Wyznaczenie optymalnej aktywności cytotoksycznej ludzkich limfocytów T CD8 specyficznych dla Her2neu poprzez porównanie testu uwalniania Cr51 z systemem xCELLigence

Podsumowanie

Test uwalniania chromu, powszechnie stosowana metoda wykrywania aktywności cytotoksycznych limfocytów T, posiada kilka ograniczeń. W niniejszym artykule, wykorzystując antygenowo specyficzne limfocyty T CD8 oraz linię komórkową raka piersi u ludzi SKBR3, zbadano podejście oparte na impedancji pod kątem zdolności do wykrywania śmierci komórek.

Streszczenie

Cytotoksyczne limfocyty T CD8 stanowią podgrupę limfocytów T zdolnych do indukowania śmierci zakażonych lub nowotworowych komórek gospodarza¹. Komórki te wykazują ekspresję wyspecjalizowanego receptora, zwanego receptorem limfocytów T (TCR), który potrafi rozpoznać specyficzny peptyd antygenowy związany z cząsteczkami HLA klasy I². Rozpoznanie zakażonych komórek lub komórek nowotworowych poprzez ich cząsteczkę HLA klasy I prowadzi do produkcji cząsteczek litycznych, takich jak granzymy i perforyna, co skutkuje śmiercią komórki docelowej. Choć określanie częstości występowania antygenowo swoistych limfocytów T CD8 za pomocą takich testów jak ELIspot czy cytometria przepływowa jest przydatne, pomocne jest również ustalenie siły odpowiedzi limfocytów T CD8 przy użyciu testów cytotoksyczności³. Najbardziej znanym testem do oceny funkcji cytotoksycznej jest test uwalniania chromu (Chromium Release Assay, CRA), który uznaje się za metodę standardową ⁴. CRA posiada szereg ograniczeń, w tym narażenie komórek na promieniowanie gamma, brak powtarzalności oraz wymóg zastosowania dużej liczby komórek. W ciągu ostatniej dekady pojawiło się zainteresowanie przyjęciem nowych strategii w celu przezwyciężenia tych ograniczeń. Nowsze podejścia obejmują metody mierzące uwalnianie kaspaz ⁴, aktywność esterazy BLT ⁵ oraz ekspresję powierzchniową CD107 ⁶. W niniejszej pracy zbadano test oparty na impedancji, z wykorzystaniem systemu Roche xCelligence, pod kątem jego potencjału jako alternatywy dla CRA. Impedancja, czyli opór przeciwko prądowi elektrycznemu, występuje, gdy adherentne komórki nowotworowe wiążą się z płytkami elektrod. Komórki nowotworowe odrywają się po zostaniu zabite, co prowadzi do zmniejszenia impedancji elektrycznej, co może być mierzone przez system xCelligence. Możliwość adaptacji podejścia opartego na impedancji do oceny zabijania zapośredniczonego przez komórki opiera się na obserwacji, że limfocyty T nie przylegają ściśle do większości powierzchni i nie wydają się mieć dużego wpływu na impedancję, co niweluje obawy dotyczące bezpośredniego zakłócania pomiaru przez limfocyty T. Wyniki pokazują, że test oparty na impedancji może wykrywać zmiany w poziomach antygenowo swoistych cytotoksycznych limfocytów T CD8 z większą czułością w porównaniu ze standardowym CRA. Na podstawie tych wyników podejścia oparte na impedancji mogą być dobrymi alternatywami dla CRA lub innych metod mających na celu pomiar funkcjonalności cytotoksycznych limfocytów T CD8.

