Charakterystyka epitopów limfocytów T patogenów wywołujących infekcje miejscowe, takich jak wirus brodawczaka ludzkiego, stanowi wyzwanie ze względu na ograniczoną liczbę krążących limfocytów T. Opisano metodę, w której rzadkie limfocyty T zostały wyizolowane i scharakteryzowane, zaczynając od bardzo małej liczby komórek.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykorzystanie testu Enzyme-linked Immunospot (ELISpot) dla interferonu $\gamma$ do charakterystyki nowych epitopów limfocytów T wirusa papilomawirusa ludzkiego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Opracowano protokół pozwalający przezwyciężyć trudności w izolowaniu i charakteryzowaniu rzadkich limfocytów T specyficznych dla patogenów wywołujących zakażenia miejscowe, takich jak wirus brodawczaka ludzkiego (HPV). Etapy procedury obejmują identyfikację regionu lub regionów białek HPV zawierających epitopy dla limfocytów T u badanego, selekcję limfocytów T specyficznych dla peptydów na podstawie sekrecji interferonu-γ (IFN-γ) oraz hodowlę i charakteryzację klonów limfocytów T (Rys. 1). Osoba 1 była pacjentką, u której niedawno w biopsji zdiagnozowano wysokostopniową dysplazję wewnątrznabłonkowa łуskawkową i która w dniu pobrania limfocytów T poddała się zabiegowi pętlowej ekscyzji elektrycznej w ramach leczenia1. Region w białkach E6 i E7 wirusa brodawczaka ludzkiego typu 16 (HPV 16) zawierający epitop dla limfocytów T zidentyfikowano za pomocą testu immunospot (ELISPOT) dla IFN-γ, przeprowadzonego z użyciem nakładających się peptydów syntetycznych (Rys. 2). Dane z tego testu posłużyły nie tylko do identyfikacji regionu zawierającego epitop dla limfocytów T, ale także do oszacowania liczby specyficznych dla epitopu limfocytów T i ich izolacji na podstawie sekrecji IFN-γ przy użyciu dostępnych komercyjnie kulek magnetycznych (zestaw do izolacji limfocytów T CD8, Miltenyi Biotec, Auburn CA). Wyselekcjonowane limfocyty T wydzielające IFN-γ rozcieńczono i hodowano pojedynczo w obecności mieszaniny napromieniowanych komórek zasilających (feeder cells), aby wspomóc wzrost pojedynczego limfocytu T na dołek. Klony limfocytów T przesiewano za pomocą testu IFN-γ ELISPOT w obecności peptydów pokrywających zidentyfikowany region oraz autologicznych limfoblastoidalnych komórek B (LCL) transformowanych wirusem Epsteina-Barr (LCL, uzyskanych zgodnie z opisem Walls i Crawforda)2, aby zminimalizować liczbę potrzebnych komórek klonalnych limfocytów T. Zamiast stosować 1 x 105 komórek na dołek, co jest typowe dla testów ELISPOT1,3, zastosowano 1 000 komórek klonalnych limfocytów T w obecności 1 x 105 autologicznych LCL, co drastycznie zmniejszyło liczbę wymaganych komórek klonalnych. Autologiczne LCL służyły nie tylko do prezentacji antygenów peptydowych komórkom klonalnym limfocytów T, ale także do utrzymania wysokiej gęstości komórek w dołkach, co umożliwiło specyficznym dla epitopu klonalnym limfocytom T sekrecję IFN-γ. Zapewnia to pomyślne przeprowadzenie testu IFN-γ ELISPOT. Podobnie testy IFN-γ ELISPOT wykorzystano do scharakteryzowania minimalnej i optymalnej sekwencji aminokwasowej epitopu limfocytów T CD8 (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) oraz jego elementu restrykcyjnego HLA klasy I (B58). Test IFN-γ ELISPOT przeprowadzono również z użyciem autologicznych LCL zainfekowanych wirusem ospy krowiej (vaccinia virus) ekspresującym białko E6 lub E7 HPV 16. Wynik wykazał, że epitop limfocytów T E6 był przetwarzany endogennie. Wykazano również krzyżowe rozpoznawanie homologicznego epitopu limfocytów T innych typów HPV wysokiego ryzyka. Metoda ta może być również stosowana do opisu epitopów limfocytów T CD44.
