Artykuł metodologiczny

Przygotowanie próbek ekstraktów z Mycobacterium tuberculosis do badań metabolomicznych magnetycznego rezonansu jądrowego

DOI:

10.3791/3673

⸱

3 września 2012

 ,  ,  ,  , 
1School of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, University of Nebraska-Lincoln, 2Department of Chemistry, University of Nebraska-Lincoln

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Profil metabolomiczny Mycobacterium tuberculosis jest określany po wzroście w kulturach bulionowych. Warunki można zmieniać, aby przetestować wpływ suplementów diety, utleniaczy i środków przeciwgruźliczych na profil metaboliczny tego mikroorganizmu. Procedura przygotowania ekstraktu ma zastosowanie zarówno do analiz 1D 1H, jak i 2D 1 H-13C NMR.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mycobacterium tuberculosis jest główną przyczyną śmiertelności ludzi na skalę globalną. Pojawienie się zarówno szczepów wieloopornych (MDR), jak i ekstensywnie (XDR) grozi zniweczeniem obecnych wysiłków na rzecz kontroli choroby. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania leków i szczepionek, które będą skuteczniejsze niż te obecnie dostępne. Genom M. tuberculosis jest znany od ponad 10 lat, jednak istnieją poważne luki w naszej wiedzy na temat funkcji i istotności genów. Od tego czasu w wielu badaniach stosowano analizę ekspresji genów zarówno na poziomie transkryptomicznym, jak i proteomicznym w celu określenia wpływu leków, utleniaczy i warunków wzrostu na globalne wzorce ekspresji genów. Ostatecznie ostateczna reakcja tych zmian znajduje odzwierciedlenie w składzie metabolicznym bakterii, w tym kilku tysiącach substancji chemicznych o małej masie cząsteczkowej. Porównanie profili metabolicznych szczepów typu dzikiego i zmutowanych, zarówno nieleczonych, jak i leczonych określonym lekiem, może skutecznie umożliwić identyfikację celu i może prowadzić do opracowania nowych inhibitorów o działaniu przeciwgruźliczym. Podobnie można również ocenić wpływ dwóch lub więcej warunków na metabolom. Magnetyczny rezonans jądrowy (NMR) to potężna technologia, która służy do identyfikacji i ilościowego określania produktów przemiany materii. W niniejszym protokole opisano procedury przygotowania ekstraktów komórkowych M. tuberculosis do analizy metabolomicznej NMR. Hodowle komórkowe są hodowane w odpowiednich warunkach i z wymaganym poziomem bezpieczeństwa biologicznego 3, zbierane i poddawane mechanicznej lizie przy zachowaniu niskich temperatur w celu maksymalizacji zachowania metabolitów. Lizaty komórkowe są odzyskiwane, filtrowane, sterylizowane i przechowywane w bardzo niskich temperaturach. Podwielokrotności z tych ekstraktów komórkowych są siane na agarze Middlebrook 7H9 dla jednostek tworzących kolonie w celu sprawdzenia braku żywotnych komórek. Po dwóch miesiącach inkubacji w temperaturze 37 °C, jeżeli nie zaobserwuje się żadnych żywotnych kolonii, próbki są usuwane z obiektu przechowawczego w celu dalszego przetwarzania. Ekstrakty są liofilizowane, ponownie zawieszane w deuterowanym buforze i wstrzykiwane do instrumentu NMR, przechwytując dane spektroskopowe, które są następnie poddawane analizie statystycznej. Opisane procedury mogą być stosowane zarówno do jednowymiarowych (1D) 1H NMR, jak i dwuwymiarowych (2D) 1 H-13C NMR. Metodologia ta zapewnia bardziej wiarygodną identyfikację metabolitów o małej masie cząsteczkowej oraz bardziej wiarygodne i czułe analizy ilościowe składu metabolicznego ekstraktów komórkowych niż metody chromatograficzne. Warianty procedury opisanej po etapie lizy komórek można również dostosować do równoległej analizy proteomicznej.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Tekst protokołu

