Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przygotowanie próbek ekstraktów z Mycobacterium tuberculosis do metabolomicznych badań metodą rezonansu magnetycznego jądra

14.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3673

⸱

3 września 2012

 ,  ,  ,  , 
1School of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, University of Nebraska-Lincoln, 2Department of Chemistry, University of Nebraska-Lincoln

W tym artykule

Podsumowanie

Profil metabolomiczny Mycobacterium tuberculosis jest określany po hodowli w pożywkach płynnych. Warunki mogą być modyfikowane w celu zbadania wpływu suplementów odżywczych, utleniaczy oraz leków przeciwgruźliczych na profil metaboliczny tego mikroorganizmu. Procedura przygotowania ekstraktu jest odpowiednia zarówno dla analiz NMR 1D 1H, jak i 2D 1H-13C.

Streszczenie

Mycobacterium tuberculosis jest główną przyczyną śmiertelności ludzi w skali globalnej. Pojawienie się szczepów wielolekoopornych (MDR) oraz ekstremalnie lekoopornych (XDR) grozi zahamowaniem obecnych wysiłków w zakresie kontroli tej choroby. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania leków i szczepionek, które byłyby bardziej skuteczne niż te obecnie dostępne. Genom M. tuberculosis jest znany od ponad 10 lat, jednak wciąż istnieją istotne luki w naszej wiedzy na temat funkcji i niezbędności genów. W wielu badaniach wykorzystano analizę ekspresji genów na poziomie transkrypcyjnym i proteomicznym, aby określić wpływ leków, utleniaczy i warunków wzrostu na globalne wzorce ekspresji genów. Ostatecznie końcowa odpowiedź na te zmiany odzwierciedlona jest w składzie metabolicznym bakterii, obejmującym kilka tysięcy związków o niskiej masie cząsteczkowej. Porównanie profili metabolicznych szczepów typu dzikiego i mutantów, nieleczonych lub leczonych konkretnym lekiem, może skutecznie umożliwić identyfikację celu i doprowadzić do opracowania nowych inhibitorów o działaniu przeciwgruźliczym. Podobnie można oceniać wpływ dwóch lub więcej warunków na metabolom. Magnetyczny rezonans jądrowy (NMR) jest potężną technologią wykorzystywaną do identyfikacji i ilościowego określania produktów pośrednich metabolizmu. W niniejszym protokole opisano procedury przygotowania ekstraktów komórkowych M. tuberculosis do analizy metabolomicznej metodą NMR. Hodowle komórkowe są prowadzone w odpowiednich warunkach i wymagają izolacji na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 3 (Biosafety Level 3),1 zbierane, a następnie poddawane lizie mechanicznej w niskich temperaturach w celu maksymalnego zachowania metabolitów. Lizaty komórkowe są odzyskiwane, filtrowane w celu sterylizacji i przechowywane w ultra-niskich temperaturach. Alikwoty z tych ekstraktów komórkowych są wysiewane na agar Middlebrooka 7H9 w celu oznaczenia jednostek tworzących kolonie, aby zweryfikować brak żywych komórek. Po dwóch miesiącach inkubacji w 37 °C, jeśli nie zaobserwowano żywych kolonii, próbki są wywożone z zaplecza izolacyjnego do dalszego przetwarzania. Ekstrakty są liofilizowane, resuspenderowane w buforze deuterowanym i wstrzykiwane do urządzenia NMR, co pozwala na zarejestrowanie danych spektroskopowych, które następnie poddawane są analizie statystycznej. Opisane procedury mogą być stosowane zarówno dla jednowymiarowych (1D) analiz 1H NMR, jak i dwuwymiarowych (2D) analiz 1H-13C NMR. Metodyka ta zapewnia bardziej niezawodną identyfikację metabolitów o niskiej masie cząsteczkowej oraz bardziej wiarygodne i czułe analizy ilościowe składu metabolicznego ekstraktów komórkowych niż metody chromatograficzne. Wariacje opisanej procedury następujące po etapie lizy komórek mogą zostać również dostosowane do równoległej analizy proteomicznej.

