Tworzenie organotypowych kultur raftowych z pierwotnych ludzkich keratynocytów

Podsumowanie

Opisano metodę in vitro pozwalającą na naśladowanie różnicowania nabłonkowego in vivo. Wiele wirusów w ramach swojego cyklu życiowego atakuje komórki nabłonkowe, a niniejsza metoda umożliwia badanie interakcji wirus-gospodarz w warunkach ściślej przypominających te występujące in vivo. Technikę tę można zastosować w przypadku pierwotnych keratynocytów, ustalonych linii komórkowych, a także w badaniach prawidłowej lub zmienionej chorobowo tkanki pobranej z biopsji.

Streszczenie

Opracowanie organotypowych hodowli raftowych nabłonka dostarczyło badaczom wydajnego systemu in vitro, który wiernie odtwarza różnicowanie nabłonka. System ten znajduje wiele zastosowań. Na przykład możliwość hodowli trójwymiarowych organotypowych raftów keratynocytów stanowiła ważny kamień milowy w badaniach nad wirusem brodawczaka ludzkiego (HPV)¹. Cykl życiowy HPV jest ściśle powiązany z różnicowaniem nabłonka wielowarstwowego pasmowego². Organotypowe hodowle raftowe nabłonka, zaprezentowane w niniejszym materiale, odtwarzają cały cykl życiowy papillomawirusa, w tym produkcję wirusa^3,4,5. Ponadto hodowle raftowe te wykazują zmiany dysplastyczne podobne do tych obserwowanych podczas infekcji HPV in vivo. Zatem system ten może być również wykorzystywany do badania nowotworów komórek nabłonkowych, a także wpływu leków na różnicowanie komórek nabłonkowych w ujęciu ogólnym. System organotypowych hodowli raftowych nabłonka, opracowany pierwotnie przez Asselineau i Prunierasa⁶ i zmodyfikowany przez Kopana et al.⁷, stał się ogólnym, stosunkowo łatwym w obsłudze modelem hodowlanym, który polega na namnażaniu komórek na wtykach kolagenowych utrzymywanych na granicy faz powietrze-ciecz (Rysunek 1A). W ciągu 10–14 dni komórki ulegają stratyfikacji i różnicowaniu, tworząc pełnowarstwowy nabłonek produkujący cytokeratyny specyficzne dla różnicowania. Zebrane rafty można badać histologicznie, a także przy użyciu standardowych technik molekularnych i biochemicznych. W niniejszym artykule opisujemy metodę generowania hodowli raftowych z pierwotnych ludzkich keratynocytów. Tą samą technikę można zastosować w przypadku ustalonych linii komórkowych nabłonka, a także łatwo zaadaptować do wykorzystania tkanek nabłonkowych z prawidłowych lub zmienionych chorobowo biopsji⁸. Wiele wirusów w ramach swojego replikacyjnego cyklu życiowego atakuje nabłonek skóry lub błon śluzowych. W ciągu ostatnich kilku lat wykazano możliwość wykorzystania organotypowych hodowli raftowych jako metody badania interakcji wirus-komórka gospodarza w przypadku kilku herpeswirusów, a także adenowirusów, parwowirusów i poxwirusów⁹. Organotypowe hodowle raftowe mogą zatem zostać zaadaptowane do badania patogenezy wirusowej i stanowią jedyny sposób testowania nowych środków przeciwwirusowych w przypadku wirusów, których nie można hodować w stałych liniach komórkowych.

