Test uwalniania chromu, powszechnie stosowana metoda wykrywania aktywności cytotoksycznych limfocytów T, posiada kilka ograniczeń. W niniejszym artykule, wykorzystując antygenowo specyficzne limfocyty T CD8 oraz linię komórkową raka piersi u ludzi SKBR3, zbadano podejście oparte na impedancji pod kątem zdolności do wykrywania śmierci komórek.
Artykuł metodologiczny
Wyznaczenie optymalnej aktywności cytotoksycznej ludzkich limfocytów T CD8 specyficznych dla Her2neu poprzez porównanie testu uwalniania Cr51 z systemem xCELLigence
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Cytotoksyczne limfocyty T CD8 stanowią podgrupę limfocytów T zdolnych do indukowania śmierci zakażonych lub nowotworowych komórek gospodarza1. Komórki te wykazują ekspresję wyspecjalizowanego receptora, zwanego receptorem limfocytów T (TCR), który potrafi rozpoznać specyficzny peptyd antygenowy związany z cząsteczkami HLA klasy I2. Rozpoznanie zakażonych komórek lub komórek nowotworowych poprzez ich cząsteczkę HLA klasy I prowadzi do produkcji cząsteczek litycznych, takich jak granzymy i perforyna, co skutkuje śmiercią komórki docelowej. Choć określanie częstości występowania antygenowo swoistych limfocytów T CD8 za pomocą takich testów jak ELIspot czy cytometria przepływowa jest przydatne, pomocne jest również ustalenie siły odpowiedzi limfocytów T CD8 przy użyciu testów cytotoksyczności3. Najbardziej znanym testem do oceny funkcji cytotoksycznej jest test uwalniania chromu (Chromium Release Assay, CRA), który uznaje się za metodę standardową 4. CRA posiada szereg ograniczeń, w tym narażenie komórek na promieniowanie gamma, brak powtarzalności oraz wymóg zastosowania dużej liczby komórek. W ciągu ostatniej dekady pojawiło się zainteresowanie przyjęciem nowych strategii w celu przezwyciężenia tych ograniczeń. Nowsze podejścia obejmują metody mierzące uwalnianie kaspaz 4, aktywność esterazy BLT 5 oraz ekspresję powierzchniową CD107 6. W niniejszej pracy zbadano test oparty na impedancji, z wykorzystaniem systemu Roche xCelligence, pod kątem jego potencjału jako alternatywy dla CRA. Impedancja, czyli opór przeciwko prądowi elektrycznemu, występuje, gdy adherentne komórki nowotworowe wiążą się z płytkami elektrod. Komórki nowotworowe odrywają się po zostaniu zabite, co prowadzi do zmniejszenia impedancji elektrycznej, co może być mierzone przez system xCelligence. Możliwość adaptacji podejścia opartego na impedancji do oceny zabijania zapośredniczonego przez komórki opiera się na obserwacji, że limfocyty T nie przylegają ściśle do większości powierzchni i nie wydają się mieć dużego wpływu na impedancję, co niweluje obawy dotyczące bezpośredniego zakłócania pomiaru przez limfocyty T. Wyniki pokazują, że test oparty na impedancji może wykrywać zmiany w poziomach antygenowo swoistych cytotoksycznych limfocytów T CD8 z większą czułością w porównaniu ze standardowym CRA. Na podstawie tych wyników podejścia oparte na impedancji mogą być dobrymi alternatywami dla CRA lub innych metod mających na celu pomiar funkcjonalności cytotoksycznych limfocytów T CD8.
Protokół
1. Generowanie krótkoterminowych linii ludzkich limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu7
- Wyizolować mononuklearne komórki krwi obwodowej (PBMC) z krwi zdrowych dawców dodatnich pod kątem HLA-A2 przy użyciu Ficoll-paque plus.
- Przenieść do płytek 6-dołkowych PBMC w objętości 2 ml/dołek w stężeniu 2 x 106 komórek/ml.
- Dodać bezpośrednio do dołków wiążący się z HLA-A2 peptyd HER-2/neu p369-377 (sekwencja aminokwasowa KIFGSLAFL) lub wiążący się z HLA-A2 peptyd grypy p58-66 (GILGFVFTL) do końcowego stężenia 10 μg/ml i inkubować w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2.
- W celu stymulacji i ekspansji limfocytów T dodawać co 2 dni 250 μl/dołek świeżej pożywki uzupełnionej rekombinowaną ludzką IL-2 (stok: 50 units/μl), aby uzyskać końcowe stężenie 50 units/ml w pożywce hodowlanej.