Ten protokół podkreśla adaptację metodologii NMR do M. tuberculosis (czynnik klasy III). W związku z tym podczas prowadzenia badań nad M. tuberculosis w corocznie certyfikowanym laboratorium należy przestrzegać praktyk poziomu bezpieczeństwa biologicznego 3 (BSL3). Narażenie na aerozole wytwarzane w laboratorium jest najważniejszym zagrożeniem, z jakim spotyka się personel pracujący z tymi mikroorganizmami. W naszej placówce przeprowadzane są następujące procedury i mogą występować różnice w zależności od zaleceń Instytucjonalnego Komitetu ds. Bezpieczeństwa Biologicznego. Typowe wyposażenie ochronne personelu składa się z kombinezonu Tyvek, czapki z daszkiem, butów, respiratora N95, ochrony oczu, rękawów i podwójnej pary rękawic nitrylowych. Prace związane z hodowlą M. tuberculosis i/lub manipulacją z otwartymi pojemnikami na M. tuberculosis są wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego typu A2 lub B2. Na powierzchni roboczej umieszcza się papier chłonny pokryty tworzywem sztucznym. Wszystkie materiały/zapasy, które mają być usunięte lub usunięte z zakładu, muszą zostać umieszczone w dwóch workach na zagrożenia biologiczne i odkażone przez autoklawowanie. Powierzchnie robocze i sprzęt używany w szafie (homogenizator do lizy FastPrep-24, spektrofotometr, wiadro z lodem itp.) muszą być dezynfekowane po każdej sesji roboczej 1% Amphyl (środek prątkobójczy, bakteriobójczy, grzybobójczy i wirusobójczy). Kultury M. tuberculosis muszą być umieszczone w podwójnej hermetyce w celu transportu do większych urządzeń znajdujących się poza komorą bezpieczeństwa biologicznego, takich jak zamrażarki, inkubatory, wirówki i lodówki. Wirowanie odbywa się za pomocą zamkniętych miseczek bezpieczeństwa i górnych probówek z o-ringiem. W celu dalszej analizy poza laboratorium BSL3 ekstrakty bezkomórkowe są filtrowane przez filtr 0,2 μm lub mikroorganizmy zabijane termicznie w temperaturze 95 °C przez 15 minut.2 Próbki są posiewane w celu sprawdzenia braku jednostek tworzących kolonie przed usunięciem z zabezpieczenia.