Protokół

1. Tekst protokołu

Niniejszy protokół przedstawia adaptację metodologii NMR do badania M. tuberculosis (patogen klasy III). W związku z tym, podczas prowadzenia badań nad M. tuberculosis w laboratorium z aktualnym certyfikatem, należy przestrzegać zasad poziomu bezpieczeństwa biologicznego 3 (BSL3). Najważniejszym zagrożeniem dla personelu pracującego z tymi mikroorganizmami jest ekspozycja na aerozole generowane w laboratorium. Poniższe procedury są stosowane w naszej instytucji i mogą ulegać zmianom w zależności od zaleceń Instytucjonalnego Komitetu Bezpieczeństwa Biologicznego. Standardowy sprzęt ochrony osobistej obejmuje kombinezon Tyvek, czepka, ochraniacze na obuwie, respirator N95, ochronę oczu, ocieplacze na ręce oraz dwie pary rękawiczek nitrylowych. Prace obejmujące hodowle M. tuberculosis oraz/lub manipulacje z otwartymi pojemnikami zawierającymi M. tuberculosis są wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego typu A2 lub B2. Na powierzchni roboczej umieszcza się papier chłonny pokryty folią plastikową. Wszystkie materiały i zapasy przeznaczone do utylizacji lub usunięcia z placówki muszą zostać umieszczone w dwóch workach na odpady biologiczne i zdekontaminowane w autoklawie. Powierzchnie robocze oraz urządzenia wykorzystywane w komorze (homogenizator do lizy FastPrep-24, spektrofotometr, wiadro z lodem itp.) muszą być dezynfekowane po każdej sesji pracy 1% roztworem Amphyl (środek przeciwprątkowy, bakteriobójczy, grzybobójczy i wirusobójczy). Hodowle M. tuberculosis muszą być umieszczone w podwójnym zabezpieczeniu podczas transportu do większych urządzeń znajdujących się poza komorą bezpieczeństwa biologicznego, takich jak zamrażarki, inkubatory, wirówki i lodówki. Wirowanie przeprowadza się przy użyciu zamkniętych kubków bezpieczeństwa i probówek z nakrętką z uszczelką O-ring. W celu dalszej analizy poza laboratorium BSL3, ekstrakty bezkomórkowe są filtrowane przez filtr 0,2 μm lub mikroorganizmy są uśmiercane termicznie w temperaturze 95 °C przez 15 min.2 Próbki są wysiewane na podłoża w celu weryfikacji braku jednostek tworzących kolonie przed usunięciem ich z obszaru zabezpieczonego.