- Przeprowadzić ponowną stymulację komórek hodowlanych za pomocą naświetlonych autologicznych PBMC w stężeniu 2 x 106 komórek/ml, które były pulsowane przez 2 godziny 10 μg/ml tych samych peptydów użytych w kroku 1.3; komórki te dodać do hodowli w objętości 1 ml/dołek tydzień po pierwszej stymulacji peptydowej.
- Co 2 dni dodawać do istniejących hodowli rekombinowaną ludzką IL-2 oraz świeżą pożywkę, zgodnie z opisem w kroku 1.4.
- Przeprowadzić ponowną stymulację komórek peptydem i naświetlonymi autologicznymi PBMC zgodnie z opisem w kroku 1.5, tydzień po drugiej stymulacji peptydowej.
- Komórki przygotować do użycia najwcześniej sześć dni po ostatniej ponownej stymulacji.
2. Przygotowanie komórek raka piersi
- Umieść stację pomiarową impedancji xCelligence (stacja xCelligence) w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2.
- Zbierz ludzkie komórki nowotworowe (SKBR3, BT20, MCF7 lub HCC1419) o 75% konfluencji, używając 0,25% trypsyny oraz wirowania (1 000 rpm przez 5 minut).
- Policz komórki nowotworowe za pomocą komory licznej i resuspenduj je w pożywce RPMI dla komórek nowotworowych (uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 500 jednostek/ml IFN-gamma) do stężenia 7,5 x 103 komórek nowotworowych/100 μl.
- Skonfiguruj oprogramowanie xCelligence, ustawiając stronę układu (layout page) w celu zdefiniowania układu studzienek oraz stronę harmonogramu (schedule page) w celu wykonywania pomiarów impedancji co 5 minut przez okres 40 godzin. Przez pierwsze 18 godzin system xCelligence będzie mierzył impedancję wyłącznie komórek nowotworowych.
- Dodaj 100 μl pożywki RPMI do płytek E-plate xCelligence i wykonaj pomiar tła, mierząc impedancję w obecności samych treści bez komórek.
- Dodaj komórki nowotworowe do płytek E-plate w ilości 100 μl na studzienkę i umieść je w stacji xCelligence.
- Naciśnij przycisk start w oprogramowaniu xCelligence, aby rozpocząć pomiary impedancji komórek nowotworowych, które natychmiast zaczynają przytwierdzać się do płytek E-plate.
3. Kokultura guza z komórkami T CD8
- Gdy komórki nowotworowe przyłączą się i podzielą do liczby 1.5 x 104 komórek nowotworowych na studzienkę (około 18 godzin po pierwotnym wysianiu), zebrać limfocyty T przygotowane w Sekcji 1 poprzez delikatne skrobanie i mieszanie
- Odwirować przy 1 000 rpm przez 5 minut, policzyć limfocyty T za pomocą hemocytometru i resuspenderować je w medium RPMI z 10% FBS w różnych proporcjach, zaczynając od maksymalnego stosunku 1 komórki nowotworowej do 40 limfocytów T, a następnie rozcieńczać 2-krotnie aż do osiągnięcia stosunku 1 komórki nowotworowej do 1,25 limfocytów T. Na przykład, przy 1.5 x 104 komórkach nowotworowych na studzienkę, aby uzyskać stosunek 1:40, należy dodać 6 x 105 limfocytów T na studzienkę i rozcieńczać limfocyty T 2-krotnie, aż zostanie osiągnięty stosunek 1.5 x 104 komórek nowotworowych do 1.875 x 104 limfocytów T na studzienkę (stosunek 1:1,25).
- Wstrzymać pracę stacji xCelligence i wyjąć płytkę E-plate.
- Usunąć medium ze studzienek za pomocą pipety i dodać 200 μl samego medium lub odpowiednią proporcję limfocytów T do studzienek.
- Włożyć płytkę E-plate z powrotem do stacji xCelligence i wznowić program oprogramowania xCelligence, aby odczyty impedancji były rejestrowane co 5 minut przez około 20 godzin po dodaniu limfocytów T.
- Znormalizować wyniki na koniec analizy.
4. Analiza uwalniania chromu (CRA)7
- Podczas pracy z 51Cr i komórkami docelowymi znakowanymi 51Cr należy przestrzegać instytucjonalnych procedur bezpieczeństwa radiologicznego. Zawsze stosować odpowiednie osłony w celu ograniczenia ekspozycji na promieniowanie.