  1. Przenieść 110 ml kompletnej pożywki Middlebrook 7H9 zawierającej bulion polisorbatu 80 (Tween 80 zapobiegający zbrylaniu) (MADC-TW) lub odpowiedniej pożywki do kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml. Potrójne kultury są rutynowo hodowane w zależności od warunków przy użyciu 13metabolitów C, a dziesięć identycznych kultur jest hodowanych w celu profilowania 1D 1H NMR. W przypadku dwóch warunków (np. z dodatkiem leku lub bez niego) można wyhodować podwójną objętość kultury na powtórzenie i podzielić ją na dwie identyczne kultury. Wszystkie receptury odczynników i roztworów znajdują się na końcu protokołu.
  2. Zaszczepić bulion 0,150 ml bulionu M. tuberculosis 50% glicerolu (pozostawić do rozmrożenia na lodzie). Patrz uwaga 1 poniżej.
  3. Pozwól kulturze rosnąć w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 100 obr./min przez około 6 dni (OD600: 0,6-0,8). Patrz uwaga 2 poniżej.
  4. Jeśli nie są potrzebne żadne antybiotyki, alternatywne dodatki ani inne zabiegi, kultury są gotowe do zbioru. Jeśli stosowane są zabiegi, przejdź bezpośrednio do kroku 5. Pobrać 0,5 ml próbki z każdej kolby, przenieść do probówki mikrowirówki i umieścić w temperaturze 4 °C w celu miareczkowania hodowli i kontroli jakości: testy zanieczyszczeń, analiza fenotypowa, testy PCR. Patrz uwaga 3 poniżej. W tym momencie przejdź do kroku 6.
  5. Wyjąć kolby z wytrząsarki i wykonać żądaną obróbkę (np. dodać lek lub metabolit). Umieścić kolby z powrotem w wytrząsarce i inkubować przez dodatkowy okres (np. 6-18 godzin). Pod koniec tego czasu pobrać kolejną 1,0 ml podwielokrotności i oznaczyć OD600. Pobrać próbkę o objętości 0,5 ml z każdej kolby, przenieść do probówki mikrowirówki i umieścić w temperaturze 4 °C w celu miareczkowania hodowli i kontroli jakości.
  6. Umieść kultury na lodzie na 5 minut. Po tym kroku pozostaw komórki na lodzie przez cały pozostały protokół. Zbieraj kultury przez odwirowanie w temperaturze 2 000 x g i w temperaturze 4 °C przez 15 minut w probówkach o pojemności 50 ml za pomocą wirówki stołowej. Każda hodowla będzie wymagała czterech probówek po 25 ml każda (w sumie 100 ml jest wymagane do uzyskania odpowiedniego stosunku sygnału do szumu dla eksperymentów 2D 1 H-13C NMR, gdzie tylko 50 ml na kulturę jest wymagane do eksperymentów 1D 1H NMR).
  7. Przemyć każdą komórkę dwa razy lodowatym ddH2O (około 15 ml za pierwszym razem i 10 ml za drugim razem) za pomocą parametrów wirowania opisanych powyżej. Do drugiego prania połącz 10 ml porcji w tej samej probówce przed odwirowaniem. Zawiesić osad komórkowy w końcowej objętości 1,0 ml ddH2O (należy dostosować do objętości osadu komórkowego). Jeśli na tym etapie pożądana jest zawiesina pojedynczej komórki wolna od zbrylania, komórki mogą być krótko sonikowane i/lub trzykrotnie przepuszczone przez igłę o rozmiarze 27. Alternatywnie, granulat komórkowy można zamrozić w temperaturze -80 °C i przechowywać do czasu dalszego przetwarzania. W tym drugim przypadku zamrożone granulki są rozmrażane na lodzie przed ponownym zawieszeniem. Zawiesić osady komórek w końcowej objętości 1,0 mlddH2O, jak podano powyżej.
  8. Przenieść zawiesinę komórek o objętości 1,0 ml do probówki z nakrętką o pojemności 2,0 ml zawierającej Lysing Matrix B (kulki krzemionkowe o średnicy 0,1 mm). Umieść homogenizator do lizy FastPrep-24 w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Umieść próbki w uchwycie na próbki, zabezpieczając płytkę szprychy mocującej na górze probówki. Przetwarzaj próbki przez 60 sekund w homogenizatorze z prędkością ustawioną na 6 metrów/sek.
  9. Wirować próbki w mikrowirówce o sile 15 000 x g i temperaturze 4 °C przez 10 minut, aby osadzać resztki komórek i nienaruszone komórki.
  10. Usunąć supernatant i przepuścić próbkę przez filtr strzykawkowy (0,2 μm) do sterylnej probówki. Umieścić 0,1 ml próbki (lub reprezentatywną część próbki, jak na przykład 10%) na agarze MADC w celu sprawdzenia, czy nie ma żywych komórek. Badacze mogą również przeprowadzić więcej niż jeden etap filtracji i/lub zweryfikować obecność żywych komórek w ekstraktach, stosując procedury barwienia żywych żywych zmarłych, aby zapobiec wszelkim potencjalnym zagrożeniom związanym z bezpieczeństwem biologicznym lub je zidentyfikować. Próbki należy zamrozić w łaźni etanolowo-suchej i przetworzyć w temperaturze -80 °C, aż będą gotowe do liofilizacji i przetworzenia w urządzeniu do NMR.
  11. Po 2 miesiącach sprawdź płytki, aby sprawdzić, czy nie ma jednostek tworzących kolonie. Jeśli nie zostaną znalezione żadne CFU, próbki mogą zostać pobrane z laboratorium BSL3. Dalsza analiza jest przeprowadzana w standardowym obiekcie NMR, który zwykle obsługuje wielu użytkowników i działa bez szczególnych wymagań dotyczących hermetyzacji.
  12. Liofilizować próbki do sucha, a następnie ponownie zawiesić w 0,7 ml buforu NMR i przenieść do probówki mikrowirówkowej. Wirować przez 3 minuty przy 13 000 x g. Usunąć 0,6 ml i przenieść do probówki NMR o średnicy 5 mm. Alternatywnie, liofilizowane próbki mogą być wysyłane do zewnętrznego zakładu jako regularne próbki niestwarzające zagrożenia biologicznego.
  13. Dane NMR są zbierane natychmiast. Pomimo wszelkich środków ostrożności, aktywne enzymy mogą być nadal obecne, a próbka zazwyczaj nie jest stabilna przez długi czas. Zmiany w widmie NMR są zauważalne, gdy próbki pozostawia się w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 °C przez ponad 1 tydzień. Ponadto zbieranie danych NMR odbywa się naprzemiennie między kulturami nieleczonymi i leczonymi lekami, w których próbki są losowo wybierane z każdej kategorii. Zapobiega to niepotrzebnemu odchyleniu, ponieważ dana kategoria miała dłuższe opóźnienie przed zebraniem widm NMR. Błąd systematyczny w danych wystąpiłby, gdyby najpierw pobrano widma NMR dla wszystkich próbek nieleczonych, a następnie próbki poddane działaniu leku. Jeżeli próbki nie mogą być natychmiast przeanalizowane za pomocą NMR, próbki należy przechowywać w probówkach Eppendorfa o pojemności 1 ml w temperaturze -80 °C.
  14. Po włożeniu próbek do zmieniacza próbek BACS-120 wymagana jest kalibracja przyrządu, która obejmuje kilka rutynowych kroków, takich jak blokada, podkładka, strojenie i optymalizacja długości impulsu 90 °, aby zmaksymalizować jakość wyników. Pojedyncza próbka służy do kalibracji długości impulsu 90 ° i dostrojenia przyrządu do pozostałych próbek. Blokowanie, podkładkowanie i zbieranie danych NMR dla każdej próbki jest zautomatyzowane za pomocą ICONNMR i gradshim.
  15. Widmo 1D 1H NMR jest zbierane za pomocą sekwencji impulsów Bruker zgesgp z tłumieniem wody za pomocą rzeźbienia wzbudzenia. Używane są łącznie 32 tys. punktów danych o szerokości przemiatania 5482,5 Hz, 128 skanów i 16 skanów fikcyjnych. Widmo 2D 1 H-13C HSQC jest zbierane za pomocą sekwencji impulsów Bruker hsqcetgp. Łącznie zbieranych jest 2048 punktów danych o szerokości przemiatania 5000,0 Hz wzdłuż bezpośredniego wymiaru 1H i 64 punktów danych o szerokości przemiatania 18864,9 Hz wzdłuż pośredniego wymiaru 13C. Widmo jest zbierane za pomocą 128 skanów i 16 skanów fikcyjnych w celu uzyskania dobrego stosunku sygnału do szumu.