Protokół

1. Generowanie krótkotrwałych ludzkich linii limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu⁷

1. Wyizoluj mononuklearne komórki krwi obwodowej (PBMCs) z krwi zdrowych dawców dodatnich pod kątem HLA-A2, wykorzystując Ficoll-paque plus.
2. Przenieś PBMCs do płytek 6-dołkowych w objętości 2 ml/dołek, przy zagęszczeniu 2 x 10⁶ komórek/ml.
3. Dodaj bezpośrednio do dołków peptyd HER-2/neu p369-377 wiążący się z HLA-A2 (sekwencja aminokwasowa KIFGSLAFL) lub peptyd grypy p58-66 wiążący się z HLA-A2 (GILGFVFTL) do końcowego stężenia 10 μg/ml i inkubuj w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO₂.
4. W celu stymulacji i ekspansji limfocytów T dodawaj co 2 dni 250 μl/dołek świeżego medium uzupełnionego ludzką rekombinowaną IL-2 (roztwór stokowy: 50 jednostek/μl), aby uzyskać końcowe stężenie 50 jednostek/ml w medium hodowlanym.
5. Ponownie stymuluj komórki hodowlane za pomocą napromieniowanych autologicznych PBMCs w stężeniu 2 x 10⁶ komórek/ml, które były pulsowane przez 2 godziny peptydami w stężeniu 10 μg/ml (tymi samymi, które zastosowano w kroku 1.3); komórki te dodaj do hodowli w objętości 1 ml/dołek tydzień po pierwszej stymulacji peptydowej.
6. Co 2 dni dodawaj ludzką rekombinowaną IL-2 oraz świeże medium do istniejących hodowli, zgodnie z opisem w kroku 1.4.
7. Ponownie stymuluj komórki peptydem oraz napromieniowanymi autologicznymi PBMCs, zgodnie z opisem w kroku 1.5, tydzień po drugiej stymulacji peptydowej.
8. Przygotuj komórki do użycia najwcześniej sześć dni po ostatniej re-stymulacji.

2. Przygotowanie komórek raka piersi

1. Umieść stację pomiarową impedancji xCelligence (stacja xCelligence) w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO₂.
2. Zbierz ludzkie komórki nowotworowe (SKBR3, BT20, MCF7 lub HCC1419) o 75% konfluencji, używając 0,25% trypsyny oraz wirowania (1 000 rpm przez 5 minut).
3. Policz komórki nowotworowe za pomocą komory countingowej (hemocytometru) i resuspenduj je w pożywce RPMI dla komórek nowotworowych (uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 500 jednostek/ml IFN-gamma) do stężenia 7,5 x 10³ komórek nowotworowych/100 μl.
4. Skonfiguruj oprogramowanie xCelligence, ustawiając stronę układu (layout), aby określić rozmieszczenie studzienek, oraz stronę harmonogramu (schedule), aby pomiary impedancji były wykonywane co 5 minut przez okres 40 godzin. Przez pierwsze 18 godzin system xCelligence będzie pomiarowi impedancji wyłącznie komórek nowotworowych.
5. Dodaj 100 μl pożywki RPMI dla komórek nowotworowych do płytek E-plates xCelligence i wykonaj pomiar tła, mierząc impedancję w obecności samych płytek, bez komórek.
6. Dodaj komórki nowotworowe do płytek E-plates w objętości 100 μl na studzienkę i umieść je w stacji xCelligence.
7. Naciśnij przycisk start w oprogramowaniu xCelligence, aby rozpocząć pomiary impedancji komórek nowotworowych, które natychmiast zaczynają przytwierdzać się do płytek E-plates.

3. Ko-kultura guza z limfocytami T CD8

1. Gdy komórki nowotworowe przyłączą się i podwoją do liczby 1,5 x 10⁴ komórek nowotworowych na dołek (około 18 godzin po początkowym wysianiu), zebrać limfocyty T przygotowane w sekcji 1 poprzez delikatne skrobanie i mieszanie
2. Wirować przy 1 000 rpm przez 5 minut, policzyć limfocyty T za pomocą hemocytometru i resuspendować je w medium RPMI z 10% FBS w różnych proporcjach, zaczynając od maksymalnego stosunku 1 komórki nowotworowej do 40 limfocytów T, a następnie rozcieńczać 2-krotnie, aż do osiągnięcia stosunku 1 komórki nowotworowej do 1,25 limfocytów T. Na przykład: w dołku znajduje się 1,5 x 10⁴ komórek nowotworowych. Aby uzyskać stosunek 1:40, należy dodać 6 x 10⁵ limfocytów T na dołek i rozcieńczać limfocyty T 2-krotnie, aż do osiągnięcia stosunku 1,5 x 10⁴ komórek nowotworowych do 1,875 x 10⁴ limfocytów T na dołek (stosunek 1:1,25).
3. Wstrzymać pracę stacji xCelligence i wyjąć płytkę E-plate.
4. Usunąć medium z dołków za pomocą pipety i dodać do dołków 200 μl samego medium lub limfocyty T w odpowiedniej proporcji.
5. Umieścić płytkę E-plate z powrotem w stacji xCelligence i wznowić program oprogramowania xCelligence, aby pomiary impedancji były wykonywane co 5 minut przez około 20 godzin po dodaniu limfocytów T.
6. Znormalizować wyniki po zakończeniu analizy.

