Stereotypowe projekcje aferentów sensorycznych do rdzenia kręgowego gryzoni stanowią łatwo dostępny system eksperymentalny do badania rozgałęzień aksonalnych poprzez śledzenie pojedynczych aksonów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Znakowanie neuronów ziewnięcia grzbietowego (DRG) barwnikiem DiI w celu badania rozgałęzień aksonalnych w preparacie całego rdzenia kręgowego zarodka myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Prezentujemy technikę znakowania trajektorii niewielkich grup neuronów zzęgł zwojów korzeni grzbietowych (DRG) w embrionalnym rdzeniu kręgowym poprzez barwienie dyfuzyjne z użyciem lipofilnego znacznika 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)1. Porównanie przebiegów aksonalnych typu dzikiego z przebiegami u linii myszy z mutacjami genowymi pozwala na badanie funkcjonalnej roli białek kandydujących w kontroli rozgałęziania aksonów, co stanowi kluczowy mechanizm w tworzeniu połączeń układu nerwowego. Rozgałęzianie aksonalne umożliwia pojedynczemu neuronowi połączenie się z wieloma celami, zapewniając tym samym fizyczną podstawę do równoległego przetwarzania informacji. Ramifikacje w pośrednich obszarach docelowych wzrostu aksonów można odróżnić od arboryzacji terminalnej. Ponadto różne tryby formowania się odgałęzień aksonalnych można klasyfikować w zależności od tego, czy rozgałęzianie wynika z aktywności stożka wzrostu (podział lub rozgałęzianie opóźnione), czy z pączkowania kolaterali z trzonu aksonu w procesie zwanym rozgałęzianiem interstycjalnym2 (Rys. 1).
Centralne projekcje neuronów z zwojów rdzeniowych (DRG) stanowią przydatny układ eksperymentalny do badania obu typów rozgałęzień aksonalnych: gdy ich aksony doprowadzające docierają do strefy wejścia korzeni grzbietowych (DREZ) rdzenia kręgowego między 10. a 13. dniem embrionalnym (E10 - E13), wykazują one stereotypowy wzorzec bifurkacji w kształcie litery T lub Y. Dwa powstałe aksony potomne biegną następnie odpowiednio w kierunku rostralnym lub kaudalnym wzdłuż grzbietowo-bocznego brzegu rdzenia, a dopiero po pewnym czasie z tych aksonów pniowych wyrastają kolaterale, które penetrują istotę szarą (rozgałęzienie interstycjalne) i projektują się do neuronów przekaźnikowych w konkretnych blaszkach rdzenia kręgowego, gdzie ulegają dalszemu arboryzowaniu (rozgałęzienie terminalne)3. Śledzenie za pomocą barwnika DiI ujawniło stożki wzrostu w strefie wejścia korzeni grzbietowych rdzenia kręgowego, które zdawały się być w procesie podziału, co sugeruje, że bifurkacja jest spowodowana rozszczepieniem samego stożka wzrostu4 (Rys. 2), jednak rozważano również inne możliwości5.
W niniejszym materiale wideo zaprezentowano najpierw sposób wypreparowania rdzenia kręgowego myszy w stadium E12.5 z pozostawieniem przytwierdzonych zwojów rdzeniowych (DRG). Po utrwaleniu preparatu, za pomocą szklanych igieł wyciągniętych z kapilar, do DRG nanosi się niewielkie ilości barwnika DiI. Po etapie inkubacji, znakowany rdzeń kręgowy zostaje zamocowany jako preparat w układzie otwartej książki (inverted open-book preparation) w celu analizy poszczególnych aksonów przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.
Protokół
1. Procedura sekcji
Uwaga: Wykorzystanie myszy w eksperymentach powinno być zgodne z oficjalnie zatwierdzonymi wytycznymi dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych.
