Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie testu Enzyme-linked Immunospot (ELISpot) dla interferonu $\gamma$ do charakterystyki nowych epitopów limfocytów T wirusa papilomawirusa ludzkiego

11.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3657

⸱

8 marca 2012

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Parasitology, College of Basic Medical Sciences, China Medical University , 2Department of Obstetrics and Gynecology, College of Medicine, University of Arkansas for Medical Sciences , 3Department of Pathology, College of Medicine, University of Arkansas for Medical Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Charakterystyka epitopów limfocytów T patogenów wywołujących infekcje miejscowe, takich jak wirus brodawczaka ludzkiego, stanowi wyzwanie ze względu na ograniczoną liczbę krążących limfocytów T. Opisano metodę, w której rzadkie limfocyty T zostały wyizolowane i scharakteryzowane, zaczynając od bardzo małej liczby komórek.

Streszczenie

Opracowano protokół pozwalający przezwyciężyć trudności w izolowaniu i charakteryzowaniu rzadkich limfocytów T specyficznych dla patogenów wywołujących zakażenia miejscowe, takich jak wirus brodawczaka ludzkiego (HPV). Etapy procedury obejmują identyfikację regionu lub regionów białek HPV zawierających epitopy dla limfocytów T u badanego, selekcję limfocytów T specyficznych dla peptydów na podstawie sekrecji interferonu-γ (IFN-γ) oraz hodowlę i charakteryzację klonów limfocytów T (Rys. 1). Osoba 1 była pacjentką, u której niedawno w biopsji zdiagnozowano wysokostopniową dysplazję wewnątrznabłonkowa łуskawkową i która w dniu pobrania limfocytów T poddała się zabiegowi pętlowej ekscyzji elektrycznej w ramach leczenia1. Region w białkach E6 i E7 wirusa brodawczaka ludzkiego typu 16 (HPV 16) zawierający epitop dla limfocytów T zidentyfikowano za pomocą testu immunospot (ELISPOT) dla IFN-γ, przeprowadzonego z użyciem nakładających się peptydów syntetycznych (Rys. 2). Dane z tego testu posłużyły nie tylko do identyfikacji regionu zawierającego epitop dla limfocytów T, ale także do oszacowania liczby specyficznych dla epitopu limfocytów T i ich izolacji na podstawie sekrecji IFN-γ przy użyciu dostępnych komercyjnie kulek magnetycznych (zestaw do izolacji limfocytów T CD8, Miltenyi Biotec, Auburn CA). Wyselekcjonowane limfocyty T wydzielające IFN-γ rozcieńczono i hodowano pojedynczo w obecności mieszaniny napromieniowanych komórek zasilających (feeder cells), aby wspomóc wzrost pojedynczego limfocytu T na dołek. Klony limfocytów T przesiewano za pomocą testu IFN-γ ELISPOT w obecności peptydów pokrywających zidentyfikowany region oraz autologicznych limfoblastoidalnych komórek B (LCL) transformowanych wirusem Epsteina-Barr (LCL, uzyskanych zgodnie z opisem Walls i Crawforda)2, aby zminimalizować liczbę potrzebnych komórek klonalnych limfocytów T. Zamiast stosować 1 x 105 komórek na dołek, co jest typowe dla testów ELISPOT1,3, zastosowano 1 000 komórek klonalnych limfocytów T w obecności 1 x 105 autologicznych LCL, co drastycznie zmniejszyło liczbę wymaganych komórek klonalnych. Autologiczne LCL służyły nie tylko do prezentacji antygenów peptydowych komórkom klonalnym limfocytów T, ale także do utrzymania wysokiej gęstości komórek w dołkach, co umożliwiło specyficznym dla epitopu klonalnym limfocytom T sekrecję IFN-γ. Zapewnia to pomyślne przeprowadzenie testu IFN-γ ELISPOT. Podobnie testy IFN-γ ELISPOT wykorzystano do scharakteryzowania minimalnej i optymalnej sekwencji aminokwasowej epitopu limfocytów T CD8 (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) oraz jego elementu restrykcyjnego HLA klasy I (B58). Test IFN-γ ELISPOT przeprowadzono również z użyciem autologicznych LCL zainfekowanych wirusem ospy krowiej (vaccinia virus) ekspresującym białko E6 lub E7 HPV 16. Wynik wykazał, że epitop limfocytów T E6 był przetwarzany endogennie. Wykazano również krzyżowe rozpoznawanie homologicznego epitopu limfocytów T innych typów HPV wysokiego ryzyka. Metoda ta może być również stosowana do opisu epitopów limfocytów T CD44.