Protokół
Poprzez przeprowadzenie testu IFN-γ ELISPOT z wykorzystaniem linii komórek T CD8 wywodzącej się od Osoby 1, ustalono, że region 46-70 białka E6 HPV 16 zawiera epitop dla limfocytów T1 (Rys. 2), a limfocyty T specyficzne dla tego epitopu zostały wyselekcjonowane na podstawie sekrecji IFN-γ przed rozpoczęciem niniejszego protokołu (Rys. 1).
1. Rozcieńczanie ograniczające dla limfocytów T specyficznych dla epitopu
- Przygotować mieszaninę komórek karmicielskich, łącząc napromieniowane (4,000 rad) allogeniczne mononuklearne komórki krwi obwodowej (PBMCs) w stężeniu 5 x 105 komóre....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Tradycyjnie immunolodzy starali się charakteryzować nowe epitopy limfocytów T poprzez stymulację zainteresowanych limfocytów T in vitro oraz przeprowadzenie eksperymentu rozcieńczeń ograniczających w celu izolacji klonów limfocytów T specyficznych dla danego epitopu. Następnie klony limfocytów T charakteryzowano za pomocą testu uwalniania chromu 8,9. Jednak wiele prób zakończyło się niepowodzeniem, ponieważ częstość występowania limfocytów T mogła być zbyt niska, aby można było je wyizolować, lub poni.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Niniejsze badanie było wspierane przez American Cancer Society Scholars Award (RSG-06-180-01-MBC) oraz granty NIH (R01 CA143130 i UL1RR029884).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zestaw do izolacji limfocytów T CD8 | Miltenyi Biotec | 130-094-156 | |
| Fitohemaglutynina | Remel, Thermo Fisher Scientific | R-30852801 | 2mg/vial |
| Pożywka Yssel’s | Gemini Bio Products | 400-102 | 1% pooled human serum |
| Płytka 96-dołkowa z okrągłym dnem | BD Biosciences | 08-772-17 | |
| Rekombinowana ludzka IL-2 | R&D Systems | 202-IL-050 | 50μg |
| Płytka 24-dołkowa | Corning | 07-200-84 | |
| Fosforanowy bufor solny (PBS) | Cellgro | MT-21-031-CV | |
| Pierwotne przeciwciało monoklonalne anty-IFN-γ (D1K) | Mabtech | 3420-3-1000 | |
| Biotynilowane przeciwciało monoklonalne anty-IFN-γ (7B-6) | Mabtech | 3420-6-1000 | |
| Płytka Multiscreen HA ELISPOT | EMD Millipore | MAHA S45 10 | |
| Dimetylosulfotlenek | Sigma-Aldrich | D2650 | 100 ml bottle |
| Surowica ludzka pulowana | Atlanta Biologicals | S40510H | Inaktywowana termicznie |
| RPMI 1640 | Cellgro | MT-10-040-CV | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287-100ml | |
| Zestaw Vectastain Elite ABC | Vector Laboratories | NC9313719 | |
| Stabilna diaminobenzydyna | Open Biosystems | MBI 1241 | |
| Czytnik AID EliSpot Reader Classic | Autoimmun Diagnostika GmbH | ELR06 |
Bibliografia
- Nakagawa, M. A favorable clinical trend is associated with CD8 T-cell immune responses to the human papillomavirus type 16 e6 antigens in women being studied for abnormal pap smear results. J. Low. Genit. Tract Dis. 14, 124-129 (2010).
- Walls, E., Crawford, L.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Tagi
Analiza ELISPOT dla interferonu gammacharakterystyka epitop w limfocyt w Tbia ka E6 i E7 HPV 16izolacja limfocyt w T specyficznych dla antygenudetekcja sekrecji IFN gammaprezentacja autologicznych LCLklonowanie limfocyt w T specyficznych dla epitopurestrykcja HLA klasy Ireaktywno krzy owa typ w HPVminimalna optymalna sekwencja peptydowa
