Profil metabolomiczny Mycobacterium tuberculosis jest określany po hodowli w pożywkach płynnych. Warunki mogą być modyfikowane w celu zbadania wpływu suplementów odżywczych, utleniaczy oraz leków przeciwgruźliczych na profil metaboliczny tego mikroorganizmu. Procedura przygotowania ekstraktu jest odpowiednia zarówno dla analiz NMR 1D 1H, jak i 2D 1H-13C.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie próbek ekstraktów z Mycobacterium tuberculosis do metabolomicznych badań metodą rezonansu magnetycznego jądra
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mycobacterium tuberculosis jest główną przyczyną śmiertelności ludzi w skali globalnej. Pojawienie się szczepów wielolekoopornych (MDR) oraz ekstremalnie lekoopornych (XDR) grozi zahamowaniem obecnych wysiłków w zakresie kontroli tej choroby. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania leków i szczepionek, które byłyby bardziej skuteczne niż te obecnie dostępne. Genom M. tuberculosis jest znany od ponad 10 lat, jednak wciąż istnieją istotne luki w naszej wiedzy na temat funkcji i niezbędności genów. W wielu badaniach wykorzystano analizę ekspresji genów na poziomie transkrypcyjnym i proteomicznym, aby określić wpływ leków, utleniaczy i warunków wzrostu na globalne wzorce ekspresji genów. Ostatecznie końcowa odpowiedź na te zmiany odzwierciedlona jest w składzie metabolicznym bakterii, obejmującym kilka tysięcy związków o niskiej masie cząsteczkowej. Porównanie profili metabolicznych szczepów typu dzikiego i mutantów, nieleczonych lub leczonych konkretnym lekiem, może skutecznie umożliwić identyfikację celu i doprowadzić do opracowania nowych inhibitorów o działaniu przeciwgruźliczym. Podobnie można oceniać wpływ dwóch lub więcej warunków na metabolom. Magnetyczny rezonans jądrowy (NMR) jest potężną technologią wykorzystywaną do identyfikacji i ilościowego określania produktów pośrednich metabolizmu. W niniejszym protokole opisano procedury przygotowania ekstraktów komórkowych M. tuberculosis do analizy metabolomicznej metodą NMR. Hodowle komórkowe są prowadzone w odpowiednich warunkach i wymagają izolacji na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 3 (Biosafety Level 3),1 zbierane, a następnie poddawane lizie mechanicznej w niskich temperaturach w celu maksymalnego zachowania metabolitów. Lizaty komórkowe są odzyskiwane, filtrowane w celu sterylizacji i przechowywane w ultra-niskich temperaturach. Alikwoty z tych ekstraktów komórkowych są wysiewane na agar Middlebrooka 7H9 w celu oznaczenia jednostek tworzących kolonie, aby zweryfikować brak żywych komórek. Po dwóch miesiącach inkubacji w 37 °C, jeśli nie zaobserwowano żywych kolonii, próbki są wywożone z zaplecza izolacyjnego do dalszego przetwarzania. Ekstrakty są liofilizowane, resuspenderowane w buforze deuterowanym i wstrzykiwane do urządzenia NMR, co pozwala na zarejestrowanie danych spektroskopowych, które następnie poddawane są analizie statystycznej. Opisane procedury mogą być stosowane zarówno dla jednowymiarowych (1D) analiz 1H NMR, jak i dwuwymiarowych (2D) analiz 1H-13C NMR. Metodyka ta zapewnia bardziej niezawodną identyfikację metabolitów o niskiej masie cząsteczkowej oraz bardziej wiarygodne i czułe analizy ilościowe składu metabolicznego ekstraktów komórkowych niż metody chromatograficzne. Wariacje opisanej procedury następujące po etapie lizy komórek mogą zostać również dostosowane do równoległej analizy proteomicznej.