  1. Przenieś 110 ml kompletnej pożywki Middlebrook 7H9 zawierającej polisorbat 80 (Tween 80 w celu zapobiegania agregacji) (MADC-TW) lub odpowiedniej pożywki do kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml. W przypadku użycia metabolitów 13C rutynowo hoduje się kultury w trzech powtórzeniach na każdą warunkę, natomiast dla profilowania 1D 1H NMR hoduje się dziesięć identycznych kultur. Dla dwóch warunków (np. z dodatkiem leku i bez niego) można wyhodować podwójną objętość kultury na powtórzenie, a następnie podzielić ją na dwie identyczne kultury. Wszystkie przepisy na odczynniki i roztwory znajdują się na końcu protokołu.
  2. Zaszczep pożywkę 0,150 ml zapasu M. tuberculosis w 50% glicerolu (po rozmrożeniu na lodzie). Patrz uwaga 1 poniżej.
  3. Pozostaw kulturę do wzrostu w temperaturze 37 °C przy wstrząsaniu z prędkością 100 rpm przez około 6 dni (OD600 0,6-0,8). Patrz uwaga 2 poniżej.
  4. Jeśli nie są wymagane antybiotyki, alternatywne dodatki lub inne zabiegi, kultury są gotowe do zbioru. W przypadku stosowania zabiegów przejdź bezpośrednio do kroku 5. Pobierz próbkę 0,5 ml z każdej kolby, przenieś do probówki do mikrocentryfugi i przechowuj w temperaturze 4 °C w celu miareczkowania kultury i kontroli jakości: testów na kontaminację, analizy fenotypowej oraz testów PCR. Patrz uwaga 3 poniżej. W tym momencie przejdź do kroku 6.
  5. Wyjmij kolby z wytrząsarki i przeprowadź pożądany zabieg (np. dodaj lek lub metabolit). Włóż kolby z powrotem do wytrząsarki i inkubuj przez dodatkowy czas (np. 6-18 h). Po tym czasie pobierz kolejną alikwot 1,0 ml i wyznacz OD600. Pobierz próbkę 0,5 ml z każdej kolby, przenieś do probówki do mikrocentryfugi i przechowuj w temperaturze 4 °C w celu miareczkowania kultury i kontroli jakości.
  6. Umieść kultury na lodzie na 5 min. Po tym kroku komórki należy pozostawić na lodzie przez cały pozostały czas trwania protokołu. Zbierz kultury poprzez wirowanie w centryfudze stołowej w probówkach 50 ml przy 2 000 x g i 4 °C przez 15 min. Każda kultura będzie wymagała czterech probówek po 25 ml każda (łącznie wymagane jest 100 ml w celu uzyskania odpowiedniego stosunku sygnału do szumu dla eksperymentów 2D 1H-13C NMR; dla eksperymentów 1D 1H NMR wymagane jest tylko 50 ml na kulturę).
  7. Przemyj każdy pellet komórkowy dwa razy lodowatą wodą ddH2O (około 15 ml za pierwszym razem i 10 ml za drugim) zgodnie z parametrami wirowania opisanymi powyżej. Podczas drugiego przemywania połącz alikwoty po 10 ml w jednej probówce przed wirowaniem. Resuspender pellet komórkowy w końcowej objętości 1,0 ml ddH2O (należy dostosować objętość do wielkości pelletu). Jeśli na tym etapie pożądana jest pojedyncza zawiesina komórkowa bez agregatów, komórki można krótko poddać sonikacji i/lub trzechkrotnie przepuścić przez igłę 27G. Alternatywnie pellet komórkowy można zamrozić w temperaturze -80 °C i przechowywać do dalszej obróbki. W tym drugim przypadku zamrożone pellety rozmraża się na lodzie przed resuspensją. Resuspender pellety komórkowe w końcowej objętości 1,0 ml ddH2O, jak wspomniano powyżej.
  8. Przenieś 1,0 ml zawiesiny komórkowej do probówki z nakrętką o pojemności 2,0 ml zawierającej Lysing Matrix B (kuleczki krzemionkowe 0,1 mm). Umieść homogenizator FastPrep-24 w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Włóż próbki do uchwytu, zabezpieczając płytkę z prętami blokującymi na górze probówki. Przetwarzaj próbki w homogenizatorze przez 60 s przy ustawieniu prędkości 6 metrów/s.
  9. Wiruj próbki w mikrocentryfudze przy 15 000 x g i 4 °C przez 10 min, aby odwirować szczątki komórkowe i nienaruszone komórki.
  10. Usuń supernatant i przefiltruj próbkę przez filtr strzykawkowy (0,2 μm) do sterylnej probówki. Wysiej 0,1 ml próbki (lub reprezentatywną frakcję próbki, np. 10%) na agar MADC, aby zweryfikować brak żywych komórek. Badacze mogą również przeprowadzić więcej niż jeden etap filtracji i/lub zweryfikować obecność żywych komórek w ekstraktach za pomocą procedur barwienia żywe/martwe, aby zapobiec lub zidentyfikować potencjalne zagrożenia dla bezpieczeństwa biologicznego. Zamroź próbki w kąpieli z etanolu i suchego lodu, aby przechowywać je w temperaturze -80 °C do czasu liofilizacji i analizy w pracowni NMR.
  11. Po 2 miesiącach sprawdź płytki, aby zweryfikować brak jednostek tworzących kolonie (CFU). Jeśli nie znaleziono CFU, próbki mogą zostać wyniesione z laboratorium BSL3. Dalsza analiza jest przeprowadzana w standardowej pracowni NMR, która zazwyczaj obsługuje wielu użytkowników i nie działa pod specyficznymi wymaganiami dotyczącymi izolacji.
  12. Liofilizuj próbki do całkowitego wysuszenia, następnie resuspender w 0,7 ml buforu do NMR i przenieś do probówki do mikrocentryfugi. Wiruj przez 3 min przy 13 000 x g. Usuń 0,6 ml i przenieś do probówki NMR 5 mm. Alternatywnie liofilizowane próbki można wysłać do zewnętrznego laboratorium jako zwykłe próbki niezagrażające biologicznie.
  13. Dane NMR są zbierane natychmiast. Mimo wszelkich środków ostrożności, w próbce mogą nadal występować aktywne enzymy, przez co zazwyczaj nie jest ona stabilna przez długi czas. Zmiany w widmie NMR są zauważalne, gdy próbki pozostają w temperaturze pokojowej lub w 4 °C przez ponad 1 tydzień. Ponadto zbieranie danych NMR jest przeplatane między kulturami niepoddanymi działaniu leku a kulturami traktowanymi lekiem, gdzie próbki z każdej kategorii są wybierane losowo. Zapobiega to niepotrzebnemu błędowi systematycznemu, który mógłby wynikać z dłuższego czasu oczekiwania na pomiar dla konkretnej kategorii. Błąd w danych wystąpiłby, gdyby widma NMR dla wszystkich próbek nietraktowanych zebrać najpierw, a dopiero potem dla próbek traktowanych lekiem. Jeśli analiza NMR nie może zostać przeprowadzona natychmiast, próbki należy przechowywać w probówkach Eppendorf 1 ml w temperaturze -80 °C.
  14. Po wprowadzeniu próbek do automatycznego podawacza próbek BACS-120 wymagana jest kalibracja instrumentu, obejmująca kilka rutynowych kroków, takich jak lock, shim, tune i optymalizacja długości impulsu 90°, aby zmaksymalizować jakość wyników. Pojedyncza próbka służy do kalibracji długości impulsu 90° i strojenia instrumentu dla pozostałych próbek. Blokowanie (locking), shimming i zbieranie danych NMR dla każdej próbki odbywa się automatycznie przy użyciu ICONNMR i gradshim.
  15. Widmo 1D 1H NMR jest zbierane przy użyciu sekwencji impulsów zgesgp Bruker z tłumieniem sygnału wody metodą excitation sculpting. Wykorzystuje się łącznie 32k punktów danych przy szerokości zakresu 5482,5 Hz, 128 skanach i 16 skanach pomiarowych (dummy scans). Widmo 2D 1H-13C HSQC jest zbierane przy użyciu sekwencji impulsów hsqcetgp Bruker. Zebrano łącznie 2048 punktów danych przy szerokości zakresu 5000,0 Hz w bezpośrednim wymiarze 1H oraz 64 punkty danych przy szerokości zakresu 18864,9 Hz w pośrednim wymiarze 13C. Widmo jest zbierane przy 128 skanach i 16 skanach pomiarowych w celu uzyskania dobrego stosunku sygnału do szumu.

