Badanie stanu zapalnego jelit w modelu IBD indukowanym przez DSS

Podsumowanie

Modele eksperymentalne nieswoistych zapaleń jelit pozwoliły nam zbadać złożone odpowiedzi odpornościowe wrodzone i nabyte związane z patogenezą. Wykorzystując ocenę histologiczną, ilościowe oznaczenie cytokin prozapalnych oraz aktywność mieloperoksydazy, można rozpocząć ocenę tych odpowiedzi obserwowanych w nieswoistych zapaleniach jelit.

Streszczenie

niespecyficzne zapalne choroby jelit (IBD) obejmują szereg patologii jelitowych, z których najczęstszymi są wrzodziejące zapalenie jelita grubego (UC) oraz choroba Crohna (CD). Zarówno UC, jak i CD, w przypadku wystąpienia w jelicie grubym, generują podobny profil objawów, który może obejmować biegunkę, krwawienia z odbytu, ból brzucha oraz utratę masy ciała.¹ Chociaż patogeneza IBD pozostaje nieznana, opisuje się ją jako chorobę wieloczynnikową, w której zaangażowane są komponenty zarówno genetyczne, jak i środowiskowe.²

Istnieje wiele zróżnicowanych modeli zwierzęcych zapalenia jelita grubego, które odzwierciedlają kilka cech nieswoistych zapaleń jelit (IBD). Modele zwierzęce zapalenia jelita grubego obejmują zarówno te, w których proces ten rozwija się samoistnie u podatnych szczepów niektórych gatunków, jak i modele wymagające podania określonych stężeń substancji chemicznych indukujących zapalenie, takich jak dekstran siarczan sodu (DSS). Chemicznie indukowane modele zapalenia jelit są najczęściej stosowanymi i najlepiej opisanymi modelami IBD. Podawanie DSS w wodzie pitnej wywołuje ostre lub przewlekłe zapalenie jelita grubego, w zależności od zastosowanego protokołu podania.³ Zwierzęta otrzymujące DSS wykazują utratę masy ciała oraz objawy luźnych stolców lub biegunki, niekiedy z oznakami krwawienia z odbytu.^4,5 W niniejszej pracy opisujemy metody, za pomocą których można scharakteryzować rozwój zapalenia jelita grubego oraz wynikającą z niego odpowiedź zapalną po podaniu DSS. Metody te obejmują analizę histologiczną przekrojów jelita grubego barwionych hematoksyliną i eozyną, pomiar cytokin prozapalnych oraz oznaczenie aktywności mieloperoksydazy (MPO), która może służyć jako marker zastępczy stanu zapalnego.⁶

Zakres odpowiedzi zapalnej w stanie chorobowym można ocenić na podstawie obecności objawów klinicznych lub zmian w histologii tkanki śluzowej. Uszkodzenia histologiczne okrężnicy ocenia się za pomocą systemu punktacji uwzględniającego utratę architektury krypt, naciek komórek zapalnych, pogrubienie mięśni, ubytek komórek kubkowych oraz ropnie krypt.⁷ Ilościowo poziomy cytokin prozapalnych o właściwościach ostrego stanu zapalnego, takich jak interleukina (IL)-1β, IL-6 i czynnik martwicy nowotworu (TNF)-α, można oznaczyć za pomocą konwencjonalnych metod ELISA. Ponadto aktywność MPO można zmierzyć za pomocą testu kolorymetrycznego i wykorzystać jako wskaźnik zapalenia.⁸

W eksperymentalnym zapaleniu jelita grubego ciężkość choroby często koreluje ze wzrostem aktywności MPO oraz wyższym poziomem cytokin prozapalnych. Ciężkość zapalenia oraz uszkodzenia związane z procesami zapalnymi można ocenić poprzez badanie konsystencji i krwistości kału, a także poprzez ocenę stanu histopatologicznego jelita z wykorzystaniem przekrojów tkanki okładnicowej barwionych hematoksyliną i eozyną. Fragmenty tkanki okładnicowej mogą posłużyć do oznaczenia aktywności MPO oraz produkcji cytokin. Wspólnie miary te mogą być wykorzystane do oceny odpowiedzi zapalnej jelit w zwierzęcych modelach eksperymentalnego zapalenia jelita grubego.

Protokół

1. Myszowy model ostrego zapalenia jelita grubego indukowanego DSS

1. Dodać dekstran siarczan sodu (DSS) do autoklawowanej wody pitnej do pożądanej stężenia końcowego (1-5%) (mas/obj) (np. aby przygotować 5% roztwór DSS, należy dodać 25 g proszku DSS do 500 mL autoklawowanej wody). Roztwór zapasowy można przechowywać w temperaturze pokojowej do jednego tygodnia lub w 4°C do czasu użycia.
2. W komorze z laminarnym przepływem powietrza przelać roztwór zapasowy DSS do probówek Falcon o pojemności 50 mL (jedna probówka na każdą klatkę). Roztwór zapasowy należy zachować do uzupełniania probówek w razie potrzeby.
3. Zastąpić wodę pitną w każdej klatce....

Dyskusja

Zapalenie jelita grubego indukowane DSS jest powszechnie stosowanym chemicznym modelem zapalenia jelit. W tym modelu myszy otrzymują wodę pitną z dodatkiem DSS, który uznaje się za toksyczny dla komórek nabłonka jelitowego, co prowadzi do zaburzenia integralności bariery śluzówkowej.¹⁰ Podanie DSS wywołuje ostre zapalenie jelita grubego, które charakteryzuje się luźnymi stolcami, krwawieniem z odbytu oraz naciekiem granulocytów.¹⁰ Podczas podawania DSS zapalenie jelita grubego zwykle wiąże się ze zn.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
probówka do mikrowirówki Eppendorf Safe-Lock (2 ml)	Eppendorf	0030 120.094
Czytnik płytek absorbancji Biotek EL808	BioTek	EL808
Siarczan dekstranu, sól sodowa, stopień czystości odczynnikowej (masa cząsteczkowa 36 000–50 000 Da)	MP Biomedicals	160110
Gen5 (oprogramowanie)	BioTek	Wersja 1.10.8
Bromek heksadecylotrimetyluamoniu (HTAB)	Sigma-Aldrich	H5882-100G
Nadtlenek wodoru, 30% roztwór wodny (masowy)	Sigma-Aldrich	216763	Przechowywać w temperaturze 2-8°C°C
Płytka mikrotestowa 96-dołkowa z płaskim dnem	Sarstedt Ltd	82.1581	Tylko do jednorazowego użytku
o-dianizydyna	Sigma-Aldrich	D-3252	Wrażliwe na światło. Przechowywać w temperaturze 2-8°C.°C
Fosforan potasu dwuzasadowy	Caledon	6620-1
Fosforan potasu, jednowodny	EMD Millipore	PX1565-1
Koktajl inhibitorów proteaz	Sigma-Aldrich	P8340	Przechowywać w temperaturze -20°C°C
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Kule z węglika wolframu do Tissue Lyser II	Qiagen	69997