Protokół
1. Tekst protokołu
Niniejszy protokół przedstawia adaptację metodologii NMR do badania M. tuberculosis (patogen klasy III). W związku z tym, podczas prowadzenia badań nad M. tuberculosis w laboratorium z aktualnym certyfikatem, należy przestrzegać zasad poziomu bezpieczeństwa biologicznego 3 (BSL3). Najważniejszym zagrożeniem dla personelu pracującego z tymi mikroorganizmami jest ekspozycja na aerozole generowane w laboratorium. Poniższe procedury są stosowane w naszej instytucji i mogą ulegać zmianom w zależności od zaleceń Instytucjonalnego Komitetu Bezpieczeństwa Biologicznego. Standardowy sprzęt ochrony osobistej obejmuj....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Znaczna liczba badań przeanalizowała profile transkrypcyjne i proteomiczne M. tuberculosis w różnych warunkach in vitro oraz in vivo.11-16 W rezultacie zmiany w ekspresji genów i aktywności enzymów prowadzą do wahań stężeń cząsteczek o niskiej masie cząsteczkowej. Pełny opis tych związków stanowi metabolom. Zatem wpływ leków i zróżnicowanych warunków wzrostu na szlaki metaboliczne można śledzić za pomocą analizy metabolomicznej.17,18 Nieliczne badania wykorzystały tę metod.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować wszystkim członkom laboratoriów dr. Barletty i dr. Powers za pomocne uwagi podczas opracowywania protokołu. Dziękujemy Wendy Austin za pomocne dyskusje i korektę rękopisu. Praca opisana w niniejszym manuskrypcie była finansowana z pilotażowych grantów zasiewowych przyznanych każdemu z wymienionych powyżej badaczy przez University of Nebraska-Lincoln Redox Biology Center (grant nadrzędny #NCRR 2P20RR 017675, D. Becker, P.I.). Ponadto dziękujemy dr Ofelii Chacon za zapewnienie środków z jej grantu R21 (1R21AI087561-01A1) na materiały badawcze oraz częściowe dofinansowanie wynagrodzenia pana Halouski w celu standaryzacji technik NMR zawartyc....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Suplement ADC | BD BBL Middlebrook | 212352 | |
| Próbnik BACS-120 | Bruker | ||
| Spektrometr NMR Bruker Avance | Bruker | 500 MHz | |
| Seryjna albumina wołowa | Fisher Scientific | BP1600-100 | Frakcja V |
| Wirówka | Beckman Coulter | Allegra X-15R | Nastolna |
| Probówki do wirowania | Corning | 430291 | 50 ml, sterylne, polipropylenowe |
| Probówki kriogeniczne | Corning | 430488 | 2,0 ml, sterylne, polipropylenowe |
| Cykloheksymida | A.G. Scientific | C-1189 | Toksyczna |
| D(+) - Glukoza | ACROS | 41095-0010 | |
| Tlenek deuteru | Sigma Aldrich | 617385 | |
| Kolba Erlenmeyera | VWR | 89095-266 | Sterylna, płaskie dno, poliwęglanowa, korek z membraną PTFE 0,22 μm |
| Kolba do szybkiego mrożenia | VWR | 82018-226 | 750 ml |
| Liofilizator | VWR | 82019-038 | 4,5 L, nastolny |
| Glicerol | GibcoBRL | 15514-029 | |
| Inkubator | New Brunswick | Innova 40 | Mieszadło nastolne |
| Matryca do lizy B | MP Biomedicals | 6911-100 | |
| Urządzenie do lizy | MP Biomedicals | FastPrep-24 | |
| Mikrowirówka | Eppendorf | 5415D | Nastolna |
| Mikrowirówka | Beckman Coulter | Microfuge 22R | Nastolna |
| Pożywka Middlebrook 7H9 | Difco | 271310 | |
| Probówki NMR | Norell | ST500-7 | 5mM |
| Suplement OADC | BD BBL Middlebrook | 212351 | |
| Kwas oleinowy | Sigma | O1008 | |
| Fosforan dwuzasadowy potasu | VWR | BDH0266 | |
| Fosforan jednozasadowy potasu | VWR | BDH0268 | |
| Rotor - Microfuge 22R | Beckman Coulter | F241.5P | Szczelny, polipropylenowy |
| Rotor - Allegra X-15R | Beckman Coulter | SX4750 | Z certyfikowanymi osłonami biologicznymi |
| Chlorek sodu | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sód-3-trimetylosililopropionian-2,2,3,3-D4 | Cambridge Isotope | DLM-48 | |
| Spektrofotometr | Beckman Coulter | DU-530 | |
| Kuwety spektrofotometryczne | LifeLINE | LS-2410 | 1,5 ml, polistyrenowe, 2 przezroczyste ścianki |
| Strzykawka | Becton Dickinson | 309585 | Sterylna, 3 ml Luer-Lok |
| Filtr strzykawkowy | Nalgene | 190-2520 | 0,2 μm, sterylny octan celulozy |
| Tween 80 | Fisher Scientific | BP338-500 |
Bibliografia
- Larsen, M. H., Biermann, K., Tandberg, S., Hsu, T., Jacobs, W. R. Genetic Manipulation of Mycobacterium tuberculosis. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 2(2007).
- Larsen, M. H., Biermann, K., Jacobs, W. R. Laboratory Maintenance of Mycobacterium tuberculosis. Curr. Protoc. Microbiol<....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