Schemat procesu hodowli M. Tuberculosis; obejmuje etapy przygotowania próbek do spektroskopii NMR.
Rycina 1. Przedstawiono schemat blokowy procedur eksperymentalnych.

Bufor do NMR

Roztwór stokowy 50 mM buforu fosforanowego potasu z 50 μM TMSP:

  • 2,17 g K2HPO4 (fosforan dwuzasadowy potasu)
  • 1,70 g KH2PO4 (fosforan jednozasadowy potasu)
  • 7,86 mg sodu 3-trimetylosililopropionianu (TMSP-2,2,3,3-D4 (D,98%) )
  • Rozpuścić w 500 ml „100%” D2O
  • Końcowy roztwór powinien mieć pH 7,2 (niekorygowane)

MADC-TW lub MOADC-TW (1 L)

  • 4,7 g bazy pożywki Middlebrook 7H9
  • 900 ml ddH2O
  • 2 ml glicerolu
  • Wymieszać składniki i autoklawować przez 25 min. Schłodzić ciecz do temperatury pokojowej i dodać następujące roztwory:
  • 100 ml ADC podczas przygotowywania MADC lub 100 ml OADC podczas przygotowywania MOADC
  • 2,5 ml 20% Tween 80 (alternatywnie 1 ml niemetabolizowalnego 20% Tyloxapolu)
  • 10 ml 1% cykloheksymidu

ADC (1 L)

  • 20 g D(+)-glukozy
  • 50 g BSA Fraction V
  • 8,5 g NaCl
  • 800 ml ddH2O
  • Rozpuścić razem, uzupełnić objętość do 1 L i wysterylizować za pomocą filtra 0,2 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C.

Alternatywnie, aby przygotować OADC (1L), należy dodać wszystkie wymienione powyżej składniki oraz 50 ml 1% kwasu oleinowego (poniższa receptura pozwala na przygotowanie partii 250 ml). Rozpuścić wszystko razem, doprowadzić objętość do 1 L i wysterylizować za pomocą filtra 0,2 μm. Butelkę należy owinąć folią aluminiową i przechowywać w temperaturze 4 °C.

  • 2,5 g kwasu oleinowego
  • 250 ml 0,2M NaOH
  • Rozmrozić kwas oleinowy (tężeje podczas chłodzenia), podgrzewając go w temperaturze 55 °C przez 10 min, następnie dodać do roztworu NaOH i podgrzewać z mieszaniem przez 60 min. Przechowywać w sterylnych szklanych butelkach owiniętych folią aluminiową. Butelki uszczelnić parafilmem i przechowywać w temperaturze 4 °C.

W razie preferencji można zakupić komercyjne pożywki BD BBL Middlebrook ADC lub OADC z dodatkiem katalazy.

1% cykloheksymidu (100ml)

  • 1 g cykloheksymidu
  • 100 ml ddH2O

Rozpuścić i wysterylizować za pomocą filtra 0,2 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C. Uwaga: cykloheksymida jest toksyczna, dlatego należy z nią obchodzić się z najwyższą ostrożnością.