4. Test uwalniania chromu (CRA)⁷

1. Podczas pracy z ⁵¹Cr oraz komórkami docelowymi znakowanymi ⁵¹Cr należy przestrzegać instytucjonalnych procedur bezpieczeństwa radiologicznego. Zawsze stosować odpowiednie osłony w celu ograniczenia ekspozycji na promieniowanie.
2. Inkubować komórki nowotworowe przez 2 godziny w stężeniu 1 x 10⁶ komórek nowotworowych/ml z dodatkiem 10 μl/ml świeżego ⁵¹Cr (0,005 Ci/ml).
3. Przemyć komórki nowotworowe w 10 ml pożywki RPMI z 10% FBS i odwirować przy 1000 obr./min przez 5 minut. Przenieść komórki nowotworowe do 96-dołkowej płytki o okrągłym dnie w ilości 1 x 10⁵ komórek nowotworowych w 100 μl na dołek.
4. Dodać limfocyty T w różnych stosunkach, zaczynając od 1 komórki nowotworowej na 40 limfocytów T, a następnie rozcieńczać dwukrotnie, aż do uzyskania stosunku 1 komórki nowotworowej do 1,25 limfocytu T. Przykładowo, w każdym dołku znajduje się 1 x 10⁵ komórek nowotworowych. Aby uzyskać stosunek 1:40, należy dodać 4 x 10⁶ limfocytów T na dołek i rozcieńczać limfocyty T dwukrotnie, aż do osiągnięcia stosunku 1 x 10⁵ komórek nowotworowych do 1,25 x 10⁵ limfocytów T na dołek (stosunek 1:1,25).
5. Dodać do płytki kontrole spontanicznego i maksymalnego uwalniania komórek nowotworowych. W celu obliczenia spontanicznego uwalniania ⁵¹Cr z komórek nowotworowych, do sześciu dołków, z których każdy zawiera 1 x 10⁵ komórek nowotworowych w 100 μl, dodać 100 μl pożywki RPMI z 10% FBS. W celu obliczenia maksymalnego uwalniania ⁵¹Cr z komórek nowotworowych, do sześciu dołków, z których każdy zawiera 1 x 10⁵ komórek nowotworowych w 100 μl, dodać 100 μl 0,1% Triton X-100 w PBS, który powoduje lizę wszystkich komórek.
6. Inkubować płytki przez 5 godzin w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂.
7. Po inkubacji pobrać 50 μl supernatantu z każdego dołka i przenieść go na płytkę Luma.
8. Suszyć płytki przez noc, a następnie zmierzyć CPM za pomocą licznika gamma.

5. Obliczanie procentu lizy

1. Pomiar impedancji: Odczytaj wartość impedancji, raportowaną jako indeks komórkowy (CI), w wybranych punktach czasowych i wykorzystaj następujący wzór do określenia procentowej lizy: (CI tylko guz - (CI guz + limfocyty T)) / (CI tylko guz) *100.
2. CRA: Wykorzystaj następujący wzór do określenia procentowej lizy: (CPM eksperymentalny - CPM spontaniczny) / (CPM maksymalny - CPM spontaniczny)*100.

6. Reprezentatywne wyniki

Same komórki T nie zwiększają impedancji

Komórki T, co do zasady, nie przylegają do większości powierzchni stałych i nie wymagają adhezji do aktywacji oraz proliferacji. Sformułowano zatem hipotezę, że komórki T nie powinny wpływać na impedancję w płytkach E-plates systemu xCelligence. Aby to sprawdzić, do dołków wprowadzono albo komórki raka piersi SKBR3, albo świeżo oczyszczone ludzkie komórki T CD8. Impedancję mierzono przez 40 godzin, a reprezentatywny przykład wykazujący znikomy wpływ komórek T przedstawiono na Rysunku 1A. W przeciwieństwie do tego można by argumentować, że komórki T mogą obniżać impedancję tła, choć tylko nieznacznie. Mimo to kokultura wykazała, że proces dodawania komórek T w 18. godzinie po rozpoczęciu pomiarów impedancji spowodował zakłócenie impedancji (Rysunek 1B). Inne badania wykazały, że zakłócenia wynikały częściowo z procedur manipulacyjnych, ponieważ spadek sygnału można było zredukować, zapewniając, że temperatura roztworu zawierającego komórki T była taka sama jak wewnątrz inkubatora.

