Opisano metodę in vitro pozwalającą na naśladowanie różnicowania nabłonkowego in vivo. Wiele wirusów w ramach swojego cyklu życiowego atakuje komórki nabłonkowe, a niniejsza metoda umożliwia badanie interakcji wirus-gospodarz w warunkach ściślej przypominających te występujące in vivo. Technikę tę można zastosować w przypadku pierwotnych keratynocytów, ustalonych linii komórkowych, a także w badaniach prawidłowej lub zmienionej chorobowo tkanki pobranej z biopsji.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Tworzenie organotypowych kultur raftowych z pierwotnych ludzkich keratynocytów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Opracowanie organotypowych hodowli raftowych nabłonka dostarczyło badaczom wydajnego systemu in vitro, który wiernie odtwarza różnicowanie nabłonka. System ten znajduje wiele zastosowań. Na przykład możliwość hodowli trójwymiarowych organotypowych raftów keratynocytów stanowiła ważny kamień milowy w badaniach nad wirusem brodawczaka ludzkiego (HPV)1. Cykl życiowy HPV jest ściśle powiązany z różnicowaniem nabłonka wielowarstwowego pasmowego2. Organotypowe hodowle raftowe nabłonka, zaprezentowane w niniejszym materiale, odtwarzają cały cykl życiowy papillomawirusa, w tym produkcję wirusa3,4,5. Ponadto hodowle raftowe te wykazują zmiany dysplastyczne podobne do tych obserwowanych podczas infekcji HPV in vivo. Zatem system ten może być również wykorzystywany do badania nowotworów komórek nabłonkowych, a także wpływu leków na różnicowanie komórek nabłonkowych w ujęciu ogólnym. System organotypowych hodowli raftowych nabłonka, opracowany pierwotnie przez Asselineau i Prunierasa6 i zmodyfikowany przez Kopana et al.7, stał się ogólnym, stosunkowo łatwym w obsłudze modelem hodowlanym, który polega na namnażaniu komórek na wtykach kolagenowych utrzymywanych na granicy faz powietrze-ciecz (Rysunek 1A). W ciągu 10–14 dni komórki ulegają stratyfikacji i różnicowaniu, tworząc pełnowarstwowy nabłonek produkujący cytokeratyny specyficzne dla różnicowania. Zebrane rafty można badać histologicznie, a także przy użyciu standardowych technik molekularnych i biochemicznych. W niniejszym artykule opisujemy metodę generowania hodowli raftowych z pierwotnych ludzkich keratynocytów. Tą samą technikę można zastosować w przypadku ustalonych linii komórkowych nabłonka, a także łatwo zaadaptować do wykorzystania tkanek nabłonkowych z prawidłowych lub zmienionych chorobowo biopsji8. Wiele wirusów w ramach swojego replikacyjnego cyklu życiowego atakuje nabłonek skóry lub błon śluzowych. W ciągu ostatnich kilku lat wykazano możliwość wykorzystania organotypowych hodowli raftowych jako metody badania interakcji wirus-komórka gospodarza w przypadku kilku herpeswirusów, a także adenowirusów, parwowirusów i poxwirusów9. Organotypowe hodowle raftowe mogą zatem zostać zaadaptowane do badania patogenezy wirusowej i stanowią jedyny sposób testowania nowych środków przeciwwirusowych w przypadku wirusów, których nie można hodować w stałych liniach komórkowych.
Protokół
1. Przygotowanie do organotypowych kultur raftowych
- Metalowe siatki do raftów muszą zostać najpierw poddane działaniu kwasu chromowo-siarkowego w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń, które mogłyby zakłócić proces różnicowania. Zanurz metalowe siatki w zlewce z kwasem siarkowym na jedną godzinę, a następnie płucz je w sposób ciągły przez noc wodą z kranu. Po płukaniu nocnym siatki należy płukać przez 3-5 godzin w podwójnie destylowanej wodzie.
- Aby zapewnić wsparcie dla raftów, zgnij trzy boki raftu o około 0,5 cm w równych odstępach od siebie. Następnie metalowe siatki należy poddać autoklawowaniu.
- Przygotuj 10X bufor do rekonstytucj....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisujemy tutaj metodę, która może być wykorzystana do ogólnego badania różnicowania nabłonkowego, ale może zostać również łatwo zaadaptowana do badania patogenezy wirusowej, jak i skuteczności potencjalnych środków terapeutycznych. Wiele wirusów atakuje komórki nabłonkowe albo jako pierwotne miejsce infekcji, jak w przypadku HPV, albo w pewnym momencie cyklu życiowego wirusa, jak w przypadku wirusów herpes. Chociaż hodowla organotypowych kultur raft (kultur na rusztowaniach), jest czasochłonna, zdolność do wiernego odtw.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Sally Roberts (University of Birmingham, Birmingham UK) za uprzejme przekazanie przeciwciała E1ˆE4. Praca ta została sfinansowana z grantu National Cancer Institute (4R00CA137160-03).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kolagen typu 1 z ogona szczura (4-5mg/ml) | BD Biosciences | 354236 | |
| DMEM bez NaHC03 | Invitrogen | 12100-061 | |
| NaHC03 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Hepes | Calbiochem | 391338 | |
| Stalowe siatki metalowe | Williams and Mettle Co. | CR-03063-040-100-S | |
| Pożywka E11 | |||
| Epidermalny czynnik wzrostu | BD Biosciences | 354010 |
Bibliografia
- Andrei, G., Duraffour, S., VandenOord, J., Snoeck, R. Epithelial raft cultures for investigations of virus growth, pathogenesis and efficacy of antiviral agents. Antiviral Research. 85, 431-449 (2010).
- Asselineau, D., Prunieras, M.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