- Przed przystąpieniem do preparacji przygotować mikroskop stereoskopowy oraz rozłożyć narzędzia chirurgiczne niezbędne do sekcji, w tym duże i małe nożyczki, duże pęsety ząbkowane, pęsetę zakrzywioną oraz cztery zestawy pęset sekcyjnych Dumont No.5 (z czego dwie z polerowanymi wewnętrznie końcówkami) (szczegóły znajdują się w tabeli odczynników i sprzętu). Umieścić arkusz papieru filtracyjnego w 100-mm szalce Petri powlekanej Sylgardem. Nalać zimny PBS do dołków płytki 12-dołkowej, 100-mm szalki Petri oraz probówki 12-ml i pozostawić na lodzie. Pipetować 2ml buforu fiksacyjnego (4% paraformaldehyd w PBS, pH 7.4) do każdego dołka drugiej płytki 12-dołkowej i umieścić na lodzie.
- Po znieczuleniu uśmiercić ciężarną samicę w dniu E12.5 (wykrycie czopa pochwowego uznano za E0.5), położyć mysz stroną brzuszną do góry na trzech arkuszach ręcznika papierowego i nasączyć okolicę brzucha 70% etanolem.
- Otworzyć jamę brzuszną i miedniczną, wyizolować obustronne rogi macicy i przenieść je do jednej z 100-mm szalek z lodowatym PBS.
- Pod kontrolą mikroskopową wykonać nacięcie podłużne ściany macicy za pomocą małych, prostych nożyczek i odciąć każdy worek owodniowy od łożyska.
- Oddzielić worek owodniowy od każdego embrionu i odciąć pępowinę.
- Za pomocą małych nożyczek odciąć głowy embrionów i odłożyć je lub ich część w celu izolacji DNA genomowego, jeśli wymagane będzie genotypowanie. Następnie przenieść tułowia do odpowiednich dołków płytki 12-dołkowej z zimnym PBS.
- Zmoczyć papier filtracyjny w szalce z Sylgardem kilkoma kroplami PBS i ułożyć tułów embrionu stroną grzbietową do góry na papierze. Dla lepszej stabilności wyprostować ogon i kończyny z dala od ciała.
- Pracując pod mikroskopem stereoskopowym przy powiększeniu około 16x, ostrożnie chwycić skórę embrionu nad rdzeniem kręgowym dwiema parami pęset z cienkimi końcówkami i delikatnie ją rozerwać. Zaczynając od środka, kierować się najpierw w stronę ogona, a następnie powrócić do środka i kierować się w stronę przednią.
- Od czasu do czasu zwilżać embrion dwiema lub trzema kroplami PBS, aby zapobiec jego wysychaniu.
- Aby zapobiec oderwaniu zwojów rdzeniowych (DRG) od rdzenia kręgowego podczas jego usuwania z embrionu, oddzielić DRG i rdzeń kręgowy od otaczającej chrzęstnej kolumny kręgowej za pomocą poziomych ruchów ślizgowych ostrzem pęsety z polerowanymi wewnętrznie końcówkami. Zaczynając od środka prawej strony embrionu, kierować się w stronę ogona, a następnie ku końcowi przedniemu. Następnie powtórzyć procedurę po drugiej stronie. Należy uważać, aby nie wyrwać powiązanych DRG.
- Aby całkowicie oddzielić poluzowany rdzeń kręgowy od embrionu, chwycić jego część szyjną cienką pęsetą i wyciągnąć go w jednym kawałku w kierunku końca ogonowego.
- Zanurzyć wyizolowany rdzeń kręgowy z przytwierdzonymi DRG w dołku płytki 12-dołkowej wypełnionym buforem fiksacyjnym i przystąpić do preparacji rdzeni kręgowych z pozostałych embrionów.
- Fiksować rdzenie kręgowe przez co najmniej dwie godziny na lodzie.