Obniżenia impedancji pośredniczone przez limfocyty T są zależne od dawki.

Użyteczność analizy opartej na impedancji w porównywaniu próbek pod kątem aktywności cytotoksycznych limfocytów T wymaga możliwości rozróżnienia pomiędzy różnymi stężeniami limfocytów T specyficznych dla antygenu. Aby sprawdzić, czy jest to możliwe, komórki SKBR3 współhodowano z różnymi stężeniami limfocytów T pochodzących z linii limfocytów T specyficznych dla HER-2/neu p369. Jak pokazano na Rysunku 2A, spadki impedancji były zależne od dawki limfocytów T. Rysunek 2B pokazuje, że indeksy komórkowe po 10 godzinach podążają za prostym wielomianem drugiego stopnia w zakresie stężeń limfocytów T. Zatem stacja xCelligence monitoruje w czasie rzeczywistym śmierć guzów SKBR3 pośredniczoną przez limfocyty T CD8 jako spadek indeksu komórkowego.

Test oparty na impedancji wykrywa limfocyty T swoiste dla antygenu

Aby ustalić, czy spadki impedancji linii komórek raka piersi SKBR3, wykazującej pozytywny wynik dla HER-2/neu i HLA-A2, wywołane przez limfocy T specyficzne dla HER-2/neu p369 były specyficzne antygenowo, oddzielne studzienki zawierające SKBR3 inkubowano również z limfocytami T pochodzącymi z linii limfocytów T specyficznych dla wirusa grypy (FLU). Limfocy T specyficzne dla FLU posłużyły jako kontrola niespecyficzna, ponieważ wykazują one pozytywny wynik dla HLA-A2, lecz nie posiadają zdolności rozpoznawania HER-2/neu. Jak pokazano na Ryc. 3, istnieje istotna różnica między aktywnością lityczną limfocytów T specyficznych dla HER-2/neu p369 a limfocytami T specyficznymi dla FLU (p<0,0001). W niektórych przypadkach limfocy T niespecyficzne dla nowotworu (np. specyficzne dla FLU lub stymulowane anty-CD3/anty-CD28) wykazały niski poziom aktywności litycznej (Ryc. 3A-B). Limfocy T mogą zabijać na dwa sposoby: niespecyficznie poprzez oddziaływania Fas:ligand Fas lub specyficznie antygenowo poprzez uwalnianie granzymów i perforyn. Aby dodatkowo potwierdzić tezę, że limfocy T specyficzne dla HER-2/neu zabijają w sposób specyficzny antygenowo, zastosowano przeciwciało blokujące ligand Fas. Jak pokazano na Ryc. 3B, przeciwciało to nie zmniejszyło aktywności litycznej limfocytów T specyficznych dla HER-2/neu p369. Przeciwciało mogło hamować oddziaływania między Fas a ligandem Fas, co wykazano w przypadku limfocytów T aktywowanych niespecyficznie za pomocą kulek anty-CD3/CD28. Wyniki te sugerują, że podczas testowania limfocytów T specyficznych dla nowotworu w zestawieniu z limfocytami T niespecyficznymi dla nowotworu, blokada ligandu Fas może być konieczna, aby zminimalizować oddziaływania niepośredniczone przez TCR. Alternatywnie, przy użyciu krótkotrwale hodowanych linii limfocytów T, w których tylko frakcja komórek jest specyficzna dla antygenu użytego do generacji ex vivo, może dojść do aktywacji limfocytów T w wyniku niedopasowania MHC, co prowadzi do lizy niespecyficznej. W takim przypadku uzasadnione może być dodanie przeciwciał blokujących nieistotne cząsteczki HLA. Aby ustalić, czy limfocy T specyficzne dla p369 zabijają komórki nowotworowe w sposób zależny od klasy I MHC, do kokultur dodano przeciwciało anty-HLA klasy I lub przeciwciało kontrolne izotypowe. Jak pokazano na Ryc. 3C, liza przez limfocy T specyficzne dla p369 została zahamowana po dodaniu przeciwciała, co wykazuje restrykcję do HLA klasy I. Na koniec, ponieważ opracowanie tego testu przeprowadzono głównie z użyciem SKBR3, istotne było sprawdzenie, czy inne przylegające komórki nowotworowe wykazujące ekspresję HLA-A2 i HER-2/neu mogą być zabijane przez limfocy T specyficzne dla p369. W związku z tym przygotowano limfocy T i dodano je w stosunku 1:5 do komórek nowotworowych wykazujących ekspresję HLA-A2 i HER-2/neu: SKBR3, MCF-7 oraz HCC1419. Linia komórek nowotworowych BT20, negatywna pod kątem HLA-A2, posłużyła jako kontrola negatywna. Jak pokazano na Ryc. 3D, wszystkie te dodatkowe komórki nowotworowe, z wyjątkiem BT20, zostały również zabite, co oceniono za pomocą impedancji. Zatem metoda ta wydaje się być użyteczna dla wielu rodzajów przylegających komórek nowotworowych.

