztworem. Podłącz załadowaną pipetę do mikroiniekcji do uchwytu pipety wtryskiwacza ciśnieniowego (Picospritzer wykorzystujący >99% czystego azotu jako gaz źródłowy).
  2. Oświetl macicę światłem halogenowym o niskiej intensywności, aby uwidocznić zarodek w miejscu implantacji. Zidentyfikuj bijące serce, pęcherzyki mózgowe, pąki kończyn, powstającą 4. komorę tyłomózgowia i oko. Nawadniaj macicę co 2 minuty podgrzanym, laktowanym roztworem Ringera, aby utrzymać nawodnienie. Wywieraj delikatny nacisk na macicę, aby zmienić orientację zarodka i zidentyfikować anatomiczne punkty orientacyjne wymienione powyżej.
  3. Ustaw zarodek tak, aby zidentyfikować pierwotną żyłę głowową, której przednie i tylne gałęzie otaczają obszar mezenchymalny, w którym znajduje się otocysta. Właściwa otocysta nie może być widoczna przez prześwietlenie macicy. Ototorbiel znajduje się w połowie drogi między przednią i tylną gałęzią pierwotnej żyły głowy, które wraz z głównym pniem żyły tworzą kształt słupków lub słupków bramkowych na boisku do futbolu amerykańskiego. Otocysta znajduje się w połowie drogi między słupkami.
  4. Wprowadzić pipetę do wstrzykiwań przez macicę po trajektorii zgodnej z przypuszczalnym położeniem otocysty. Pulsuj mikrowstrzykiwaczem raz po przejściu przez macicę, aby uwidocznić barwnik znacznikowy i przybliżyć położenie końcówki pipety. Przesuń pipetę pod kontrolą mikrometru i ponownie wykonaj pulsację, aby ocenić głębokość. Następnie wsuń pipetę do mezenchymy bocznej głowy i wielokrotnie pulsuj. Skuteczne celowanie w otocysty ujawni zwężający się kształt przewodu endolimfatycznego grzbietowo i kształt muszli muszli przegrzebka w przedsionku. Zwolnij nacisk na macicę, jednym ruchem wyjmij pipetę z zarodka/macicy i natychmiast przepłucz macicę podgrzanym, mlecznym roztworem Ringera.