Protokół

Poprzez przeprowadzenie testu IFN-γ ELISPOT z wykorzystaniem linii komórek T CD8 wywodzącej się od Osoby 1, ustalono, że region 46-70 białka E6 HPV 16 zawiera epitop dla limfocytów T1 (Rys. 2), a limfocyty T specyficzne dla tego epitopu zostały wyselekcjonowane na podstawie sekrecji IFN-γ przed rozpoczęciem niniejszego protokołu (Rys. 1).

1. Rozcieńczanie ograniczające dla limfocytów T specyficznych dla epitopu

  1. Przygotować mieszaninę komórek karmicielskich, łącząc napromieniowane (4,000 rad) allogeniczne mononuklearne komórki krwi obwodowej (PBMCs) w stężeniu 5 x 105 komórek/ml, napromieniowane (5,000 rad) allogeniczne LCLs w stężeniu 5 x 104 komórek/ml oraz fitohemaglutyninę (PHA) w stężeniu 0,1 μg/ml, wykorzystując pełną pożywkę Yssela zawierającą 1% puli surowicy ludzkiej. Przez cały protokół komórki należy traktować w warunkach sterylnych.
  2. Wykonać rozcieńczenia seryjne wyizolowanych limfocytów T specyficznych dla epitopu (Rys. 3), używając mieszaniny komórek karmicielskich, aż do osiągnięcia stężenia 0,5 komórki/100 μl lub 5 komórek/1 ml. Należy użyć około 3 x 103 limfocytów T specyficznych dla epitopu.
  3. Nanieść 100 μl/dołka rozcieńczonych limfocytów T specyficznych dla epitopu do łącznie od 30 do 60 płytek 96-dołkowych z okrągłym dnem, używając pipety wielokanałowej.
  4. Inkubować płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2.
  5. W 5. dniu dodać 100 μl pełnej pożywki Yssela zawierającej 20 u/ml rekombinowanej ludzkiej interleukiny-2 (rhIL-2).
  6. Wizualnie zidentyfikować rosnące klony limfocytów T w płytkach 96-dołkowych z okrągłym dnem na podstawie dużego rozmiaru osadu na dnie.
  7. W 11. do 14. dniu przygotować nową mieszaninę komórek karmicielskich, łącząc napromieniowane (4,000 rad) allogeniczne PBMCs w stężeniu 1 x 106 komórek/ml, napromieniowane (5,000 rad) allogeniczne LCLs w stężeniu 1 x 105 komórek/ml oraz PHA w stężeniu 0,1 μg/ml, wykorzystując pełną pożywkę Yssela. Nanieść tę nową mieszaninę komórek karmicielskich do płytki 24-dołkowej w objętości 1 ml/dołek.
  8. Odessać poszczególne klony limfocytów T z każdego dołka za pomocą mikropipety o objętości około 200 μl.
  9. Przenieść poszczególne klony limfocytów T do płytki 24-dołkowej zawierającej nową mieszaninę komórek karmicielskich. Powtarzać czynność, aż wszystkie klony limfocytów T zostaną przeniesione.

2. Identyfikacja klonów limfocytów T specyficznych dla epitopów za pomocą wysokoprzepustowego testu przesiewowego ELISPOT (adaptacja metody opisanej przez Larsson et al.5)