Test oparty na impedancji jest bardziej czuły niż standardowy test uwalniania chromu w wykrywaniu aktywności cytotoksycznych limfocytów T

Test uwalniania chromu (⁵¹Cr) (CRA), służący do pomiaru aktywności cytolitycznej, od dawna stanowi złoty standard monitorowania odpowiedzi limfocytów T CD8. W tym teście komórki docelowe (np. komórki nowotworowe) są znakowane ⁵¹Cr. W większości przypadków zdrowe komórki docelowe są w stanie zatrzymać większość radioznacznika w trakcie trwania testu. Do komórek docelowych dodaje się limfocyty T CD8, zazwyczaj w różnych stężeniach, a śmierć komórek docelowych jest wykrywana poprzez uwalnianie ⁵¹Cr do medium. Poza faktem wykorzystania niebezpiecznego promieniowania, dwoma głównymi problemami testu CRA są brak czułości oraz fakt, że test ten zazwyczaj wymaga dużych ilości limfocytów T CD8, co ogranicza jego użyteczność. Aby sprawdzić, czy test oparty na impedancji był czulszy niż CRA, in vitro wygenerowano limfocyty T specyficzne dla HER-2/neu p369 i naniesiono je, w różnych ilościach, albo na płytki E-plates zawierające nieznakowane komórki nowotworowe, albo na standardowe płytki polipropylenowe zawierające komórki docelowe znakowane ⁵¹Cr. Pomiary, albo impedancji, albo wolnego chromu, przeprowadzono 5 godzin po dodaniu limfocytów T. Rysunek 4, będący reprezentatywnym przykładem, pokazuje, że test impedancji daje lepsze wyniki niż test uwalniania chromu.

Zmienność wewnątrzseryjną testu opartego na impedancji zazwyczaj nie przekracza 20%.

Zbadano zmienność wewnątrzanalizową, ponieważ szersze zastosowanie tego testu będzie w dużej mierze zależało od jego powtarzalności i zmienności (Rysunek 5). Dwie linie limfocytów T specyficzne dla p369 wygenerowano niezależnie w odstępie 30 dni i dodano w trzech powtórzeniach w zakresie różnych stosunków komórek nowotworowych do limfocytów T. Wykres wstawiony w Rysunku 5 pokazuje, że linie te były w dużej mierze równoważne pod względem lizy komórek SKBR3. Dla każdego stosunku komórek obliczono i przedstawiono procentowy współczynnik zmienności. Jak pokazano na Rysunku 5, dla stosunków od 1:40 do 1:5 procentowe współczynniki zmienności (CV) wynosiły poniżej 15%. Jednakże przy stosunkach 1:2,5 i 1:1,25 wartości CV były wysokie lub nieprzewidywalne. Ze względu na znaczną zmienność biologiczną nie jest możliwe zmierzenie zmienności międzyanalizowej z użyciem pierwotnych linii limfocytów T.