20% (v/v) Tween 80 (100ml)

  • 20 ml Tween 80
  • 80 ml ddH2O

Alternatywnie, odważ 20 g Tween 80 (około 18,9 ml; gęstość 1,06 g/ml), aby przygotować 20% w/v roztwór. Podgrzewaj roztwór w temperaturze 55 °C przez 30 min do czasu rozpuszczenia, a następnie wymieszaj całkowicie. Sterylizuj ciecz za pomocą filtra 0,2 μm. Przechowuj gotowy roztwór w temperaturze pokojowej.

20% (v/v) Tyloxapol (100ml)

  • 20 ml Tyloxapolu
  • 80 ml ddH2O

Alternatywnie, odważ 20 g Tyloxapolu (około 18,2 ml; gęstość 1,1 g/ml), aby przygotować 20% w/v roztwór. Podgrzewaj roztwór w temperaturze 55 °C przez 30 min do czasu rozpuszczenia, a następnie wymieszaj całkowicie. Sterylizuj ciecz za pomocą filtra 0,2 μm. Przechowuj gotowy roztwór w temperaturze pokojowej.

Uwaga 1: Zapasy glicerolowe M. tuberculosis są przygotowywane zgodnie z poniższym protokołem.

Przygotowanie zapasów M. tuberculosis

  • Hodować M. tuberculosis w 50 ml pożywki MADC do momentu nasycenia (OD600 = 1,5 do 2,0) w temperaturze 37 °C w warunkach wytrząsania (100 rpm). W zależności od szczepu potrwa to od 7 do 14 dni.
  • Wirować próbki z prędkością 2 000 x g w temperaturze 4 °C przez 15 min w celut utworzenia osadu z kultury. Usunąć nadsącz.
  • Resuspendować w 6 ml sterylnego 50% glicerolu.
  • Rozdzielić po 1,5 ml do 4 krioprobówek Corning i odpowiednio je oznakować.
  • Natychmiast zamrozić probówki w kąpieli z etanolu i suchego lodu, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C.

Uwaga 2: Inokulacja szczepu H37Rv (zamrożony w -80 °C zapas do 1,5 roku) do 70 ml pożywki MADC daje wartość OD600 wynoszącą około 0,6 po 5 dniach wzrostu w temperaturze 37 °C w warunkach wytrząsania (100 rpm) w inkubatorze wytrząsającym Innova 40.

Uwaga 3: Aby przetestować kontaminację hodowli, badacze mogą zaszczepić alikwot hodowli na standardowe pożywkę bogatą i zweryfikować brak wzrostu po inkubacji przez noc. Rutynowo hodowle wysiewa się na agar MADC w celu obserwacji morfologii kolonii i badania za pomocą mikroskopii fazowo-kontrastowej. W razie potrzeby hodowle można zweryfikować za pomocą PCR z użyciem starterów IS6110 zgodnie z opisem.3