3. Elektroporacja in vivo

  1. Przepłukać macicę roztworem Ringera z mleczanami. Świeżo zastosowany roztwór Ringera z mleczanami jest niezbędny do elektrycznego sprzężenia elektrod łopatkowych z macicą. Zwilżyć wolframowe powierzchnie elektrod laktowanym ogniwem Ringera. Wyśrodkuj wstrzykniętą otocystę na ścieżce elektrod. Delikatnie ściśnij macicę łopatkami do elektroporacji. Katoda styka się ze ścianą macicy bocznie do wstrzykniętej otocysty, a anoda styka się ze ścianą macicy przylegającą do niewstrzykniętej otocysty. Uruchom ciąg impulsów fali prostokątnej za pomocą przełącznika nożnego na elektroporatorze. Parametry elektroporacji to: 5, 50 ms impulsów przy 43 V na impuls i 950 ms opóźnienia interpulsu. Natychmiast przepłukać macicę po dostarczeniu ciągu impulsów. Zapisz prąd dostarczany do tkanki: 60-100 mAmps wystarcza do transfekcji komórek progenitorowych nabłonka. Wstrzyknąć i elektropoturować 4-6 zarodków E11,5 na matkę.
  2. Wykonać drugą, niezależną przezmaciczną mikroiniekcję wodnego dekstranu fluorescencyjnego (Alexa Fluor 488, jeśli plazmid ekspresyjny koduje białko czerwonej fluorescencji lub Alex Fluor 594, jeśli plazmid ekspresyjny koduje białko fluorescencyjne zielone) do 4. komory tych zarodków, których ucho wewnętrzne jest dokładnie wstrzyknięte, a podczas elektroporacji dostarczono co najmniej 60 mAmperów prądu na impuls. Dekstran fluorescencyjny będzie wykrywalny po urodzeniu w tyłomózgowiu i umożliwi selekcję młodych, których ucho wewnętrzne było manipulowane podczas embriogenezy (patrz 3.5).
  3. Udrażniaj rogi macicy za pomocą laktowanego Ringera. Ponownie włóż rogi macicy do jamy brzusznej. Przepłucz jamę macicy 2-4 ml wstępnie podgrzanego, mlecznego roztworu Ringera i pozwól, aby przelew spłynął z miejsca nacięcia na sterylną zasłonę. Zastąp drapowanie suchym, sterylnym materiałem. Zszyj ścianę brzucha igłą nietnącą i szwem wchłanialnym 6-0. Preferujemy ścieg biegowy, blokujący co drugi ścieg, zarówno na ścianie brzucha, jak i na skórze.
  4. Wysuszyć sierść matek i podać niesteroidowy środek przeciwzapalny, taki jak meloksykam, we wstrzyknięciu podskórnym. Umieść zaporę z powrotem w ogrzanej klatce regeneracyjnej na sterylnym serwowaniu. Monitoruj i rejestruj oddechy zapór, drożność miejsca nacięcia i pochwę pod kątem krwawej wydzieliny. Krwawienie jest rzadkie, ale jeśli występuje i nie ustępuje, należy poddać matkę eutanazji, gdy jest jeszcze pod narkozą. Zwróć uwagę na czas, w którym odzyskuje przytomność i próbuje się poruszać. Przywróć tamę do kolonii myszy, gdy wykaże oznaki jedzenia i picia i zacznie budować gniazdo. Zazwyczaj dzieje się to w ciągu 12 godzin.
  5. Po urodzeniu (0 dzień po urodzeniu) należy wykonać błysk w tylnym obszarze mózgu każdego szczeniaka w miocie, aby wykryć fluorescencyjny dekstran za pomocą stereofluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego z zestawem filtrów GFP lub Texas Red, w zależności od potrzeb. Do matki karmiącej należy wracać tylko te szczenięta, które wykazują oznakowanie tylnomózgowia.