figure-protocol-1
Rysunek 1. Przedstawiono schemat przepływu procedur eksperymentalnych.

Bufor NMR

Podstawowy roztwór 50 mM buforu fosforanu potasu z 50 μM TMSP:

  • 2,17 gK2HPO4 (fosforan potasu dwuzasadowy)
  • 1,70 g KH2PO4 (fosforan potasu jednozasadowy)
  • 7,86 mg 3-trimetylosililopropionianu sodu (TMSP-2,2,3,3-D4 (D,98%) )
  • Rozpuścić w 500 ml "100%" D2O
  • Końcowy roztwór powinien mieć pH 7,2 (nieskorygowane)

MADC-TW lub MOADC-TW (1 L)

  • 4,7 g bazy bulionowej Middlebrook 7H9
  • 900 ml ddH2O
  • 2 ml glicerolu
  • Wymieszaj składniki i sterylizuj w autoklawie przez 25 minut. Chłodny płyn do dotyku i dodaj następujące roztwory:
  • 100 ml ADC podczas przygotowywania MADC lub 100 ml OADC podczas przygotowywania MOADC
  • 2,5 ml 20% Tween 80 (alternatywnie 1 ml niemetabolizowanego 20% Tyloxapolu)
  • 10 ml 1% cykloheksymidu

ADC (1 L)

  • 20 g D(+)-glukozy
  • 50 g BSA frakcja V
  • 8,5 g NaCl
  • 800 ml ddH2O
  • Rozpuść razem, dostosuj objętość do 1 l i wysterylizuj filtrem 0,2 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C.

Alternatywnie, aby przygotować OADC (1L), dodaj wszystkie składniki wymienione powyżej plus 50 ml 1% kwasu oleinowego (poniższy przepis daje partię 250 ml). Rozpuść razem, dostosuj objętość do 1 l i wysterylizuj filtrem 0,2 μm. Butelkę należy zawinąć w folię aluminiową i przechowywać w temperaturze 4 °C.

  • 2,5 g kwasu oleinowego
  • 250 ml 0,2M NaOH
  • Rozmrozić kwas oleinowy (zestala się po schłodzeniu) przez ogrzewanie w temperaturze 55 °C przez 10 minut, a następnie dodać do roztworu NaOH i podgrzewać mieszając przez 60 minut. Przechowywać w sterylnych szklanych butelkach owiniętych w folię aluminiową. Szczelnie zamknąć butelki parafilmem i przechowywać w temperaturze 4 °C.

Jeśli wolisz, możesz zakupić komercyjne BD BBL Middlebrook ADC lub OADC z Wzbogacaniem katalazy.