2. Reprezentatywne wyniki

Odpowiednio przygotowana próbka pozwoli uzyskać widmo NMR podobne do przedstawionego na Rysunku 2. Widmo to stanowi reprezentację puli metabolicznej typu dzikiego M. tuberculosis. Zidentyfikowane metabolity są bezpośrednio lub pośrednio powiązane ze szlakiem D-alaniny. Ponadto wielkość intensywności pików jest proporcjonalna do stężeń metabolitów obecnych w ekstrakcie komórkowym. Zatem zmiany intensywności pików pomiędzy kulturami nieleczonymi, leczzeniem lekami a szczepami mutantami mogą wskazywać na zaburzenia w obrębie metabolitów i szlaków metabolicznych. Widma 1D 1H NMR M. tuberculosis zarejestrowano za pomocą spektrometru Bruker Avance 500 MHz wyposażonego w kriosondę z gradientem w osi Z i potrójnym rezonansem. Widmo zawiera ok. 400 pików, z których możliwe było zidentyfikowanie i ilościowe oznaczenie 40–50 metabolitów, w tym aminokwasów, prekursorów nukleotydów oraz produktów pośrednich glikolizy i cyklu kwasu cytrynowego. Do automatyzacji gromadzenia danych NMR wykorzystano zmieniacz próbek BACS-120 z oprogramowaniem Bruker Icon. Widma 1D 1H NMR zarejestrowano z zastosowaniem techniki excitation sculpting4, aby efektywnie usunąć sygnał rozpuszczalnika i utrzymać płaską linię bazową, eliminując potrzebę korekcji linii bazowej, która mogłaby wprowadzić artefakty do późniejszej analizy głównych składowych (PCA) lub ortogonalnej analizy dyskryminacyjnej cząstkowych najmniejszych kwadratów (OPLS-DA). Widmo 1D 1H NMR rejestrowano w temperaturze 25 °C przy szerokości widma 5482,5 Hz i 32K punktach danych. Do uzyskania widma zastosowano łącznie 16 skanów pozornych (dummy scans) oraz 128 skanów. Oprogramowanie ACD Labs 1D NMR processor wykorzystano do półautomatycznego przetwarzania wszystkich widm 1D 1H NMR. Widma poddano transformacji Fouriera, korekcji fazy i odniesiono do piku TMSP (0,0 ppm). Pakiet oprogramowania NMRpipe wykorzystano do indywidualnego przetwarzania widm 2D 1H-13C NMR, które przeanalizowano za pomocą NMRDraw. Plik danych FID z aparatury Bruker przekonwertowano najpierw na format rozpoznawany przez NMRpipe, a następnie widmo poddano transformacji Fouriera, korekcji fazy i dopełnieniu zerami. Obserwowane piki NMR w widmie 1D 1H NMR i widmie 2D 1H-13C NMR przypisano do konkretnych metabolitów, stosując tolerancję przesunięcia chemicznego 1H i 13C wynoszącą odpowiednio 0,05 i 0,50 ppm, korzystając z bazy danych Madison Metabolomics Consortium Database (MMCD),5 BioMagResBank6 oraz Human Metabolome Database.7 W szczególności w widmach 1D i 2D NMR ręcznie wyznaczono piki, a następnie listę przesunięć chemicznych NMR przesłano do bazy Human Metabolome Database. Metabolity zidentyfikowane przez Human Metabolome Database przypisano do widma NMR w oparciu o maksymalizację liczby pasujących rezonansów NMR oraz przynależność do sieci metabolicznej. Każdy związek lub metabolit posiada zazwyczaj wiele par C-H i odpowiednio wiele rezonansów NMR. Zatem im więcej tych rezonansów NMR zaobserwujemy w eksperymentalnym widmie NMR, tym większe prawdopodobieństwo obecności danego metabolitu. Podobnie, zidentyfikowanie wielu metabolitów powiązanych z tym samym szlakiem zwiększa prawdopodobieństwo prawidłowego przypisania. Obecność metabolitów i szlaków metabolicznych zweryfikowano w bazach danych Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)8 oraz MetaCyc.9 Mycobacterium smegmatis jest użytecznym systemem modelowym dla M. tuberculosis i innych patogenów mykobakteryjnych. Jak opisano w innej publikacji, próbki M. smegmatis można było również rozbić poprzez sonikację.10