  1. Pokryć 2 sterylne płytki ELISPOT (Multiscreen-HA; Millipore, Bedford, MA) przeciwciałem monoklonalnym anty-IFN-γ jako przeciwciałem pierwszorzędowym w ilości 50 μl/dołek (klon D1K, Mabtech, Sztokholm, Szwecja), rozcieńczonym do stężenia 5 μg/ml w sterylnej soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) klasy do hodowli tkankowych, przez minimum 1 hr w 4 °C.
  2. Przemyć dołki, dodając i usuwając 150 do 200 μl/dołek PBS. Powtórzyć czynność jeszcze trzy razy.
  3. Zablokować wiązania nieswoiste, dodając 50 μl/dołek puli surowicy ludzkiej rozcieńczonej do 5% w RPMI 1640 na co najmniej 1 hr w 37 °C, 5% CO2. Duże pęcherzyki powietrza usunąć, przebijając je sterylną igłą.
  4. Nanieść 1 x 105 autologicznych LCLs2 w 50 μl RPMI 1640 z 5% surowicy ludzkiej na dołek.
  5. Wymieszać komórki w każdym dołku płytki 24-dołkowej zawierającej klony limfocytów T za pomocą pipety 1 ml. Przenieść 100 μl z dołka do sterylnej probówki Eppendorf. Dodać 500 μl RPMI 1640 z 5% pulą surowicy ludzkiej do każdej probówki Eppendorf i wirować w mikrowirówce przy 3,000 RPM przez 5 min.
  6. Zlać nadsącz z probówek Eppendorf, dodać 110 μl RPMI 1640 z 5% surowicą ludzką do każdej probówki i resuspenderć komórki za pomocą wortexa.
  7. Nanieść po 50 μl medium zawierającego konkretne klony limfocytów T (niezależnie od liczby komórek w celu szybkiego przesiewu) do odpowiednio rozmieszczonych dołków na obu płytkach. Powtórzyć dla wszystkich klonów limfocytów T. Dzięki pominięciu etapów zliczania komórek można jednocześnie przetestować dużą liczbę klonów limfocytów T.
  8. Połączyć pozostałe medium z kilku probówek Eppendorf i nanieść po 50 μl do kolejnych odpowiednio rozmieszczonych dołków, które będą służyć jako dołki kontroli pozytywnej, do których zostanie dodany PHA.
  9. Dodać po 50 μl RPMI 1640 z 5% pulą surowicy ludzkiej do każdego dołka, który będzie służyć jako dołek kontroli negatywnej, niezawierający klonów limfocytów T.
  10. Dodać peptydy zawarte w regionie pozytywnym (Tabela 1) w ilości 50 μl/dołek do końcowego stężenia 10 μM/peptyd. Roztwory zapasowe peptydów są rozpuszczone w stężeniu 5mM każdy w 5% - 15% dimetylosulfoksydzie w PBS, w zależności od rozpuszczalności peptydów. Każdy dołek będzie zawierał objętość 200 μl (50 μl blokera, 50 μl LCLs, 50 μl klonów limfocytów T i 50 μl peptydów).
  11. Dodać 50 μl PHA (stężenie końcowe 10 μg/ml) do dołków kontroli pozytywnej.
  12. Dodać 50 μl RPMI 1640 z 5% pulą surowicy ludzkiej do dołków kontroli negatywnej.
  13. Inkubować przez noc w 37 °C, 5% CO2.
  14. Przemyć dołki, dodając i usuwając 150 do 200 μl/dołek PBS z 0,05% Tween-20. Powtórzyć czynność jeszcze trzy razy.
  15. Dodać 50 μl PBS zawierającego 1 μg/ml biotynlowanego przeciwciała monoklonalnego anty-IFN-γ (klon 7B-6, Mabtech) i inkubować w 37 °C, 5% CO2 przez 2 hr. Duże pęcherzyki powietrza usunąć, przebijając je igłą.
  16. Na 20 min przed końcem 2-godzinnej inkubacji przygotować kompleks awidyny z biotynlowaną peroksydazą chrzanową H (zestaw Vectastain Elite ABC; Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA), dodając po 2 krople roztworu A i roztworu B do 5 ml PBS zawierającego 0,1% Tween-20.
  17. Przemyć dołki, dodając i usuwając 150 do 200 μl/dołek PBS z 0,1% Tween-20. Powtórzyć czynność jeszcze trzy razy.
  18. Nanieść 50 μl/dołek biotynlowanej peroksydazy chrzanowej H i inkubować w 37 °C, 5% CO2 przez 1 hr. Duże pęcherzyki powietrza usunąć, przebijając je igłą.
  19. Przemyć dołki, dodając i usuwając 150 do 200 μl/dołek PBS z 0,1% Tween-20. Powtórzyć czynność jeszcze trzy razy.
  20. Nanieść 50 μl/dołek odczynnika barwiącego zwanego stabilną diaminobenzydyną (DAB) w temperaturze pokojowej na 5 min. Duże pęcherzyki powietrza usunąć, przebijając je igłą.
  21. Przemyć dołki, dodając i usuwając 150 do 200 μl/dołek wody dejonizowanej. Powtórzyć czynność jeszcze dwa razy.
  22. Pozostawić płytkę do całkowitego wyschnięcia.
  23. Policzyć plamki za pomocą mikroskopu stereoskopowego lub automatycznego czytnika ELISPOT (AID ELISPOT Classic Reader; Autoimmun Diagnostika GmbH, Strassberg, Niemcy).

3. Potwierdzenie epitopowo-specyficznego charakteru klonów limfocytów T za pomocą testu ELISPOT (Rys. 4)

  1. Wybrać dobrze rosnące klony limfocytów T. Przeprowadzić analizę ELISPOT zgodnie z powyższym opisem, z wyjątkiem tego, że w każdej studzience należy wysiać 1 x 105 autologicznych LCL oraz 1 x 103 komórek klonu limfocytów T wraz z każdym z trzech peptydów zawartych w regionie (Tabela 1) w stężeniu 10 μM. Analizę należy przeprowadzić w dubletach lub triplikatach.