2. Znakowanie neuronów zwojów korzeni grzbietowych (DRG) barwnikiem DiI
- Dla każdego rdzenia kręgowego przeznaczonego do znakowania należy przygotować dwie szklane igły za pomocą wyciągacza mikropipet. Stosujemy wyciągacz elektrod Sutter model P-97 (ustawienia programu: 1. HEAT=625, VEL= 35, TIME=175; 2. HEAT=600, VEL= 25, TIME=175; 3. HEAT=630, VEL= 30, TIME=150).
- Pod kontrolą mikroskopową należy zanurzyć końcówkę każdej szklanej igły od trzech do pięciu razy w 5% (w/v) roztworze DiI w etanolu. Odparowanie etanolu powoduje powstanie cienkiej warstwy kryształów DiI na igle.
- Pracując pod mikroskopem stereoskopowym przy powiększeniu około 40x, należy umieścić rdzeń kręgowy stroną brzuszną do góry na szkiełku. Za pomocą nożyczek sprężynowych należy otworzyć rdzeń od strony brzusznej na całej jego długości, przecinając płytkę dna, aby umożliwić późniejszy montaż preparatu w odwróconym trybie otwartej książki (patrz sekcja C).
- Należy ułożyć rdzeń kręgowy stroną grzbietową do góry na szkiełku. Następnie, korzystając z wizualizacji mikroskopowej, należy ręcznie zbliżyć pokrytą DiI końcówkę szklanej igły do rdzenia i ostrożnie przebić co drugi zwoj DRG po jednej stronie rdzenia kręgowego. W przebitym DRG nie powinny być widoczne prawie żadne ślady DiI, aby zapewnić znakowanie tylko niewielkiej liczby neuronów. Do drugiej strony rdzenia należy użyć drugiej igły. Celowanie w co drugi DRG pozwala uniknąć nakładania się znakowanych projekcji aksonalnych z sąsiednich DRG, co mogłoby utrudnić rozróżnienie poszczególnych aksonów.
- Rdzeń kręgowy należy przenieść z powrotem do buforu fiksacyjnego i inkubować w ciemności przez co najmniej sześć godzin w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4 °C, aby barwnik mógł zdyfundować wzdłuż aksonu w obrębie błony plazmatycznej. W przypadku chęci analizy wzrostu kolateralnego do rdzenia kręgowego należy przewidzieć dłuższy okres inkubacji (do dwóch dni w 4 °C).
3. Montowanie i analiza mikroskopowa
- Po dyfuzji barwnika umieść pojedynczy rdzeń kręgowy stroną grzbietową do dołu na szkiełku nakrywnym w kropli PBS. Należy zadbać o to, aby przymocowane zwoje rdzeniowe tylne (DRG) były prawidłowo zorientowane bocznie i nie nakładały się na siebie. Odessaj nadmiar płynu i rozpłaszcz rdzeń w trybie „otwartej księgi” (odwrócone rozłożenie), używając pęsety.
- Zamocuj preparat na szkiełku przedmiotowym, używając PBS.
- Aby zapobiec wzrostowi niepożądanego tła fluorescencyjnego, analiza mikroskopowa znakowanych projekcji aksonalnych powinna zostać przeprowadzona w dniu montażu. Do tego czasu przechowuj szkiełka w ciemności w temperaturze 4 °C.
4. Reprezentatywne wyniki:
Rdzeń kręgowy myszy otrzymuje projekcje aferentne z 8 par szyjnych, 13 par piersiowych, 5 par lędźwiowych i 4 par krzyżowych zwojów rdzeniowych tylnych (DRG), co daje łącznie 60 zwojów rdzeniowych. Po pewnym treningu rdzeń kręgowy z większością wciąż przytwierdzonych zwojów DRG można wyizolować z embrionu w czasie krótszym niż pięć minut. Procedura ta jest odpowiednia do izolacji rdzeni kręgowych z przytwierdzonymi zwojami DRG z embrionów myszy od etapu E11.5 do E13.5. Jednak najlepsze wyniki uzyskuje się z etapu E12.5. Przykładowe efekty opisanej tutaj procedury znakowania przedstawiono na rysunku 3. Znakowanie zwojów DRG na całej długości rdzenia kręgowego może następnie posłużyć do ilościowej oceny zachowania rozgałęzień aksonalnych na różnych poziomach kręgów (Rys. 4).