4. Reprezentatywne wyniki

figure-protocol-1
Rysunek 1. Transfer genów za pośrednictwem elektroporacji do rozwijającego się ślimaka. Otocyście E11.5 wstrzyknięto plazmid ekspresyjny kodujący wzmocnione białko zielonej fluorescencji (EGFP) i poddano elektroporacji (parametry ciągu impulsów: pięć, 43 wolty impulsów przy 50 ms/impuls i 950 ms opóźnienie interimpulsu). A) Reprezentatywne ucho wewnętrzne szczeniaka w 6. dniu po urodzeniu (P6), któremu wstrzyknięto otocystę i elektroporowano w stężeniu E11,5, wykazując ekspresję EGFP od podstawy do środkowego skrętu ślimaka. Boczna ściana ślimaka została usunięta tylko ze środkowego zwoju i wierzchołka. Przodkowie E11.5, którzy dają początek wierzchołkowi, nie byli transfekowani. B) Barwienie immunologiczne całego ślimaka w (A) markerem komórek rzęsatych, miozyną 7a (Myo7a), wskazuje, że ekspresja EGFP podąża za trajektorią narządu Cortiego i jest rażąco zlokalizowana w nabłonku czuciowym zawierającym komórki rzęsate. C) Reprezentatywne ucho wewnętrzne z zarodka E18.5, którego otocysta została wstrzyknięta i elektroporanowana w E11.5. Laserowa projekcja konfokalna wykazuje ekspresję EGFP w czuciowych komórkach rzęsatych Myo7a-dodatnich. D) Laserowa projekcja konfokalna nabłonka czuciowego ślimaka z narządu E18.5 Cortiego, wskazująca na ekspresję EGFP w wewnętrznych komórkach rzęsatych (ihc), zewnętrznych komórkach rzęsatych (ohc), wewnętrznych komórkach paliczkowych (ipc), komórkach filarowych (pc) i komórkach Deitera (dc). Podziałka liniowa w (B) odnosi się do (A).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transfer genów do rozwijającego się ucha wewnętrznego myszy: Ucho wewnętrzne myszy rozwija się z plakodu usznego w pierwszym tygodniu rozwoju poimplantacyjnego12,13. Do 9,5 dnia embrionalnego (E9,5) placode wniknął i przekształcił się w wypełniony płynem pęcherzyk zwany otocystą2. Prekursory otu w pęcherzyku dają początek komórkom czuciowym i nieczuciowym w dojrzałym uchu wewnętrznym, a także neuronom, które unerwiają wrażliwe mechanicznie komórki rzęsate w nabłonku czuciowym przeds...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Humana Press za zgodę na publikację rysunku produkcji pipet do mikroiniekcji, który pierwotnie pojawił się na stronie 130 w odnośniku 11; Larry Dlugas i Steven Wong, Departament Komunikacji Edukacyjnej OHSU, za wideografię; Larry Dlugas za projekt i montaż wideo; Adamowi M. O'Quinnowi, starszemu projektantowi, Trion/Envirco za zaprojektowanie naszego niestandardowego okapu z poziomym przepływem laminarnym oraz Lesowi Goldsmithowi za dostarczenie schematu technicznego; Victor Monterroso, MV, MS, PhD i Tom Chatkupt, DVM, Wydział Medycyny Porównawczej OHSU, za wskazówki dotyczące naszego protokołu opieki nad zwierzętami, technik chirurgicznych i profilaktycznego schematu analgezji; Marcelowi Perret-Gentilowi, DVM, MS, za udostępnienie materiałów informacyjnych na temat weterynaryjnych technik szycia; mgr Edward Porsov za zaprojektowanie naszej stacji roboczej do mikroskopii wideo Adobe Premiere Pro; oraz Leah White i Jonas Hinckley z LNS Captioning (Portland, Oregon). Prace te były wspierane przez granty z National Institute on Deafness and other Communication Disorders: DC R01 008595 i DC R01 008595-04S2 (do JB) oraz P30 DC005983 (Oregon Hearing Research Center Core Grant, Peter Gillespie, główny badacz).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikro walizka sterylizacyjna Roboz Surgical Instruments Co.RS-9900a8X8,5X1,25 cala
Nożyczki z końcówką kulkowąFine Science Tools14109-09
Kleszcze pierścieniowe Fine Science Tools11106-09o średnicy wewnętrznej 4,8 mm ID / 6 mm OD
Fine Science Tools11027-12
Sterownik igiełFine Science Tools12502-12
Tacka na strzykawkę alergicznąBD Biosciences
Szew 6-0SynetureGL-8890,7 metryczny szew żołądkowo-jelitowy
Lactated Ringer' s Wtrysk USPBaxter Internationl Inc.2B2323
Szybka zielonaSigma-AldrichF7258
Kapilara ze szkła borokrzemianowegoAparat Harvarda30-0053
Roztwór sodu nembutaluOVATION PharmaceuticalsNDC 67386-501-52
MgSO4.7H2OFisher ScientificM63-500
Glikol propylenowyFisher ScientificP355-1
EtanolSigma-AldrichE7023-500
MeloxicamBoehringer IngeheimNADA 141-219
Ściągacz do mikropipetSutter Instrument Co.Filament pudełkowy P-97FB255B; zapoznaj się z książką kucharską pipet od Sutter
instruments Micr– lectrode BevelerSutter Instrument Co.Tarczado ukosowania BV-10 104C do dużych pipet; skonsultuj się z właścicielem s podręcznik do teorii ukosowania
Uchwyt na mikropipetyWarner InstrumentsMP-S15TDo pipety o średnicy zewnętrznej 1,5 mm i żeńskiego portu ciśnieniowego do rurki Picospritzer.
Elektroda w stylu pęsetyProtech International, Inc.CUY650P5
Elektroporator prostokątnyProtech International, Inc.CUY21EDITZalecany pedał nożny
PICOSPRITZER IIIParker Hannifin Corporation051-0500-900Zalecany pedał nożny
Sterowanie ręczne MikromanipulatorAparat Harvard640056
Pozioma ławka z przepływem laminarnymEnvircoNiestandardowe modyfikacje LF 630-10554. Patrz informacje dodatkowe dla schematu okapu.
Stereofluorescencyjny mikroskop preparacyjny Leica z silnikiem oświetleniowym Lumencor SOLABartels i Stout oraz LumencorMZ10F z silnikiem świetlnym Lumencor SOLAZalecane są pedały do ustawiania ostrości MZ10F i uruchamiania silnika świetlnego SOLA
Alexa Fluor 594 DextranInvitrogenD2291310mg/ml, wodny
Alexa Fluor 488 DextranInvitrogenD2291010mg/ml, wodny
Specjalistyczne papierywww.ssponline.com
Kleszczyki do tkanek Adson 305536 o średnicy zewnętrznej 5 mm Enviro-dri Shepherd