4. Określanie, czy epitop jest przetwarzany endogennie (Rys. 5)

  1. Wybrać dobrze rosnące klony limfocytów T. Wykonać test ELISPOT zgodnie z powyższym opisem, z wyjątkiem tego, że w każdej studzience należy wysiać 1 x 105 autologicznych LCL zakażonych rekombinowanym wirusem ospy krowiej wykazującym ekspresję HPV 16 E6, E7 6 (przed testem) lub niezyfikowanych (typ dziki, szczep WR) (krotność zakażenia wynosząca 5 przez 1 hr) oraz 1 x 103 komórek klonu limfocytów T.

5. Charakterystyka minimalnej i optymalnej sekwencji epitopu limfocytów T (Rys. 6a, 6b i 6c)

  1. Wybrać dobrze rosnące klony limfocytów T. Przeprowadzić analizę ELISPOT zgodnie z powyższym opisem, z wyjątkiem tego, że w każdej studzience należy zasiać 1 x 105 autologicznych LCL oraz 1 x 103 komórek klonu limfocytów T wraz z jednym z serii nakładających się 9-merowych peptydów pokrywających dany region (Tabela 1) w stężeniu 10 μM (Rys. 6a).
  2. Przeprowadzić analizę ELISPOT zgodnie z powyższym opisem, z wyjątkiem tego, że w każdej studzience należy zasiać 1 x 105 autologicznych LCL oraz 1 x 103 komórek klonu limfocytów T wraz z jednym z serii peptydów o różnej długości (Tabela 1) w stężeniu 10 μM (Rys. 6b).
  3. Przeprowadzić analizę ELISPOT zgodnie z powyższym opisem, z wyjątkiem tego, że w każdej studzience należy zasiać 1 x 105 autologicznych LCL oraz 1 x 103 komórek klonu limfocytów T wraz z kilkoma peptydami, które z największym prawdopodobieństwem zawierają minimalną i optymalną sekwencję aminokwasową. Peptydy te należy przetestować w zakresie stężeń od 10-5 M do 10-10 M (Rys. 6c).

6. Identyfikacja elementu restrykcyjnego za pomocą testu ELISPOT (Rys. 7)

  1. Wybrać dobrze rosnące klony limfocytów T. Przeprowadzić analizę ELISPOT zgodnie z powyższym opisem, z wyjątkiem tego, że w każdej studzience należy wysiać 1 x 103 komórek klonu limfocytów T wraz z peptydem minimalnym i optymalnym w stężeniu 10 μM. Należy również wysiać sto tysięcy allogenicznych linii LCL na studzinkę, które dzielą jedną lub dwie cząsteczki HLA klasy I z badaną osobą.

7. Badanie reaktywności krzyżowej klonów limfocytów T specyficznych dla epitopu względem homologicznych sekwencji aminokwasowych innych typów HPV wysokiego ryzyka (Ryc. 8)

  1. Wybrać dobrze rosnące klony limfocytów T. Przeprowadzić test ELISPOT zgodnie z powyższym opisem, z wyjątkiem tego, że w każdej studzience należy wysiać 1 x 103 komórek klonu limfocytów T wraz z peptydami (10 μM) zawierającymi homologiczne sekwencje aminokwasowe innych typów HPV wysokiego ryzyka (Tabela 2). W odpowiednich studzienkach należy również wysiać sto tysięcy autologicznych LCL na studzienkę oraz allogeniczne LCL wykazujące ekspresję ograniczających cząsteczek HLA klasy I.