Rycina 1. Schemat przedstawiający dwa główne tryby rozgałęziania aksonów. (A) Rozgałęzianie wynikające z aktywności stożka wzrostu, które może prowadzić do bifurkacji – jak wskazano tutaj – a także do powstania złożonych drzewek końcowych lub (B) tworzenie odgałęzień bocznych w trzonie aksonu (rozgałęzianie śródmiąższowe). Ten drugi tryb jest dominującym typem rozgałęziania dla projekcyjnych aksonów korowych i wzgórzowo-korowych6,7.
Rysunek 2. Projekcje aferentne neuronów DRG do embrionalnego rdzenia kręgowego wykazują oba typy rozgałęziania aksonalnego: aksony rozgałęziają się najpierw w strefie DREZ poprzez bifurkację (1), a z powstałych gałęzi potomnych tworzą się kolaterale po okresie oczekiwania poprzez rozgałęzianie śródmiąższowe (2).
Rysunek 3. Wizualizacja pojedynczych trajektorii aksonalnych neuronów DRG zarodka myszy. (A) Rdzeń kręgowy z przynależnymi DRG przygotowany z zarodka myszy w stadium E12.5. (Pasek skali, 1 mm.) (B-D) Przedstawiono widoki grzbietowe znakowanych DiI DRG myszy typu dzikiego przy coraz większym powiększeniu. W B każdy drugi DRG jest znakowany DiI. Obrazy fluorescencyjne są odwrócone, kierunek kaudalny znajduje się po lewej stronie, a w C i D kierunek boczny znajduje się na dole. W C znakowana jest niewielka liczba aksonów, a przy większym powiększeniu w strefie wejścia korzeni grzbietowych (DREZ) rdzenia kręgowego można zidentyfikować obecność rozgałęzień w kształcie litery T. (Paski skali, 250 μm (B), 100 μm (C) i 50 μm (D).)
Rycina 4. Ilościowe określenie odgałęzień w kształcie litery T, pojedynczych zakrętów rostralnych lub kaudalnych u myszy typu dzikiego oraz myszy z niedoborem peptydu natriuretycznego typu C (CNP) w stadium E13.5. Liczba przeliczonych pojedynczych aksonów dla różnych poziomów tułowia dla każdego genotypu podano w nawiasach. Zakręty typu C lub R – wzrost odpowiednio wyłącznie w kierunku kaudalnym lub rostralnym.
Rycina 5. Szlak sygnalizacyjny cGMP wyzwala bifurkację aksonów sensorycznych w obrębie DREZ rdzenia kręgowego. (A) Schemat szlaku sygnalizacyjnego cGMP składającego się z liganda CNP, receptora cyklazy guanylowej Npr2 oraz kinazy serynowo-treoninowej cGKIα w embrionalnych neuronach zwojów korzeni grzbietowych (DRG). Npr2 generuje cGMP z GTP po stymulacji przez CNP. (B) Śledzenie pojedynczych aksonów neuronów DRG za pomocą DiI u myszy typu dzikiego i myszy z niedoborem CNP. (Pasek skali, 25 μm.)