Protokół

1. Przygotowanie do organotypowych kultur raftowych

1. Metalowe siatki do raftów muszą zostać najpierw poddane działaniu kwasu chromowo-siarkowego w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń, które mogłyby zakłócić proces różnicowania. Zanurz metalowe siatki w zlewce z kwasem siarkowym na jedną godzinę, a następnie płucz je w sposób ciągły przez noc wodą z kranu. Po płukaniu nocnym siatki należy płukać przez 3-5 godzin w podwójnie destylowanej wodzie.
2. Aby zapewnić wsparcie dla raftów, zgnij trzy boki raftu o około 0,5 cm w równych odstępach od siebie. Następnie metalowe siatki należy poddać autoklawowaniu.
3. Przygotuj 10X bufor do rekonstytucji, dodając 2,2 g NaHCO3 oraz 4,8 g Hepes. Rozpuść w 100 ml 0,05 M NaOH. Przefiltruj w celu sterylizacji i przechowuj w aliquotach po 5 ml w temperaturze -20°C.
4. Przygotuj 10X DMEM bez wodorowęglanu sodu. Przefiltruj w celu sterylizacji i przechowuj w aliquotach po 5 ml w temperaturze -20°C.
5. Przygotuj mysi czynnik wzrostu naskórka: rozpuść 100 mg EGF oraz 10 mg BSA, z każdego osobno w 10 ml zdejonizowanej ddH₂0. Połącz EGF i BSA, a następnie dodaj do 80 ml zdejonizowanej ddH₂0, tak aby uzyskać objętość końcową 100 ml. Przefiltruj w celu sterylizacji, podziel na aliquoty (5 ml) i przechowuj w -20°C. Do każdego litra pożywki E dodaj 5 ml EGF o stężeniu 1 mg/ml (stężenie końcowe 5 ng/ml).

2. Przygotowanie żeli kolagenowych

1. Do każdego raftu wymagany jest jeden żel kolagenowy. Kolagen należy przechowywać w lodzie, aby zapobiec jego krzepnięciu. Każdy żel kolagenowy wymaga 3 ml mieszaniny kolagenowej składającej się z: 2,4 ml zimnego kolagenu typu I z ogona szczura (stężenie końcowe 3-4 mg/ml), 0,3 ml 10X buforu do rekonstytucji, 0,3 ml 10X DMEM oraz 1-2 X 10⁶ fibroblastów mysich 3T3 J2 jako komórek odżywiających (feeder cells). W przypadku roztworów kolagenu z ogona szczura o wysokim stężeniu, należy rozcieńczyć je w 0,02 M kwasie octowym, aby uzyskać odpowiednie stężenie robocze.
2. Określ liczbę potrzebnych żeli kolagenowych (raftów), a następnie oblicz ilość mieszaniny głównej (master mix) dla wymaganej ilości kolagenu, 10X buforu do rekonstytucji, 10X DMEM i fibroblastów J2. W każdej mieszaninie głównej uwzględnij zapas na 3-4 dodatkowe żele ze względu na lepkość kolagenu.
3. Aby przygotować żel kolagenowy, poddaj fibroblasty J2 trypsynizacji i zneutralizuj je medium. Połącz wszystkie fibroblasty i umieść je w probówce stożkowej o pojemności 50 ml. Policz komórki, aby określić liczbę raftów, które można przygotować. Ponownie: na jeden żel kolagenowy, a tym samym na jeden raft, wymagane jest 1-2x10⁶ fibroblastów. Odwiruj komórki przy niskiej prędkości.
4. Odsuń medium z osadu fibroblastów i resuspenduj je w odpowiedniej ilości 10X buforu do rekonstytucji, 10X DMEM i kolagenu dla obliczonej liczby raftów. Kolagen dodaj na samym końcu, aby zapobiec zbyt szybkiemu krzepnięciu żelu. Po dodaniu kolagenu wymieszaj szybko, ale delikatnie, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do żelu. Żel powinien mieć czerwonopomarańczowy kolor, co wskazuje na prawidłowe pH. Jeśli mieszanina żelu jest zbyt żółta, dodaj kilka kropli filtrowanego sterylnie 1N NaOH i delikatnie wymieszaj, aby uzyskać właściwy kolor.
5. Dodaj 3 ml mieszaniny kolagenu i fibroblastów do dołków płytki hodowlaną 6-dołkowej. Mieszaninę kolagenową należy nanosić pipetą powoli po ściance każdego dołka, aby uniknąć powstawania pęcherzyków. Umieść płytkę w inkubatorze do hodowli tkanek w temperaturze 37°C i pozostaw do zestalenia na 30 minut.
6. Po 30 minutach dodaj 3 ml medium E z EGF na powierzchnię zestalonego żelu kolagenowego i wprowadź płytkę z powrotem do inkubatora. Żele powinny być przechowywane w 37°C przez co najmniej jeden dzień, ale wykorzystane w ciągu czterech dni. Optymalne wyniki uzyskuje się po dwóch dniach inkubacji.