8. Reprezentatywne wyniki

Prezentowany tutaj podmiot 1 był 22-letnią kobietą rasy afroamerykańskiej z niedawną historią wysokiego stopnia wewnątrznabłonkowej zmiany łuskowatej zdiagnozowanej w biopsji. Zgłosiła się na zabieg pętlowej ekscyzji elektrycznej w dniu, w którym pobrano limfocyty T1. Analiza ELISPOT jej linii limfocytów T CD8 wykazała, że region HPV 16 E6 46-70 (każdy region testowany jest za pomocą 3 nakładających się peptydów 15-merowych) zawiera epitop limfocytów T (Rys. 2). Liczba epitop-specyficznych limfocytów T wyselekcjonowanych na podstawie sekrecji IFN-γ wyniosła 1,2 x 105. Po przeprowadzeniu rozcieńczeń ograniczających (Rys. 3) na jednej piątej wyselekcjonowanych komórek, pozyskano 262 klony limfocytów T. Pozostałe wyselekcjonowane komórki nie zostały wykorzystane, ponieważ pierwsza próba klonowania limfocytów T zakończyła się sukcesem. Wyskoprzepustowa analiza przesiewowa ELISPOT przeprowadzona na 94 z tych klonów zidentyfikowała 62 klony dodatnie, które można łatwo zidentyfikować makroskopowo na płytce ELISPOT. Pozostałe klony limfocytów T nie były testowane, ponieważ pierwsza analiza ELISPOT zidentyfikowała peptyd-specyficzne klony limfocytów T. Osiem dobrze rosnących klonów dodatnich przetestowano ponownie z trzema pojedynczymi peptydami 15-merowymi obejmującymi ten region (Rys. 4). Wszystkie klony limfocytów T były dodatnie dla peptydów HPV 16 E6 51-65, 6 z 8 klonów było dodatnich dla peptydu E6 46-60, a żaden z klonów nie był dodatni dla peptydu E6 56-70. Testowanie z autologicznymi LCL zainfekowanymi rekombinowanym wirusem ospy krowiej ekspresującym białko HPV 16 E6 lub białko E7 wykazało, że klony limfocytów T rozpoznają endogennie przetworzony epitop E6 (Rys. 5). Testowanie z serią nakładających się peptydów 9-merowych obejmujących region HPV 16 46-65 (Tabela 1) wykazało najlepszą odpowiedź dla peptydu E6 53-61 (Rys. 6a). Przetestowano dwa peptydy 10-merowe zawierające peptyd E6 53-61, dwa peptydy 8-merowe zawarte w peptydzie E6 53-61 oraz jeden peptyd 11-merowy zawierający oba peptydy 10-merowe; peptyd E6 52-61 (10-mer) najczęściej okazywał się sekwencją minimalną i optymalną (Rys. 6b). Jednak peptyd E6 53-61 (9-mer) wywołał równie silną odpowiedź w przypadku klonu limfocytów T nr 79. Klon ten przetestowano z tymi dwoma peptydami w szerszym zakresie stężeń i peptyd E6 52-61 (10-mer) zachowywał dodatni wynik znacznie skuteczniej niż peptyd E6 53-61 (9-mer) przy niższych stężeniach peptydu (Rys. 6c). Dłuższy peptyd E6 52-62 (11-mer) nie był testowany, ponieważ celem było zdefiniowanie najkrótszej sekwencji wykazującej silną odpowiedź. Stwierdzono, że peptyd E6 52-61 (10-mer) zawiera sekwencję minimalną i optymalną.

Ograniczającą cząsteczkę HLA klasy I epitopu limfocytów T CD8 można zbadać za pomocą testu ELISPOT z wykorzystaniem allogenicznych LCL, które wykazują jedną lub dwie cząsteczki HLA klasy I wspólne z badanym. Jednak w przypadku Badanego 1 wyniki były niejednoznaczne ze względu na wysokie tło zaobserwowane w teście ELISPOT. Ograniczająca cząsteczka HLA klasy I dla Badanego 1 została następnie zidentyfikowana jako B58 przy użyciu testu uwalniania chromu (dane nie pokazano). Rys. 7 przedstawia przykład innego badanego [Badany A, u którego wykryto minimalną i optymalną sekwencję E6 75-83 (KFYSKISEY), zgodnie z opisem Wang et al.]7. Wysoka pozytywność jest widoczna przy LCL wykazującej cząsteczki B62 i Cw3, natomiast pozytywność tła jest widoczna przy LCL wykazującej Cw3. Test uwalniania chromu potwierdził, że cząsteczka B62 była elementem ograniczającym dla Badanego A7.

Niektóre regiony genomu HPV są dobrze konserwowane, a sekwencje homologiczne do regionów 52-61 E6 HPV 16 wystąpiły w 13 innych typach HPV wysokiego ryzyka (Tabela 2). Silne rozpoznawanie krzyżowe (>50% jednostek tworzących plamki dla peptydu 52-61 E6 HPV 16) wykazano w przypadku 8 z 13 typów HPV wysokiego ryzyka (Ryc. 8).

Schemat blokowy identyfikacji epitopów limfocytów T z wykorzystaniem testu ELISPOT; procesy obejmują izolację i analizę.
Rycina 1. Ogólny schemat przedstawiający serię eksperymentów służących do charakterystyki nowych epitopów limfocytów T. Niniejsza praca opisuje protokół rozpoczynający się od trzeciego pola od góry.