1% cykloheksymidu (100ml)

  • 1 g cykloheksymidu
  • 100 ml ddH2O

Rozpuść i wysterylizuj za pomocą filtra 0,2 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C. Uwaga: cykloheksymid jest toksyczny, dlatego należy obchodzić się z nim z najwyższą ostrożnością.

20% (v/v) Animacja 80 (100ml)

  • 20 ml Tween 80
  • 80 ml ddH2O

Alternatywnie, zważ 20 g Tween 80 (około 18,9 ml; gęstość 1,06 g/ml), aby przygotować 20% w/v roztworu. Podgrzewać roztwór do temperatury 55 °C przez 30 minut do rozpuszczenia i całkowicie wymieszać. Sterylizuj płyn za pomocą filtra 0,2 μm. Roztwór końcowy należy przechowywać w temperaturze pokojowej.

20% (v/v) Tyloxapol (100ml)

  • 20 ml Tyloxapol
  • 80 ml ddH2O

Alternatywnie, zważ 20 g Tyloxapolu (około 18,2 ml; gęstość 1,1 g/ml), aby przygotować 20% w/v roztwór. Podgrzewać roztwór do temperatury 55 °C przez 30 minut do rozpuszczenia i całkowicie wymieszać. Sterylizuj płyn za pomocą filtra 0,2 μm. Roztwór końcowy należy przechowywać w temperaturze pokojowej.

Uwaga 1: Zapasy glicerolu M. tuberculosis są przygotowywane przy użyciu następującego protokołu.

Hodowla M. tuberculosis

  • Hodować M. tuberculosis w 50 ml MADC do nasycenia (OD600 = 1,5 do 2,0) w temperaturze 37 °C w warunkach wstrząsania (100 obr./min). W zależności od odmiany zajmie to 7-14 dni.
  • Wirować próbki w temperaturze 2 000 x g w temperaturze 4 °C przez 15 minut w celu uzyskania osadu. Usunąć supernatant.
  • Zawiesić w 6 ml sterylnego 50% glicerolu.
  • Podwielokrotność 1,5 ml rozlać do 4 fiolek kriogenicznych Corning i odpowiednio oznaczyć.
  • Natychmiast błyskawicznie zamrozić fiolki w kąpieli etanolowej/suchego lodu i przechowywać w temperaturze -80 °C.

Uwaga 2: Zaszczepianie szczepu H37Rv (-80 °C zapasy do 1,5 roku) w 70 ml pożywki MADC daje OD600 około 0,6 po 5 dniach wzrostu w temperaturze 37 °C w warunkach wstrząsania (100 rpm) w Innova 40 Shaker.

Uwaga 3: Aby przetestować zanieczyszczenie kultur, badacze mogliby zaszczepić porcję kultury na standardowym bogatym pożywce i zweryfikować brak wzrostu po całonocnej inkubacji. Rutynowo kultury są posiewane na agarze MADC w celu obserwacji morfologii kolonii i zbadania za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym. W razie potrzeby posiewy można zweryfikować metodą PCR przy użyciu starterów IS6110, jak opisano. 3