Diagram widma NMR, analiza przesunięcia chemicznego, piki AMP, Glu, octanu, profilowanie metaboliczne.
Rycina 2. Widmo 1D 1H NMR ekstraktu komórkowego Mycobacterium tuberculosis. Oznakowano piki NMR odpowiadające reprezentatywnym metabolitom. Skróty oznaczają: AMP – monofosforan adenozyny; α-Kg – α-ketoglutaran; Glu – glutaminian oraz Ala – alanina.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Znaczna liczba badań przeanalizowała profile transkrypcyjne i proteomiczne M. tuberculosis w różnych warunkach in vitro oraz in vivo.11-16 W rezultacie zmiany w ekspresji genów i aktywności enzymów prowadzą do wahań stężeń cząsteczek o niskiej masie cząsteczkowej. Pełny opis tych związków stanowi metabolom. Zatem wpływ leków i zróżnicowanych warunków wzrostu na szlaki metaboliczne można śledzić za pomocą analizy metabolomicznej.17,18 Nieliczne badania wykorzystały tę metod...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować wszystkim członkom laboratoriów dr. Barletty i dr. Powers za pomocne uwagi podczas opracowywania protokołu. Dziękujemy Wendy Austin za pomocne dyskusje i korektę rękopisu. Praca opisana w niniejszym manuskrypcie była finansowana z pilotażowych grantów zasiewowych przyznanych każdemu z wymienionych powyżej badaczy przez University of Nebraska-Lincoln Redox Biology Center (grant nadrzędny #NCRR 2P20RR 017675, D. Becker, P.I.). Ponadto dziękujemy dr Ofelii Chacon za zapewnienie środków z jej grantu R21 (1R21AI087561-01A1) na materiały badawcze oraz częściowe dofinansowanie wynagrodzenia pana Halouski w celu standaryzacji technik NMR zawartych w niniejszej publikacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Suplement ADCBD BBL Middlebrook212352
Próbnik BACS-120Bruker
Spektrometr NMR Bruker AvanceBruker500 MHz
Seryjna albumina wołowaFisher ScientificBP1600-100Frakcja V
WirówkaBeckman CoulterAllegra X-15RNastolna
Probówki do wirowaniaCorning43029150 ml, sterylne, polipropylenowe
Probówki kriogeniczneCorning4304882,0 ml, sterylne, polipropylenowe
CykloheksymidaA.G. ScientificC-1189Toksyczna
D(+) - GlukozaACROS41095-0010
Tlenek deuteruSigma Aldrich617385
Kolba ErlenmeyeraVWR89095-266Sterylna, płaskie dno, poliwęglanowa, korek z membraną PTFE 0,22 μm
Kolba do szybkiego mrożeniaVWR82018-226750 ml
LiofilizatorVWR82019-0384,5 L, nastolny
GlicerolGibcoBRL15514-029
InkubatorNew BrunswickInnova 40Mieszadło nastolne
Matryca do lizy BMP Biomedicals6911-100
Urządzenie do lizyMP BiomedicalsFastPrep-24
MikrowirówkaEppendorf5415DNastolna
MikrowirówkaBeckman CoulterMicrofuge 22RNastolna
Pożywka Middlebrook 7H9Difco271310
Probówki NMRNorellST500-75mM
Suplement OADCBD BBL Middlebrook212351
Kwas oleinowySigmaO1008
Fosforan dwuzasadowy potasuVWRBDH0266
Fosforan jednozasadowy potasuVWRBDH0268
Rotor - Microfuge 22RBeckman CoulterF241.5PSzczelny, polipropylenowy
Rotor - Allegra X-15RBeckman CoulterSX4750Z certyfikowanymi osłonami biologicznymi
Chlorek soduFisher ScientificS271-3
Sód-3-trimetylosililopropionian-2,2,3,3-D4Cambridge IsotopeDLM-48
SpektrofotometrBeckman CoulterDU-530
Kuwety spektrofotometryczneLifeLINELS-24101,5 ml, polistyrenowe, 2 przezroczyste ścianki
StrzykawkaBecton Dickinson309585Sterylna, 3 ml Luer-Lok
Filtr strzykawkowyNalgene190-25200,2 μm, sterylny octan celulozy
Tween 80Fisher ScientificBP338-500