Rysunek 1. Impedancja musi zostać znormalizowana po dodaniu limfocytów T. Panel A: pokazuje, że za impedancję odpowiadają komórki nowotworowe (linia czerwona), a nie limfocyty T (linia niebieska). Przedstawiono zapisy impedancji w ciągu 40 godzin dla samych komórek nowotworowych lub samych limfocytów T. Podobne wyniki uzyskano w drugim eksperymencie. Należy zauważyć, że zaburzenie sygnału w około 20 godzinie reprezentuje moment dodania limfocytów T do studzienek niezawierających komórek nowotworowych. Panel B: pokazuje, że pomiary impedancji są przejściowo zakłócone po dodaniu limfocytów T do komórek nowotworowych. Wymaga to normalizacji w określonym punkcie czasowym po dodaniu limfocytów T (patrz punkt normalizacji zaznaczony na wykresie). Krzywe zostały opracowane z podwójnych punktów danych. Krzywa dla samych komórek nowotworowych jest zaznaczona na czerwono. Pozostałe krzywe reprezentują komórki nowotworowe w kołturze z limfocytami T specyficznymi dla HER-2/neu p369 (Niebieska: stosunek 1,25 limfocytów T/komórkę nowotworową, Zielona: stosunek 40 limfocytów T/komórkę nowotworową). Każda krzywa została obliczona z podwójnych punktów danych zbieranych co 5 minut przez cały czas trwania hodowli. Wyniki są reprezentatywne dla 3 oddzielnych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek.

Rysunek 2. Redukcja impedancji pośredniczona przez limfocyty T jest zależna od dawki. Panel A: Przedstawiono przebiegi impedancji komórek nowotworowych SKBR3 inkubowanych osobno lub z różnymi stężeniami specyficznych dla nowotworu limfocytów T. Każdy przebieg został obliczony z potrójnych punktów danych zbieranych co 5 minut przez cały czas trwania hodowli. Wyniki są reprezentatywne dla 3 oddzielnych eksperymentów. Panel B: Przedstawiono indeksy komórkowe po 10 godzinach dla wszystkich stężeń limfocytów T/komórek nowotworowych. Linia przerywana reprezentuje indeks komórkowy dla samych komórek nowotworowych. Każdy symbol oznacza średnią (±s.e.m.) z pomiarów wykonanych w trzech powtórzeniach. Wyniki są reprezentatywne dla 3 oddzielnych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek.

Rysunek 3. Test oparty na impedancji wykrywa odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T specyficznych dla antygenu. Panel A przedstawia poziom lizy komórek SKBR3 przez limfocyty T specyficzne dla HER-2/neu p369 (czerwony) lub limfocyty T specyficzne dla FLU (niebieski) w 5., 10. i 15. godzinie po rozpoczęciu kokultury. Każdy punkt danych stanowi średnią (±s.e.m.) z pomiarów wykonanych w trzech powtórzeniach. Wyniki są reprezentatywne dla 3 oddzielnych eksperymentów. Panel B przedstawia lizę SKBR3 przez limfocyty T specyficzne dla p369 lub niespecyficznie aktywowane limfocyty T, co wykazuje, że specyficzna dla antygenu liza nie wynika z oddziaływań Fas-ligand Fas. Czarne słupki reprezentują kokultury zawierające przeciwciało przeciwko ligandowi Fas. Każdy słupek to średnia (±s.e.m.) lizy w trzech powtórzeniach w 5. godzinie po dodaniu limfocytów T. Wyniki są reprezentatywne dla 3 oddzielnych eksperymentów. Panel C pokazuje, że liza SKBR3 przez limfocyty T specyficzne dla p369 10 godzin po dodaniu limfocytów T jest zależna od cząsteczek HLA klasy I. Podczas kokultury dodano albo blokery HLA klasy I, albo kontrolę izotypową. Każdy słupek to średnia (±s.e.m.) lizy w trzech powtórzeniach. Eksperyment ten powtórzono dwukrotnie, uzyskując podobne wyniki. Panel D przedstawia % lizy 10 godzin po dodaniu limfocytów T kilku linii komórkowych nowotworu wykazujących ekspresję HER-2/neu i będących HLA-A2+ przez limfocyty T specyficzne dla p369. BT20, linia komórkowa raka piersi ujemna pod kątem HLA-A2, została użyta jako kontrola negatywna. Każda kropka reprezentuje oddzielny eksperyment obliczony na podstawie trzech oznaczeń. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Rycina 4. Test oparty na impedancji jest bardziej czuły niż test uwalniania chromu w detekcji limfocytów T specyficznych dla antygenu nowotworowego. Przedstawiono % lizy komórek SKBR3 w odpowiedzi na zmienne stężenia limfocytów T specyficznych dla p369, zmierzony 5 godzin po zmieszaniu komórek nowotworowych i limfocytów T przy użyciu zarówno testu opartego na impedancji, jak i testu uwalniania chromu. Każdy symbol oznacza średnią (±s.e.m) z trzech powtórzeń. Wyniki są reprezentatywne dla 3 oddzielnych eksperymentów.