2. Reprezentatywne wyniki

Próbka, która jest dobrze przygotowana, da widmo NMR podobne do tego przedstawionego na rysunku 2. Widmo to jest reprezentacją puli metabolicznej M. tuberculosis typu dzikiego. Zidentyfikowane metabolity są bezpośrednio lub pośrednio związane ze szlakiem D-alaniny. Również wielkość szczytowych intensywności jest proporcjonalna do stężeń metabolitów obecnych w ekstrakcie komórkowym. W związku z tym zmiany w szczytowej intensywności między nieleczonymi hodowlami, leczeniem farmakologicznym i zmutowanymi szczepami mogą wskazywać na zaburzenia metabolitów i szlaków metabolicznych. Widma M. tuberculosis 1D 1H NMR zebrano za pomocą spektrometru Bruker Avance 500 MHz wyposażonego w kriosondę o potrójnym rezonansie i gradionym poziomie osi Z. Widmo zawiera ok. 400 pików, z których udało się zidentyfikować i określić ilościowo 40-50 metabolitów, w tym aminokwasy, prekursory nukleotydów oraz półprodukty kwasu glikolitycznego i cytrynowego. Do automatyzacji zbierania danych NMR wykorzystano podajnik próbek BACS-120 z oprogramowaniem Bruker Icon. Widma 1D 1H NMR zebrano przy użyciu rzeźbienia wzbudzenia4 w celu skutecznego usunięcia rozpuszczalnika i utrzymania płaskiej linii podstawowej, eliminując potrzebę zbierania linii podstawowej, która może indukować artefakty w późniejszej analizie składowych głównych (PCA) lub ortogonalnej częściowej analizie dyskryminacyjnej metodą najmniejszych kwadratów (OPLS-DA). Widmo 1D 1H NMR jest zbierane w temperaturze 25 °C przy szerokości widma 5482,5 Hz i 32 tys. punktów danych. Do uzyskania widma wykorzystano łącznie 16 skanów pozorowanych i 128 skanów. Oprogramowanie procesora 1D NMR firmy ACD Labs zostało użyte do półautomatycznego przetwarzania wszystkich widm 1D 1HNMR. Widma zostały przekształcone w Fouriera, fazowane i odniesione do piku TMSP (0,0 ppm). Pakiet oprogramowania NMRpipe został wykorzystany do indywidualnego przetwarzania widm 2D 1 H-13C NMR i przeanalizowany za pomocą NMRDraw. Plik danych FID firmy Bruker został najpierw przekonwertowany do formatu pliku rozpoznawalnego przez NMRpipe, a następnie widmo zostało przekształcone w Fouriera, skorygowane fazowo i wypełnione zerem. Obserwowane piki NMR w widmie 1D 1H NMR i 2D 1 H-13C NMR przypisuje się do określonych metabolitów przy użyciu tolerancji przesunięcia chemicznego 1H i 13C wynoszących odpowiednio 0,05 i 0,50 ppm oraz bazy danych Madison Metabolomics Consortium Database (MMCD), BioMagResBank, 6 i Human Metabolome Database. 7 W szczególności widma 1D i 2D NMR są ręcznie wybierane jako piki, a następnie przesyłana jest lista pików przesunięć chemicznych NMR. Metabolity zidentyfikowane przez Human Metabolome Database są przypisywane do widma NMR w oparciu zarówno o maksymalizację liczby pasujących rezonansów NMR, jak i przynależność do sieci metabolicznej. Każdy związek lub metabolit zazwyczaj ma wiele par C-H i odpowiednio wiele rezonansów NMR. Tak więc, im więcej tych rezonansów NMR, które obserwuje się w eksperymentalnym widmie NMR, tym bardziej prawdopodobne jest, że metabolit jest obecny. Podobnie, identyfikacja wielu metabolitów związanych z tym samym szlakiem zwiększa prawdopodobieństwo prawidłowych przypisań. Obecność metabolitów i szlaków metabolicznych jest weryfikowana za pomocą Encyklopedii Genów i Genomów z Kioto (KEGG)8 oraz baz danych MetaCyc. 9 Mycobacterium smegmatis jest użytecznym systemem modelowym dla M. tuberculosis i innych patogenów prątkowych. Jak opisano w innym miejscu, próbki M. smegmatis mogą być również zakłócane przez sonikację. 10