Wykres słupkowy odpowiedzi immunologicznej, jednostki tworzące plamki w zależności od regionów peptydowych, zaobserwowano dominujący pik E6.
Rysunek 2. Analiza ELISPOT przeprowadzona w celu zidentyfikowania regionu(ów) zawierających epitop limfocytów T. Do każdej studzienki wysiano sto tysięcy stymulowanych in vitro limfocytów T CD8 wraz z trzema nakładającymi się peptydami 15-merowymi (po 10 μM każdego), pokrywającymi każdy region białek E6 i E7 HPV 16. Ten przykład od badanego 1 wykazał obecność epitopu limfocytów T w regionie E6 46-70. Słupki reprezentują standardowe błędy średnich.

Schemat procesu rozcieńczania dla hodowli komórkowej, rozcieńczanie krok po kroku w celu uzyskania 0,5 komórki na dołek.
Rycina 3. Schemat przedstawiający sposób rozcieńczania limfocytów T specyficznych dla epitopu z użyciem mieszaniny komórek dokarmiających do stężenia 0,5 komórki na dołek.

Wykres słupkowy jednostek tworzących plamki na klon; porównanie peptydów PHA, E6 46-60, E6 51-65, E6 56-70.
Rycina 4. Analiza ELISPOT przeprowadzona w celu zidentyfikowania podregionów zawierających epitop dla limfocytów T poprzez indywidualne przetestowanie trzech peptydów 15-merowych. Ten przykład od badanego 1 wykazał obecność epitopu w podregionach E6 46-60 i E6 51-65. Słupki reprezentują błędy standardowe średnich.

Wykres słupkowy, jednostki tworzące plamki na dołek; klony #5-79; testy PHA, E6-Vac, E7-Vac, WR; odpowiedź immunologiczna.
Rysunek 5. Test ELISPOT przeprowadzony w celu zbadania, czy epitop limfocytów T jest prezentowany endogennie. Ten przykład z Osoby 1 wykazał, że klony limfocytów T rozpoznały endogennie przetworzony epitop E6. Słupki reprezentują błędy standardowe średnich.

Wykres jednostek tworzących plamki analizujący odpowiedź peptydową; zawiera wykresy słupkowe i liniowe z danymi dotyczącymi klonów.

Rysunek 6. Testy ELISPOT przeprowadzone w celu scharakteryzowania najkrótszej i optymalnej sekwencji peptydowej epitopu limfocytów T. W miarę możliwości przez cały czas stosowano te same klony. (a) Test ELISPOT przeprowadzony z użyciem nakładających się peptydów 9-merowych. Ten przykład u badanego 1 wykazał, że epitop znajduje się w podregionie E6 53-61. (b) Test ELISPOT przeprowadzony w celu zidentyfikowania minimalnej i optymalnej sekwencji peptydowej przy użyciu peptydów o różnej długości. Ten przykład wykazał, że najkrótszą i optymalną sekwencją peptydową była najczęściej sekwencja E6 52-61, a następnie E6 53-61. (c) Test ELISPOT przeprowadzony w celu potwierdzenia, który peptyd zawiera sekwencję minimalną i optymalną. Peptyd E6 52-61 zachował pozytywny wynik przy niższych stężeniach i uznano go za najkrótszą i optymalną sekwencję. Słupki reprezentują błąd standardowy średniej.

Wykres słupkowy przedstawiający liczbę jednostek tworzących plamki limfocytów na klon, z porównaniem autologicznych i dopasowanych allogenicznych LCL.


Rycina 7. Analiza ELISPOT przeprowadzona w celu zidentyfikowania ograniczającej cząsteczki HLA klasy I. Ten przykład potwierdził założenie, że cząsteczka B62 jest elementem ograniczającym dla klonu limfocytów T CD8 pacjenta A rozpoznającego epitop HPV 16 E6 75-837. Zostało to potwierdzone za pomocą testu uwalniania chromu. Słupki reprezentują błędy standardowe średnich.

Wykres słupkowy odpowiedzi immunologicznej na HPV; jednostki tworzące plamki na dołek; porównanie LCL autologicznych/allogenicznych.
Rycina 8. Analiza ELISPOT wykonana w celu oceny reaktywności krzyżowej klonów limfocytów T specyficznych dla HPV 16 52-61 wobec podobnych sekwencji z innych typów HPV wysokiego ryzyka (Tabela 2). Ten przykład od badanego 1 wykazał znaczną reaktywność krzyżową (>50% pozytywności w porównaniu do HPV 16 52-61) w 8 z 13 badanych innych typów HPV wysokiego ryzyka. Słupki reprezentują standardowe błędy średnich.