3. Przygotowanie keratynocytów do różnicowania

1. Keratynocyty o niskim numerze pasażu należy hodować do osiągnięcia około 70% konfluencji. Każdy raft wymaga 1-2x10⁶ keratynocyty. Keratynocyty poddać trypsynizacji i zneutralizować w medium E z dodatkiem EGF. Policzyć komórki, aby określić liczbę możliwych do przygotowania raftów. Odwiruj komórki przy niskiej prędkości. Osad resuspendować w 1 ml medium E z EGF na każdą obliczoną kulturę raftu.
2. Odssać pożywkę z żelów kolagenowych, przechylając płytkę 6-dołkową. Do każdego żelu dodać 2 ml świeżej pożywki E z dodatkiem EGF. Do każdego żelu ostrożnie dodać 1 ml resuspenderowanych keratynocytów do 2 ml pożywki E znajdującej się już w dołku. Delikatnie pipetować keratynocyty wraz z 2 ml pożywki, a następnie powoli nanosić kroplami z powrotem na żel. Wstrząsanie lub kołysanie płytki może doprowadzić do nierównomiernego rozprzestrzenienia się komórek po jednej stronie żelu kolagenowego. Umieścić płytkę w 37°C inkubator
3. Komórki należy hodować do osiągnięcia konfluencji, codziennie wymieniając pożywkę E. Konfluencję komórek stwierdza się, gdy po jednym dniu od wymiany pożywki jej kolor zmieni się na żółty. Zazwyczaj trwa to od 2 do 4 dni. Jeśli do czwartego dnia kolor pożywki nie ulegnie zmianie, należy przejść do następnego kroku.

4. Przygotowanie kultur na tratwach

1. Używając sterylnej pęsety, umieść sterylną metalową siatkę do hodowli (raft grid), zgiętymi stronami do dołu, w naczyniu o średnicy 10 cm. Odessaj pożywkę z żelu kolagenowego. Aby oddzielić żel od ścianek dołka, prowadź sterylną szpatułką wzdłuż obwodu żelu, wykonując ruchy góra-dół. Aby usunąć żel kolagenowy, lekko przechyl płytkę i podnieś go, wsuwając szpatułkę pod spód. Połóż żel kolagenowy na metalowej siatce, nie dopuszczając do powstania pęcherzyków powietrza między siatką a żelem. Na każdej siatce można umieścić dwa żele.
2. W celu stworzenia granicy faz powietrze-ciecz (air-liquid interface), powoli dodaj pożywkę E bez dodatku EGF na dno naczynia, tak aby siatka stykała się z pożywką, ale żel kolagenowy nie. Pożywka nie powinna przenikać przez otwory w siatce. Dodawaj pożywkę powoli, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza pod siatką, ponieważ mogłoby to zapobiec jednolitej różnicowaniu. Inkubuj hodowle w temperaturze 37°C i wymieniaj pożywkę co drugi dzień, utrzymując granicę faz powietrze-ciecz. Zbierz hodowle po 14 dniach.