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Stereotypowe wzorce projekcji obejmujące oba rodzaje tworzenia odgałęzień aksonalnych, w połączeniu z łatwością przygotowania oraz możliwością wykorzystania utrwalonej tkanki do znakowania DiI, sprawiają, że embrionalny rdzeń kręgowy z przylegającymi zwojami rdzeniowymi grzbietowymi (DRG) jest korzystnym modelem do badania rozgałęzień aksonalnych. Aplikacja śladowych ilości DiI przy użyciu powlekanych szklanych igieł pozwala – w przeciwieństwie do znakowania masowego DRG – na wizualizację małych grup neuronów DRG, a tym ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować dr. Alistairowi Garrattowi (Max Delbrück Center, Berlin) za pomocne uwagi. Praca ta była wspierana przez centrum badań kooperacyjnych (SFB665) Niemieckiej Fundacji Badawczej (DFG).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Stereomikroskop Stemi DRC | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Roztwór buforowy fosforanowy (PBS) | Biochrom AG | L182-50 | |
| Paraformaldehyd | Merck & Co., Inc. | 8.18715.1000 | |
| Standardowe nożyczki chirurgiczne | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Standardowa pęseta ząbkowana | Fine Science Tools | 11021-14 | |
| Bardzo precyzyjne nożyczki tęczówkowe | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Pęseta zakrzywiona | Fine Science Tools | 11003-13 | |
| Pęseta Dumont nr 5 z cienkimi końcówkami | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Pęseta Dumont nr 5 z lustrzanym wykończeniem | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| Sprężynowe nożyczki Vannas-Tübingen | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| Papier filtracyjny | Fisher Scientific | FB59041 | |
| Sylgard 184 | World Precision Instruments, Inc. | SYLG184 | |
| Szkiełka Petriego 100 mm | Greiner Bio-One | 663102 | |
| Probówka polipropylenowa 12 ml | Carl Roth GmbH | ECO3.1 | |
| Płytka hodowlana 12-dołkowa | BD Biosciences | 35-3043 | |
| Ethanol | Merck & Co., Inc. | 1.00983.2500 | |
| Wytwornica mikropipet Flaming/Brown P-97 | Sutter Instrument Co. | ||
| Kapilary ze szkła borokrzemianowego | Harvard Apparatus | 30-0066 | |
| DiI (1,1′-dioctadecylo-3,3,3′,3′-tetrametylo-indokarbocyjaniny nadchloran) | Sigma-Aldrich | 468495 | |
| Przedmioty szkiełka SuperFrost Plus | Carl Roth GmbH | H867.1 | |
| Szklane lamelle | Carl Roth GmbH | 1870.2 |
Bibliografia
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends. Neurosci. 12 (9), 333-333 (1989).
- Acebes, A., Ferrus, A. Cellular and molecular features of axon collaterals and dendrites. Trends. Neurosci. 23 (11), 557-557 (2000).
- Ozaki, S., Snider, W. D. Initial trajectories of sensory axons toward laminar targets in the developing mouse spinal cord. J. Comp. Neurol. 380 (2), 215-215 (1997).
- Schmidt, H. The receptor guanylyl cyclase Npr2 is essential for sensory axon bifurcation within the spinal cord. J. Cell Biol. 179 (2), 331-331 (2007).
- Gibson, D. A., Ma, L. Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system. Development. 138 (2), 183-183 (2011).
- O'Leary, D. D., Terashima, T. Cortical axons branch to multiple subcortical targets by interstitial axon budding: implications for target recognition and "waiting periods". Neuron. 1 (10), 901-901 (1988).
- Portera-Cailliau, C. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS. Biol. 3 (8), e272-e272 (2005).
- Gan, W. B. Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye. J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-13 (1999).
- Schmidt, H. C-type natriuretic peptide (CNP) is a bifurcation factor for sensory neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (39), 16847-16847 (2009).
- Zhao, Z. Regulate axon branching by the cyclic GMP pathway via inhibition of glycogen synthase kinase 3 in dorsal root ganglion sensory neurons. Journal of Neuroscience. 29 (5), 1350-1350 (2009).
- Zhao, Z., Ma, L. Regulation of axonal development by natriuretic peptide hormones. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (42), 18016-18016 (2009).
- Schmidt, H., Rathjen, F. G. Signalling mechanisms regulating axonal branching in vivo. Bioessays. , (2010).
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).
- Livet, J. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-56 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