Typ HPVPozostałości AA*Sekwencja^
16E6 46-60 (15)RREVYDFAFRDLCIV
16E6 51-65 (15)DFAFRDLCIVYRDGN
16E6 56-70 (15)DLCIVYRDGNPYAVC
16E6 52-62 (11)FAFRDLCIVYR
16E6 52-61 (10)FAFRDLCIVY
16E6 53-62 (10)AFRDLCIVYR
16E6 46-54 (9)RREVYDFAF
16E6 47-55 (9)REVYDFAFR
16E6 48-56 (9)EVYDFAFRD
16E6 49-57 (9)VYDFAFRDL
16E6 50-58 (9)YDFAFRDLC
16E6 51-59 (9)DFAFRDLCI
16E6 52-60 (9)FAFRDLCIV
16E6 53-61 (9)AFRDLCIVY
16E6 54-62 (9)FRDLCIVYR
16E6 55-63 (9)RDLCIVYRD
16E6 56-64 (9)DLCIVYRDG
16E6 57-65 (9)LCIVYRDGN
16E6 53-60 (8)AFRDLCIV
16E6 54-61 (8)FRDLCIVY

* Liczba aminokwasów jest podana w nawiasie.

Tabela 1. Sekwencje aminokwasowe peptydów E6 HPV 16 użyte do określenia minimalnej i optymalnej antygenowej sekwencji peptydowej.

Typ HPVPozostałości A A*Sekwencja^
16E6 52-61(10)FAFRDLCIVY
18E6 47-56 (10)FAFKDLFVVY
31E6 45-54 (10)FAFTDLTIVY
33E6 45-54 (10)FAFADLTVVY
35E6 45-54 (10)FACYDLCIVY
39E6 47-56 (10)FAFSDLYVVY
45E6 47-56 (10)FAFSDLYVVY
51E6 45-54 (10)VAFTEIKIVY
52E6 45-54 (10)FLFTDLRIVY
56E6 48-57 (10)FACTELKLVY
58E6 45-54 (10)FVFADLRIVY
59E6 47-56 (10)FAFNDLFIVY
68E6 47-56 (10)FAFGDLNVVY
73E6 45-54 (10)FAFSDLCIVY

* Liczba aminokwasów jest podana w nawiasie.
^ Pozostałości aminokwasowe różniące się od tych w epitopie HPV-16 E6 52-61 są zaznaczone pogrubioną czcionką.

Tabela 2. Sekwencje aminokwasowe peptydów typów HPV wysokiego ryzyka, homologicznych do epitopów dla limfocytów T CD8 z fragmentu 52-61 białka E6 HPV 16, przetestowane w celu oceny wzajemnego rozpoznawania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tradycyjnie immunolodzy starali się charakteryzować nowe epitopy limfocytów T poprzez stymulację zainteresowanych limfocytów T in vitro oraz przeprowadzenie eksperymentu rozcieńczeń ograniczających w celu izolacji klonów limfocytów T specyficznych dla danego epitopu. Następnie klony limfocytów T charakteryzowano za pomocą testu uwalniania chromu 8,9. Jednak wiele prób zakończyło się niepowodzeniem, ponieważ częstość występowania limfocytów T mogła być zbyt niska, aby można było je wyizolować, lub poni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Niniejsze badanie było wspierane przez American Cancer Society Scholars Award (RSG-06-180-01-MBC) oraz granty NIH (R01 CA143130 i UL1RR029884).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw do izolacji limfocytów T CD8Miltenyi Biotec130-094-156
FitohemaglutyninaRemel, Thermo Fisher ScientificR-308528012mg/vial
Pożywka Yssel’sGemini Bio Products400-1021% pooled human serum
Płytka 96-dołkowa z okrągłym dnemBD Biosciences08-772-17
Rekombinowana ludzka IL-2R&D Systems202-IL-05050μg
Płytka 24-dołkowaCorning07-200-84
Fosforanowy bufor solny (PBS)CellgroMT-21-031-CV
Pierwotne przeciwciało monoklonalne anty-IFN-γ (D1K)Mabtech3420-3-1000
Biotynilowane przeciwciało monoklonalne anty-IFN-γ (7B-6)Mabtech3420-6-1000
Płytka Multiscreen HA ELISPOTEMD MilliporeMAHA S45 10
DimetylosulfotlenekSigma-AldrichD2650100 ml bottle
Surowica ludzka pulowanaAtlanta BiologicalsS40510HInaktywowana termicznie
RPMI 1640CellgroMT-10-040-CV
Tween-20Sigma-AldrichP2287-100ml
Zestaw Vectastain Elite ABCVector LaboratoriesNC9313719
Stabilna diaminobenzydynaOpen BiosystemsMBI 1241
Czytnik AID EliSpot Reader ClassicAutoimmun Diagnostika GmbHELR06