Rycina 5. Procentowe współczynniki zmienności wewnątrz serii (% CV) testu cytotoksyczności limfocytów T opartego na impedancji. Przedstawiono średnie (±SD) % współczynników zmienności wewnątrz serii dla lizy komórek SKBR3 w zakresie różnych stężeń antygenowo-specyficznych limfocytów T. Każdy symbol reprezentuje średnią z trzech powtórzeń. Liczby naniesione na wykres to średnie wartości % CV. Panel wstawkowy przedstawia średnią (±s.e.m, n=3) % lizy komórek SKBR3 przy różnych stężeniach limfocytów T specyficznych dla p369-377. Przedstawiono dwie niezależnie wygenerowane linie limfocytów T specyficznych dla p369, uzyskane z limfocytów T od dwóch osobnych dawców.

Dyskusja

Limfocyty T CD8 są istotne dla adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej, ponieważ potrafią bezpośrednio niszczyć zakażone lub nowotworowe komórki⁴. Choć istnieje kilka metod pomiaru liczby antygenowo swoistych limfocytów T CD8 (np. ELIspot, tetramery, cytometria przepływowa), często pomocne jest ustalenie, czy komórki te są funkcjonalnie cytotoksyczne³. Najbardziej rozpoznawalnym testem do oceny funkcji cytotoksycznej jest CRA, który uznaje się za metodę referencyjną (gold standard)⁴. Głównymi ograniczeniami CRA są: (1) konieczność użycia substancji promieniotwórczych, (2) brak czułości, (3) brak informacji mechanistycznych, (4) zapotrzebowanie na dużą liczbę komórek oraz (5) pracochłonne przygotowanie. Dlatego w ciągu ostatniej dekady pojawiło się zainteresowanie wdrożeniem nowych strategii w celu zminimalizowania tych ograniczeń. Nowsze podejścia obejmują metody mierzące uwalnianie kaspazy⁴, aktywność esterazy BLT5 oraz ekspresję powierzchniową CD107⁶. Niniejszy artykuł sugeruje, że test oparty na impedancji, przeprowadzany w systemie Roche xCelligence, może być również przydatny jako alternatywa dla CRA. Możliwość zastosowania podejścia opartego na impedancji wynika z obserwacji, że limfocyty T, które nie przylegają ściśle do powierzchni, nie wydają się mieć dużego wpływu na impedancję, co eliminuje obawy dotyczące bezpośredniego zakłócania pomiaru przez limfocyty T. Przewiduje się, że nakład pracy wymagany przy użyciu systemu pomiaru impedancji będzie znacznie mniejszy, przede wszystkim ze względu na wyeliminowanie kwestii regulacyjnych związanych z użyciem radioaktywności. Jedyną istotną wadą systemu opartego na impedancji jest konieczność poniesienia wydatku rzędu 50 000 do 60 000 USD na zakup urządzenia xCelligence. Jednak urządzenie xCelligence eliminuje potrzebę posiadania licznika promieniowania i jest znacznie bardziej wszechstronne, gdyż jest użyteczne do oceny odpowiedzi komórkowej na leki i migracji, oprócz badania cytotoksyczności limfocytów T ⁸.