Bibliografia

  1. Larsen, M. H., Biermann, K., Tandberg, S., Hsu, T., Jacobs, W. R. Genetic Manipulation of Mycobacterium tuberculosis. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 2(2007).
  2. Larsen, M. H., Biermann, K., Jacobs, W. R. Laboratory Maintenance of Mycobacterium tuberculosis. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 1(2007).
  3. Clarridge, J. E. 3rd, Shawar, R. M., Shinnick, T. M., Plikaytis, B. B. Large-scale use of polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in a routine mycobacteriology laboratory. J. Clin. Microbiol. 31, 2049-2056 (1993).
  4. Nguyen, B. D., Meng, X., Donovan, K. J., Shaka, A. J. SOGGY: solvent-optimized double gradient spectroscopy for water suppression. A comparison with some existing techniques. J. Magn. Reson. 184, 263-274 (2007).
  5. Cui, Q. Metabolite identification via the Madison Metabolomics Consortium Database. Nat. Biotechnol. 26, 162-164 (2008).
  6. Ulrich, E. L. BioMagResBank. Nucleic Acids Res. 36, 402-408 (2008).
  7. Wishart, D. S. HMDB: the Human Metabolome Database. Nucleic Acids Res. 35, 521-526 (2007).
  8. Kanehisa, M. KEGG for linking genomes to life and the environment. Nucleic Acids Res. 36, 480-484 (2008).
  9. Karp, P. D. Expansion of the BioCyc collection of pathway/genome databases to 160 genomes. Nucleic Acids Res. 33, 6083-6089 (2005).
  10. Halouska, S. Use of NMR metabolomics to analyze the targets of D-cycloserine in mycobacteria: role of D-alanine racemase. J. Proteome. Res. 6, 4608-4614 (2007).
  11. Boshoff, H. I. The transcriptional responses of Mycobacterium tuberculosis to inhibitors of metabolism: novel insights into drug mechanisms of action. J. Biol. Chem. 279, 40174-40184 (2004).
  12. Mehaffy, C. Descriptive proteomic analysis shows protein variability between closely related clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 10, 1966-1984 (2010).
  13. Schnappinger, D. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment. J. Exp. Med. 198, 693-704 (2003).
  14. Schnappinger, D., Schoolnik, G. K., Ehrt, S. Expression profiling of host pathogen interactions: how Mycobacterium tuberculosis and the macrophage adapt to one another. Microbes. Infect. 8, 1132-1140 (2006).
  15. Shui, W. Quantitative proteomic profiling of host-pathogen interactions: the macrophage response to Mycobacterium tuberculosis lipids. J. Proteome. Res. 8, 282-289 (2009).
  16. Talaat, A. M., Lyons, R., Howard, S. T., Johnston, S. A. The temporal expression profile of Mycobacterium tuberculosis infection in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4602-4607 (2004).
  17. Forgue, P. NMR metabolic profiling of Aspergillus nidulans to monitor drug and protein activity. J. Proteome Res. 5, 1916-1923 (2006).
  18. Goodacre, R., Vaidyanathan, S., Dunn, W. B., Harrigan, G. G., Kell, D. B. Metabolomics by numbers: acquiring and understanding global metabolite data. Trends Biotechnol. 22, 245-252 (2004).
  19. Shin, J. H. NMR-based Metabolomic Profiling in Mice Infected with Mycobacterium tuberculosis. J. Proteome Res. 10, 2238-2247 (2011).
  20. Jaki, B. U., Franzblau, S. G., Cho, S. H., Pauli, G. F. Development of an extraction method for mycobacterial metabolome analysis. J. Pharm. Biomed. Anal. 41, 196-200 (2006).
  21. de Carvalho, L. P. Metabolomics of Mycobacterium tuberculosis reveals compartmentalized co-catabolism of carbon substrates. Chem. Biol. 17, 1122-1131 (2010).
  22. de Carvalho, L. P. Activity-based metabolomic profiling of enzymatic function: identification of Rv1248c as a mycobacterial 2-hydroxy-3-oxoadipate synthase. Chem. Biol. 17, 323-332 (2010).
  23. Marrero, J., Rhee, K. Y., Schnappinger, D., Pethe, K., Ehrt, S. Gluconeogenic carbon flow of tricarboxylic acid cycle intermediates is critical for Mycobacterium tuberculosis to establish and maintain infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9819-9824 (2010).
  24. Tang, Y. J. Central metabolism in Mycobacterium smegmatis during the transition from O2-rich to O2-poor conditions as studied by isotopomer-assisted metabolite analysis. Biotechnol. Lett. 31, 1233-1240 (2009).
  25. Kweon, O. A polyomic approach to elucidate the fluoranthene-degradative pathway in Mycobacterium vanbaalenii PYR-1. J. Bacteriol. 189, 4635-4647 (2007).
  26. Hasan, M. R., Rahman, M., Jaques, S., Purwantini, E., Daniels, L. Glucose 6-phosphate accumulation in mycobacteria: implications for a novel F420-dependent anti-oxidant defense system. J. Biol. Chem. 285, 19135-19144 (2010).
  27. Soga, T. Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry. J. Proteome Res. 2, 488-494 (2003).
  28. Metz, T. O. The future of liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) in metabolic profiling and metabolomic studies for biomarker discovery. Biomark Med. 1, 159-185 (2007).
  29. Ludwig, C., Viant, M. R. Two-dimensional J-resolved NMR spectroscopy: review of a key methodology in the metabolomics toolbox. Phytochem. Anal. 21, 22-32 (2010).
  30. Simpson, R. J. Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual. Inglis, J. , Cold Spring Laboratory Press. 425-595 (2003).
  31. Beste, D. J., McFadden, J. System-level strategies for studying the metabolism of Mycobacterium tuberculosis. Mol. Biosyst. 6, 2363-2372 (2010).
  32. Rhee, K. Y. Central carbon metabolism in Mycobacterium tuberculosis: an unexpected frontier. Trends Microbiol. , (2011).
  33. Who. Health Organization. Anti-tuberculosis Drug Resistance in the World: Report No. 4. , (2008).
  34. Jassal, M., Bishai, W. R. Extensively drug-resistant tuberculosis. Lancet Infect Dis. 9, 19-30 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Metabolomika NMRprzygotowanie ekstraktu komórkowegopoziom bezpieczeństwa biologicznego 3liza mechanicznaliofilizacjabufor deuterowany1H NMR2H-13C NMRanaliza widmowa
Przygotowanie próbek ekstraktów z Mycobacterium tuberculosis do metabolomicznych badań metodą rezonansu magnetycznego jądra
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.