Bibliografia

  1. Nakagawa, M. A favorable clinical trend is associated with CD8 T-cell immune responses to the human papillomavirus type 16 e6 antigens in women being studied for abnormal pap smear results. J. Low. Genit. Tract Dis. 14, 124-129 (2010).
  2. Walls, E., Crawford, L. Lymphocytes: A practical approach. Klaus, G. G. B. , IRL Press. 149-149 (1987).
  3. Nakagawa, M., Kim, K. H., Moscicki, A. B. Patterns of CD8 T-cell epitopes within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 protein among young women whose HPV 16 infection has become undetectable. Clin. Diagn. Lab Immunol. 12, 1003-1005 (2005).
  4. Wang, X., Santin, A. D., Bellone, S., Gupta, S., Nakagawa, M. A novel CD4 T-cell epitope described from one of the cervical cancer patients vaccinated with HPV 16 or 18 E7-pulsed dendritic cells. Cancer Immunol. Immunother. 58, 301-308 (2009).
  5. Larsson, M. A recombinant vaccinia virus based ELISPOT assay detects high frequencies of Pol-specific CD8 T cells in HIV-1-positive individuals. AIDS. 13, 767-777 (1999).
  6. Nakagawa, M. Cytotoxic T lymphocyte responses to E6 and E7 proteins of human papillomavirus type 16: relationship to cervical intraepithelial neoplasia. J. Infect. Dis. 175, 927-931 (1997).
  7. Wang, X., Moscicki, A. B., Tsang, L., Brockman, A., Nakagawa, M. Memory T cells specific for novel human papillomavirus type 16 (HPV16) E6 epitopes in women whose HPV16 infection has become undetectable. Clin. Vaccine Immunol. 15, 937-945 (2008).
  8. Evans, M. Antigen processing defects in cervical carcinomas limit the presentation of a CTL epitope from human papillomavirus 16 E6. J. Immunol. 167, 5420-5428 (2001).
  9. Shi, Y., Smith, K. D., Kurilla, M. G., Lutz, C. T. Cytotoxic CD8+ T cells recognize EBV antigen but poorly kill autologous EBV-infected B lymphoblasts: immunodominance is elicited by a peptide epitope that is presented at low levels in vitro. J. Immunol. 159, 1844-1852 (1997).
  10. Varadarajan, N. A high-throughput single-cell analysis of human CD8+ T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis. The Journal of Clinical Investigation. , (2011).
  11. Nakagawa, M., Kim, K. H., Moscicki, A. B. Different methods of identifying new antigenic epitopes of human papillomavirus type 16 E6 and E7 proteins. Clin. Diagn. Lab Immunol. 11, 889-896 (2004).
  12. Nakagawa, M., Kim, K. H., Gillam, T. M., Moscicki, A. B. HLA class I binding promiscuity of the CD8 T-cell epitopes of human papillomavirus type 16 E6 protein. J. Virol. 81, 1412-1423 (2007).
  13. Brown, S. A. T cell epitope "hotspots" on the HIV Type 1 gp120 envelope protein overlap with tryptic fragments displayed by mass spectrometry. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 21, 165-170 (2005).
  14. Masemola, A. M. Novel and promiscuous CTL epitopes in conserved regions of Gag targeted by individuals with early subtype C HIV type 1 infection from southern Africa. J. Immunol. 173, 4607-4617 (2004).
  15. Walker, B. D., Korber, B. T. Immune control of HIV: the obstacles of HLA and viral diversity. Nat. Immunol. 2, 473-475 (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza ELISPOT dla interferonu gammacharakterystyka epitop w limfocyt w Tbia ka E6 i E7 HPV 16izolacja limfocyt w T specyficznych dla antygenudetekcja sekrecji IFN gammaprezentacja autologicznych LCLklonowanie limfocyt w T specyficznych dla epitopurestrykcja HLA klasy Ireaktywno krzy owa typ w HPVminimalna optymalna sekwencja peptydowa
Wykorzystanie testu Enzyme-linked Immunospot (ELISpot) dla interferonu $\gamma$ do charakterystyki nowych epitopów limfocytów T wirusa papilomawirusa ludzkiego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.