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
  2. Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear. Int. J. Dev. Biol. 51, 521-533 (2007).
  3. Kelley, M. W. Regulation of cell fate in the sensory epithelia of the inner ear. Nat. Rev. Neurosci. 7, 837-849 (2006).
  4. Ohyama, T. BMP signaling is necessary for patterning the sensory and nonsensory regions of the developing mammalian cochlea. J. Neurosci. 30, 15044-15051 (2010).
  5. Pan, W., Jin, Y., Stanger, B., Kiernan, A. E. Notch signaling is required for the generation of hair cells and supporting cells in the mammalian inner ear. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15798-15803 (2010).
  6. Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Mitchell, J. C., Ricci, A. J., Brigande, J. V. Functional auditory hair cells produced in the mammalian cochlea by in utero gene transfer. Nature. 455, 537-541 (2008).
  7. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edn, The National Academy Press. (2010).
  8. Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1027-1032 (2007).
  9. Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Med. Biol. Eng. Comput. 44, 5-14 (2006).
  10. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
  11. Brigande, J. V., Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Jungwirth, J. J., Bresee, C. S. Electroporation-mediated gene transfer to the developing mouse inner ear. Methods Mol. Biol. 493, 125-139 (2009).
  12. Morsli, H., Choo, D., Ryan, A., Johnson, R., Wu, D. K. Development of the mouse inner ear and origin of its sensory organs. J. Neurosci. 18, 3327-3335 (1998).
  13. Sher, A. E. The embryonic and postnatal development of the inner ear of the mouse. Acta. Otolaryngol. , Suppl 285. 1-77 (1971).
  14. Sheffield, A. M. Viral vector tropism for supporting cells in the developing murine cochlea. Hear Res. 277, 28-36 (2011).
  15. Bedrosian, J. C. In vivo delivery of recombinant viruses to the fetal murine cochlea: transduction characteristics and long-term effects on auditory function. Mol. Ther. 14, 328-335 (2006).
  16. Reisinger, E. Probing the functional equivalence of otoferlin and synaptotagmin 1 in exocytosis. J. Neurosci. 31, 4886-4895 (2011).
  17. Magnani, E., Bartling, L., Hake, S. From Gateway to MultiSite Gateway in one recombination event. BMC Mol. Biol. 7, 46(2006).
  18. Perret-Gentil, M. Principles of Veterinary Suturing. , The University of Texas at San Antonio. Forthcoming.
  19. Oesterle, A. P-1000 & P-97 Pipette Cookbook. , Sutter. (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

laparotomia brzusznamikroiniekcja przezmacicznainiekcja do p cherzyka s uchowego115 dzie embrionalnytechnika transferu gen welektrody opatkowateanaliza ekspresji GFPprotok opieki nad zwierz tami

Powiązane artykuły