Stereotypowe projekcje aferentów sensorycznych do rdzenia kręgowego gryzoni stanowią łatwo dostępny system eksperymentalny do badania rozgałęzień aksonalnych poprzez śledzenie pojedynczych aksonów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Znakowanie neuronów ziewnięcia grzbietowego (DRG) barwnikiem DiI w celu badania rozgałęzień aksonalnych w preparacie całego rdzenia kręgowego zarodka myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Prezentujemy technikę znakowania trajektorii niewielkich grup neuronów zzęgł zwojów korzeni grzbietowych (DRG) w embrionalnym rdzeniu kręgowym poprzez barwienie dyfuzyjne z użyciem lipofilnego znacznika 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)1. Porównanie przebiegów aksonalnych typu dzikiego z przebiegami u linii myszy z mutacjami genowymi pozwala na badanie funkcjonalnej roli białek kandydujących w kontroli rozgałęziania aksonów, co stanowi kluczowy mechanizm w tworzeniu połączeń układu nerwowego. Rozgałęzianie aksonalne umożliwia pojedynczemu neuronowi połączenie się z wieloma celami, zapewniając tym samym fizyczną podstawę do równoległego przetwarzania informacji. Ramifikacje w pośrednich obszarach docelowych wzrostu aksonów można odróżnić od arboryzacji terminalnej. Ponadto różne tryby formowania się odgałęzień aksonalnych można klasyfikować w zależności od tego, czy rozgałęzianie wynika z aktywności stożka wzrostu (podział lub rozgałęzianie opóźnione), czy z pączkowania kolaterali z trzonu aksonu w procesie zwanym rozgałęzianiem interstycjalnym2 (Rys. 1).
Centralne projekcje neuronów z zwojów rdzeniowych (DRG) stanowią przydatny układ eksperymentalny do badania obu typów rozgałęzień aksonalnych: gdy ich aksony doprowadzające docierają do strefy wejścia korzeni grzbietowych (DREZ) rdzenia kręgowego między 10. a 13. dniem embrionalnym (E10 - E13), wykazują one stereotypowy wzorzec bifurkacji w kształcie litery T lub Y. Dwa powstałe aksony potomne biegną następnie odpowiednio w kierunku rostralnym lub kaudalnym wzdłuż grzbietowo-bocznego brzegu rdzenia, a dopiero po pewnym czasie z tych aksonów pniowych wyrastają kolaterale, które penetrują istotę szarą (rozgałęzienie interstycjalne) i projektują się do neuronów przekaźnikowych w konkretnych blaszkach rdzenia kręgowego, gdzie ulegają dalszemu arboryzowaniu (rozgałęzienie terminalne)3. Śledzenie za pomocą barwnika DiI ujawniło stożki wzrostu w strefie wejścia korzeni grzbietowych rdzenia kręgowego, które zdawały się być w procesie podziału, co sugeruje, że bifurkacja jest spowodowana rozszczepieniem samego stożka wzrostu4 (Rys. 2), jednak rozważano również inne możliwości5.
W niniejszym materiale wideo zaprezentowano najpierw sposób wypreparowania rdzenia kręgowego myszy w stadium E12.5 z pozostawieniem przytwierdzonych zwojów rdzeniowych (DRG). Po utrwaleniu preparatu, za pomocą szklanych igieł wyciągniętych z kapilar, do DRG nanosi się niewielkie ilości barwnika DiI. Po etapie inkubacji, znakowany rdzeń kręgowy zostaje zamocowany jako preparat w układzie otwartej książki (inverted open-book preparation) w celu analizy poszczególnych aksonów przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.
Protokół
1. Procedura sekcji
Uwaga: Wykorzystanie myszy w eksperymentach powinno być zgodne z oficjalnie zatwierdzonymi wytycznymi dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych.
- Przed przystąpieniem do preparacji przygotować mikroskop stereoskopowy oraz rozłożyć narzędzia chirurgiczne niezbędne do sekcji, w tym duże i małe nożyczki, duże pęsety ząbkowane, pęsetę zakrzywioną oraz cztery zestawy pęset sekcyjnych Dumont No.5 (z czego dwie z polerowanymi wewnętrznie końcówkami) (szczegóły znajdują się w tabeli odczynników i sprzętu). Umieścić arkusz papieru filtracyjnego w 100-mm szalce Petri powlekanej Sylgardem. N....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Stereotypowe wzorce projekcji obejmujące oba rodzaje tworzenia odgałęzień aksonalnych, w połączeniu z łatwością przygotowania oraz możliwością wykorzystania utrwalonej tkanki do znakowania DiI, sprawiają, że embrionalny rdzeń kręgowy z przylegającymi zwojami rdzeniowymi grzbietowymi (DRG) jest korzystnym modelem do badania rozgałęzień aksonalnych. Aplikacja śladowych ilości DiI przy użyciu powlekanych szklanych igieł pozwala – w przeciwieństwie do znakowania masowego DRG – na wizualizację małych grup neuronów DRG, a tym .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować dr. Alistairowi Garrattowi (Max Delbrück Center, Berlin) za pomocne uwagi. Praca ta była wspierana przez centrum badań kooperacyjnych (SFB665) Niemieckiej Fundacji Badawczej (DFG).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Stereomikroskop Stemi DRC | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Roztwór buforowy fosforanowy (PBS) | Biochrom AG | L182-50 | |
| Paraformaldehyd | Merck & Co., Inc. | 8.18715.1000 | |
| Standardowe nożyczki chirurgiczne | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Standardowa pęseta ząbkowana | Fine Science Tools | 11021-14 | |
| Bardzo precyzyjne nożyczki tęczówkowe | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Pęseta zakrzywiona | Fine Science Tools | 11003-13 | |
| Pęseta Dumont nr 5 z cienkimi końcówkami | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Pęseta Dumont nr 5 z lustrzanym wykończeniem | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| Sprężynowe nożyczki Vannas-Tübingen | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| Papier filtracyjny | Fisher Scientific | FB59041 | |
| Sylgard 184 | World Precision Instruments, Inc. | SYLG184 | |
| Szkiełka Petriego 100 mm | Greiner Bio-One | 663102 | |
| Probówka polipropylenowa 12 ml | Carl Roth GmbH | ECO3.1 | |
| Płytka hodowlana 12-dołkowa | BD Biosciences | 35-3043 | |
| Ethanol | Merck & Co., Inc. | 1.00983.2500 | |
| Wytwornica mikropipet Flaming/Brown P-97 | Sutter Instrument Co. | ||
| Kapilary ze szkła borokrzemianowego | Harvard Apparatus | 30-0066 | |
| DiI (1,1′-dioctadecylo-3,3,3′,3′-tetrametylo-indokarbocyjaniny nadchloran) | Sigma-Aldrich | 468495 | |
| Przedmioty szkiełka SuperFrost Plus | Carl Roth GmbH | H867.1 | |
| Szklane lamelle | Carl Roth GmbH | 1870.2 |
Bibliografia
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends. Neurosci. 12 (9), 333-333 (1989).
- Acebes, A., Ferrus, A. Cellular and molecular features of axon collaterals and dendrites. Trends. Ne....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