5. Reprezentatywne wyniki

Przy prawidłowym przeprowadzeniu protokołu z wykorzystaniem pierwotnych keratynocytów, procedura ta pozwoli na uzyskanie dobrze zróżnicowanego nabłonka, w którym widoczne są poszczególne warstwy skóry. Można to potwierdzić w badaniu histologicznym poprzez barwienie preparatów kultur raftów hematoksyliną i eozyną (H&E), jak pokazano na Ryc. 1B. Barwienie H&E jest również przydatne do badania morfologii raftów oraz wpływu wirusów lub związków przeciwwirusowych na zdolność komórek do stratyfikacji i różnicowania. Na przykład rafty wykonane z pierwotnych ludzkich keratynocytów unieśmiertelnionych przez HPV (HFK-31) są wyraźnie grubsze w porównaniu do raftów wykonanych z normalnych ludzkich keratynocytów napletka (HFK), co odzwierciedla zwiększone tempo proliferacji oraz zdolność białek HPV do utrzymywania komórek różnicujących się w cyklu komórkowym (Ryc. 1B)¹⁰. Skutkuje to utrzymaniem jąder komórkowych w całym nabłonku, podczas gdy normalne keratynocyty opuszczają cykl komórkowy podczas różnicowania, co prowadzi do rozpadu otoczki jądrowej. Aby dokładniej zbadać proces różnicowania, można przeprowadzić immunohistochemię w celu analizy specyficznych markerów różnicowania, w tym cytokeratyn, a także inwolukryny i filagryny. Różne cytokeratyny są ekspresowane na specyficznych etapach różnicowania⁷. Jak pokazano na Ryc. 2, cytokeratyna 10 (K10) nie jest ekspresowana w warstwie podstawnej i występuje jedynie w warstwach nadpodstawnych, składających się z komórek ulegających stopniowemu różnicowaniu. W raftach HPV-dodatnich ekspresja K10 jest opóźniona w porównaniu do normalnych keratynocytów, co ponownie odzwierciedla wpływ białek HPV na różnicowanie keratynocytów. Immunohistochemia może być również wykorzystana do badania profilu ekspresji genów wirusowych. Na Ryc. 3 przedstawiono reprezentacyjne barwienie sprawdzające ekspresję białka HPV E1^E4, które jest białkiem późnym, którego ekspresja ogranicza się do najwyższych warstw nabłonka. Zgodnie z oczekiwaniami, w kulturach raftów z normalnych ludzkich keratynocytów napletka nie obserwuje się barwienia.

Rycina 1. A) Schemat metody przygotowywania organotypowych kultur raft z pierwotnych keratynocytów lub linii komórek nabłonkowych. B) Barwienie hematoksyliną i eozyną organotypowych kultur raft wytworzonych z keratynocytów ludzkiej napletka stabilnie utrzymujących episomy HPV-31 (HFK-31) lub z normalnych keratynocytów ludzkiej napletka (HFK). Zidentyfikowano poszczególne warstwy nabłonka oraz zatyczkę kolagenową.

Rysunek 2. Ekspresja cytokeratyny 10 (K10) jest ograniczona do warstw nadbazalnych nabłonka. Immunohistochemię przeprowadzono na przekrojach organotypowych kultur raft generowanych z komórek HFK-31, a także prawidłowych komórek HFK, z użyciem przeciwciała przeciwko K10. DNA komórkowe przeciwbarwiono DAPI. Obrazy zarejestrowano za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Strzałki wskazują warstwę podstawną nabłonka.

Rycina 3. Białko E1^E4 HPV jest produkowane w późnej fazie produktywnej cyklu życiowego wirusa. Immunohistochemię wykonano na przekrojach organotypowych kultur raft generowanych z komórek HFK-31, a także normalnych komórek HFK z użyciem przeciwciał przeciwko E1ˆE4. DNA komórkowe przeciwbarwiono DAPI. Obrazy zarejestrowano przy użyciu konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Strzałki wskazują warstwę podstawną nabłonka.

Dyskusja

Opisujemy tutaj metodę, która może być wykorzystana do ogólnego badania różnicowania nabłonkowego, ale może zostać również łatwo zaadaptowana do badania patogenezy wirusowej, jak i skuteczności potencjalnych środków terapeutycznych. Wiele wirusów atakuje komórki nabłonkowe albo jako pierwotne miejsce infekcji, jak w przypadku HPV, albo w pewnym momencie cyklu życiowego wirusa, jak w przypadku wirusów herpes. Chociaż hodowla organotypowych kultur raft (kultur na rusztowaniach), jest czasochłonna, zdolność do wiernego odtw...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kolagen typu 1 z ogona szczura (4-5mg/ml)	BD Biosciences	354236
DMEM bez NaHC03	Invitrogen	12100-061
NaHC03	Sigma-Aldrich	S5761
Hepes	Calbiochem	391338
Stalowe siatki metalowe	Williams and Mettle Co.	CR-03063-040-100-S
Pożywka E11
Epidermalny czynnik wzrostu	BD Biosciences	354010