figure-protocol-2
Rysunek 2. Widmo 1D 1H NMR ekstraktu komórkowego Mycobacterium tuberculosis. Piki NMR związane z reprezentatywnymi metabolitami są znakowane. Skróty są następujące: AMP, monofosforan adenozyny; α-kg, α-ketoglutaran; Klej, glutaminian; i Ala, alanina.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W znacznej liczbie badań przeanalizowano profile transkryptomiczne i proteomiczne M. tuberculosis w różnych warunkach in vitro i in vivo . 11-16 Ostatecznie zmiany w ekspresji genów i aktywności enzymów prowadzą do zmian w stężeniach cząsteczek o małej masie cząsteczkowej. Pełny opis tych związków stanowi metabolom. W związku z tym wpływ leków i różnych warunków wzrostu na szlaki metaboliczne może być śledzony przez analizę metabolomiczną. 17,18 W niewielu badaniach wykorz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować wszystkim członkom laboratoriów dr Barletty i dr Powersa za pomocne komentarze podczas opracowywania protokołu. Dziękujemy Wendy Austin za pomocne dyskusje i korektę manuskryptu. Praca opisana w tym manuskrypcie została sfinansowana z pilotażowych grantów nasiennych dla każdego badacza wymienionego powyżej z University of Nebraska-Lincoln Redox Biology Center (grant rodzicielski #NCRR 2P20RR 017675, D. Becker, P.I.). Ponadto dziękujemy dr Ofelii Chacon za przekazanie środków z jej grantu R21 (1R21AI087561-01A1) na materiały badawcze oraz częściowe wsparcie wynagrodzenia pana Halouski w celu standaryzacji technik NMR zawartych w tej publikacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wzbogacanie ADCBD BBL Middlebrook212352
BACS-120 Podajnik próbekBruker
Bruker Avance NMRBruker500 MHz
Albumina surowicy bydlęcejFisher ScientificBP1600-100Frakcja V
WirówkaBeckman CoulterAllegra X-15R
Probówki wirówkoweCorning43029150 ml sterylne polipropylenowe
fiolki kriogeniczneCorning4304882,0 ml sterylny cykloheksymid polipropylenowy
AG ScientificC-1189Toksyczny
D(+) - GlukozaACROS41095-0010
Tlenek deuteruSigma Aldrich617385
Kolba Erlenmeyera VWR89095-266Sterylna, płaska podstawa, poliwęglan, 0,22 μ m Nasadka z wentylacją z membraną PTFE
Kolba do zamrażania FlashVWR82018-226750 ml
LiofilizatorVWR82019-0384,5 l Stołowy
glicerolGibcoBRL15514-029
NowyBrunszwikWytrząsarka stołowaInnova 40
Lysing Matrix BMP Biomedicals6911-100
Maszyna do lizyMP BiomedicalsFastPrep-24
MikrowirówkaEppendorf5415D
MikrowirówkaBeckman CoulterMicrofuge 22RBenchtop
Middlebrook 7H9 BulionDifco271310
ProbówkiNMR NorellST500-75mM
OADC WzbogacanieBD BBL Middlebrook212351
Kwas oleinowySigmaO1008
Fosforan potasu dwuzasadowyVWRBDH0266
Fosforan potasu jednozasadowyVWRBDH0268
Rotor - Microfuge 22RBeckman CoulterF241.5PUszczelniony i polipropylenowy
rotor - Allegra X-15RBeckman CoulterSX4750Z osłonami z certyfikatem biologicznym
Chlorek soduFisherScientific S271-3
Sodium-3-trimethylsilylpropionate-2,2,3,3-D4Cambridge IsotopeDLM-48
SpektrofotometrBeckman CoulterDU-530
Spektrofotometr KuwetyLifeLINELS-24101,5 ml polistyren, 2 przezroczyste boki
StrzykawkaBecton Dickinson309585Sterylny, 3 ml
filtr strzykawkowyNalgene190-25200,2 μ m sterylny octan celulozy
Tween 80Fisher ScientificBP338-500
stołowa Luer-Lok