Obserwacje wskazujące na to, że spadek impedancji komórek nowotworowych jest zależny od dawki, co przedstawiono na Rysunku 2, przy stosunkowo stromym nachyleniu zgodnym z prostą wtórną funkcją kwadratową, sugerują, że test ten mógłby zostać wykorzystany w testach rozcieńczeń ograniczających (LDAs) do szacowania częstotliwości występowania komórek cytotoksycznych⁹. Jedną z zalet podejścia opartego na impedancji jest fakt, że wymagana liczba limfocytów T i komórek nowotworowych jest mniejsza niż w przypadku CRA, co potencjalnie zwiększa wykonalność LDA. Na przykład w CRA, przy stosunku 1:40, w każdej studzience wysiewa się 1 x 10⁵ komórek nowotworowych, co wymaga 4 x 10⁶ całkowitej liczby limfocytów T na studzinkę. Natomiast w teście opartym na impedancji potrzebnych jest tylko 1,5 x 10⁴ komórek nowotworowych na studzinkę, co zużywa jedynie 6 x 10⁵ całkowitej liczby limfocytów T na studzinkę. Zatem test oparty na impedancji wykorzystuje o 85% mniej limfocytów T i komórek nowotworowych. Ta redukcja sugeruje, że system oparty na impedancji mógłby zostać przystosowany do monitorowania immunologicznego w badaniach klinicznych u ludzi, gdzie objętość pobranej krwi może być ograniczona. Ponadto, podczas gdy CRA ogranicza się do jednego punktu czasowego, test oparty na impedancji gromadzi ciągłe dane w czasie rzeczywistym, co pozwala użytkownikowi porównać wiele punktów czasowych lizy w tym samym eksperymencie przy minimalnym dodatkowym nakładzie pracy i komórek. Obliczenia częstotliwości mogłyby zostać potencjalnie połączone z innymi strategiami, które nie mierzą funkcji, takimi jak analizy tetramerów, aby ustalić stosunek funkcjonalnych cytotoksycznych limfocytów T do całkowitej liczby antygenowo swoistych limfocytów T CD8¹⁰. Jedną z najatrakcyjniejszych cech podejścia opartego na impedancji jest to, że w przeciwieństwie do większości innych testów, cytotoksyczność może być monitorowana w czasie rzeczywistym, co potencjalnie ułatwia badanie interakcji komórkowych z użyciem inhibitorów lub przeciwciał. Kolejną zaletą jest to, że metoda ta może być odpowiednia dla komórek nowotworowych opornych na znakowanie. Wreszcie, ponieważ niezabite komórki nowotworowe nie są znakowane i pozostają sterylne, możliwe jest ich dalszey odzyskanie i badanie komórek opornych na działanie limfocytów T.

Podsumowując, choć oba systemy dostarczają danych o niszczeniu nowotworu w odpowiedzi na specyficzne limfocyty T, test oparty na impedancji jest czulszy niż metoda CRA i stanowi bardziej elastyczną platformę.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-03	Stosowane do izolacji PBMC z krwi
RPMI 1640	Cellgro	10-040-CV	Pożywki do hodowli komórkowych
FBS (płodowa surowica bydlęca)	Denville Scientific	FB5001-H	Pożywki do hodowli komórkowej
ludzka IL-2	eBioscience	14-8029-81	Do stymulacji wzrostu limfocytów T
Ludzki interferon gamma	Nauki o komórce	CR2026	W celu stymulacji ekspresji MHC w komórkach nowotworowych
peptyd HER-2/neu p369-377	Jednostka syntezy peptydów Mayo Clinic	sekwencja aminokwasowa KIFGSLAFL	Wiąże się z HLA-A2
Peptyd p58-66 wirusa grypy	Jednostka syntezy peptydów Mayo Clinic	sekwencja aminokwasowa GILGFVFTL	Wiąże się z HLA-A2
Kuleczki Dynabeads anty-CD3/CD28 dla ludzi	Invitrogen	111-61D	Do nieswoistej aktywacji i ekspansji limfocytów T
Chrom 51	MP Biomedicals	62015	odczyn do znakowania CRA
E-plate	Grupa Roche	05469830001	Dla jednostki impedancyjnej xCelligence
Płytka Luma 96-dołkowa	PerkinElmer, Inc.	6005630	Do pomiaru promieniotwórczości w urządzeniu Top Count NXT.
stacja xCelligence RTCA DP	Roche Applied Science	RTCA DP	Jednostka impedancji
Top Count NXT	PerkinElmer, Inc.	C990601	Scyntylacja &licznik luminescencyjny
przeciwciało przeciwko ligandowi Fas	BD Biosciences	556372	W celu zablokowania oddziaływań Fas–ligand Fas
przeciwciało HLA-A2 BB7.2	BD Biosciences	551230	Do blokowania cząsteczek HLA klasy I
mysi IgG2b, κ	BD Biosciences	555740	Kontrola izotypowa dla HLA klasy I
linia nowotworowa SKBR3	ATCC	HTB-30	Gruczolakowrak
linia nowotworowa MCF7	ATCC	HTB-22	Gruczolakorak
linia nowotworowa HCC1419	ATCC	CRL-2326	Pierwotny rak przewodowy
linia nowotworowa BT20	ATCC	HTB-19	Raknaworek