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Larsen, M. H., Biermann, K., Tandberg, S., Hsu, T., Jacobs, W. R. Genetic Manipulation of Mycobacterium tuberculosis. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 2(2007).
  2. Larsen, M. H., Biermann, K., Jacobs, W. R. Laboratory Maintenance of Mycobacterium tuberculosis. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 1(2007).
  3. Clarridge, J. E. 3rd, Shawar, R. M., Shinnick, T. M., Plikaytis, B. B. Large-scale use of polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in a routine mycobacteriology laboratory. J. Clin. Microbiol. 31, 2049-2056 (1993).
  4. Nguyen, B. D., Meng, X., Donovan, K. J., Shaka, A. J. SOGGY: solvent-optimized double gradient spectroscopy for water suppression. A comparison with some existing techniques. J. Magn. Reson. 184, 263-274 (2007).
  5. Cui, Q. Metabolite identification via the Madison Metabolomics Consortium Database. Nat. Biotechnol. 26, 162-164 (2008).
  6. Ulrich, E. L. BioMagResBank. Nucleic Acids Res. 36, 402-408 (2008).
  7. Wishart, D. S. HMDB: the Human Metabolome Database. Nucleic Acids Res. 35, 521-526 (2007).
  8. Kanehisa, M. KEGG for linking genomes to life and the environment. Nucleic Acids Res. 36, 480-484 (2008).
  9. Karp, P. D. Expansion of the BioCyc collection of pathway/genome databases to 160 genomes. Nucleic Acids Res. 33, 6083-6089 (2005).
  10. Halouska, S. Use of NMR metabolomics to analyze the targets of D-cycloserine in mycobacteria: role of D-alanine racemase. J. Proteome. Res. 6, 4608-4614 (2007).
  11. Boshoff, H. I. The transcriptional responses of Mycobacterium tuberculosis to inhibitors of metabolism: novel insights into drug mechanisms of action. J. Biol. Chem. 279, 40174-40184 (2004).
  12. Mehaffy, C. Descriptive proteomic analysis shows protein variability between closely related clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 10, 1966-1984 (2010).
  13. Schnappinger, D. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment. J. Exp. Med. 198, 693-704 (2003).
  14. Schnappinger, D., Schoolnik, G. K., Ehrt, S. Expression profiling of host pathogen interactions: how Mycobacterium tuberculosis and the macrophage adapt to one another. Microbes. Infect. 8, 1132-1140 (2006).
  15. Shui, W. Quantitative proteomic profiling of host-pathogen interactions: the macrophage response to Mycobacterium tuberculosis lipids. J. Proteome. Res. 8, 282-289 (2009).
  16. Talaat, A. M., Lyons, R., Howard, S. T., Johnston, S. A. The temporal expression profile of Mycobacterium tuberculosis infection in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4602-4607 (2004).
  17. Forgue, P. NMR metabolic profiling of Aspergillus nidulans to monitor drug and protein activity. J. Proteome Res. 5, 1916-1923 (2006).
  18. Goodacre, R., Vaidyanathan, S., Dunn, W. B., Harrigan, G. G., Kell, D. B. Metabolomics by numbers: acquiring and understanding global metabolite data. Trends Biotechnol. 22, 245-252 (2004).
  19. Shin, J. H. NMR-based Metabolomic Profiling in Mice Infected with Mycobacterium tuberculosis. J. Proteome Res. 10, 2238-2247 (2011).
  20. Jaki, B. U., Franzblau, S. G., Cho, S. H., Pauli, G. F. Development of an extraction method for mycobacterial metabolome analysis. J. Pharm. Biomed. Anal. 41, 196-200 (2006).
  21. de Carvalho, L. P. Metabolomics of Mycobacterium tuberculosis reveals compartmentalized co-catabolism of carbon substrates. Chem. Biol. 17, 1122-1131 (2010).
  22. de Carvalho, L. P. Activity-based metabolomic profiling of enzymatic function: identification of Rv1248c as a mycobacterial 2-hydroxy-3-oxoadipate synthase. Chem. Biol. 17, 323-332 (2010).
  23. Marrero, J., Rhee, K. Y., Schnappinger, D., Pethe, K., Ehrt, S. Gluconeogenic carbon flow of tricarboxylic acid cycle intermediates is critical for Mycobacterium tuberculosis to establish and maintain infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9819-9824 (2010).
  24. Tang, Y. J. Central metabolism in Mycobacterium smegmatis during the transition from O2-rich to O2-poor conditions as studied by isotopomer-assisted metabolite analysis. Biotechnol. Lett. 31, 1233-1240 (2009).
  25. Kweon, O. A polyomic approach to elucidate the fluoranthene-degradative pathway in Mycobacterium vanbaalenii PYR-1. J. Bacteriol. 189, 4635-4647 (2007).
  26. Hasan, M. R., Rahman, M., Jaques, S., Purwantini, E., Daniels, L. Glucose 6-phosphate accumulation in mycobacteria: implications for a novel F420-dependent anti-oxidant defense system. J. Biol. Chem. 285, 19135-19144 (2010).
  27. Soga, T. Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry. J. Proteome Res. 2, 488-494 (2003).
  28. Metz, T. O. The future of liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) in metabolic profiling and metabolomic studies for biomarker discovery. Biomark Med. 1, 159-185 (2007).
  29. Ludwig, C., Viant, M. R. Two-dimensional J-resolved NMR spectroscopy: review of a key methodology in the metabolomics toolbox. Phytochem. Anal. 21, 22-32 (2010).
  30. Simpson, R. J. Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual. Inglis, J. , Cold Spring Laboratory Press. 425-595 (2003).
  31. Beste, D. J., McFadden, J. System-level strategies for studying the metabolism of Mycobacterium tuberculosis. Mol. Biosyst. 6, 2363-2372 (2010).
  32. Rhee, K. Y. Central carbon metabolism in Mycobacterium tuberculosis: an unexpected frontier. Trends Microbiol. , (2011).
  33. Who. Health Organization. Anti-tuberculosis Drug Resistance in the World: Report No. 4. , (2008).
  34. Jassal, M., Bishai, W. R. Extensively drug-resistant tuberculosis. Lancet Infect Dis. 9, 19-30 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

NMR MetabolomicsCell Extract PreparationBiosafety Level 3Mechanical LysisLyophilizationDeuterated Buffer1H NMR2H 13C NMRSpectral Analysis

Powiązane artykuły