- Poddać komórki nowotworowe impulsowi przez 2 godziny przy stężeniu 1 x 106 komórek nowotworowych/ml, stosując 10 μl/ml świeżego 51Cr (0,005 Ci/ml).
- Przemyć komórki nowotworowe w 10 ml pożywki RPMI z 10% FBS i odwirować przy 1000 rpm przez 5 minut. Przenieść komórki nowotworowe na płytkę 96-dołkową z okrągłym dnem w ilości 1 x 105 komórek nowotworowych w 100 μl/dołek.
- Dodać limfocyty T w różnych proporcjach, zaczynając od 1 komórki nowotworowej na 40 limfocytów T, i rozcieńczać dwukrotnie, aż do osiągnięcia proporcji 1 komórki nowotworowej do 1,25 limfocytu T. Przykładowo, przy 1 x 105 komórkach nowotworowych na dołek, aby uzyskać proporcję 1:40, należy dodać 4 x 106 limfocytów T na dołek, a następnie rozcieńczać limfocyty T dwukrotnie, aż do osiągnięcia proporcji 1 x 105 komórek nowotworowych do 1,25 x 105 limfocytów T na dołek (proporcja 1:1,25).
- Dodać do płytki kontrolę spontanicznego i maksymalnego uwalniania komórek nowotworowych. Aby obliczyć spontaniczne uwalnianie 51Cr z komórek nowotworowych, należy do sześciu dołków, z których każdy zawiera 1 x 105 komórek nowotworowych w 100 μl, dodać 100 μl pożywki RPMI z 10% FBS. Aby obliczyć maksymalne uwalnianie 51Cr z komórek nowotworowych, należy do sześciu dołków, z których każdy zawiera 1 x 105 komórek nowotworowych w 100 μl, dodać 100 μl 0,1% Triton X-100 w PBS, który powoduje lizę wszystkich komórek.
- Inkubować płytki przez 5 godzin w temperaturze 37 °C przy 5% CO2.
- Po inkubacji pobrać 50 μl supernatantu z każdego dołka i przenieść go na płytkę Luma.
- Suszyć płytki przez noc, a następnie zmierzyć CPM za pomocą licznika gamma.
5. Obliczanie procentu lizy
- Analiza impedancji: Odczytaj wartość impedancji, raportowaną jako indeks komórkowy (CI), w różnych punktach czasowych i zastosuj poniższy wzór w celu określenia procentu lizy: (CI tylko guz - (CI guz + limfocyty T)) / (CI tylko guz) *100.
- CRA: Zastosuj poniższy wzór w celu określenia procentu lizy: (CPM eksperymentalne - CPM spontaniczne) / (CPM maksymalne - CPM spontaniczne)*100.
6. Reprezentatywne wyniki
Same limfocyty T nie zwiększają impedancji
Limfocyty T zazwyczaj nie przylegają do większości powierzchni stałych i nie wymagają adhezji do aktywacji oraz proliferacji. Postawiono zatem hipotezę, że limfocyty T nie powinny wpływać na impedancję w płytkach xCelligence E-plates. Aby to sprawdzić, do studzienek wprowadzono albo komórki raka piersi SKBR3, albo świeżo oczyszczone ludzkie limfocyty T CD8. Impedancję mierzono przez 40 godzin, a reprezentatywny przykład wykazujący w zasadzie znikomy wpływ limfocytów T przedstawiono na Rysunku 1A. W przeciwieństwie do tego można by argumentować, że limfocyty T mogą nieznacznie obniżać impedancję tła. Mimo to kokultura wykazała, że proces dodawania limfocytów T w 18. godzinie po rozpoczęciu pomiarów impedancji spowodował zaburzenie impedancji (Rysunek 1B). Inne badania wykazały, że zaburzenia wynikały częściowo z manipulacji próbkami, ponieważ spadek sygnału można było zredukować, zapewniając, aby temperatura roztworu zawierającego limfocyty T była taka sama jak wewnątrz inkubatora.
Obniżenia impedancji pośredniczone przez limfocyty T są zależne od dawki.
Użyteczność testu opartego na impedancji do porównywania próbek pod kątem aktywności cytotoksycznych limfocytów T wymaga możliwości rozróżnienia różnych stężeń limfocytów T specyficznych dla antygenu. Aby sprawdzić, czy jest to możliwe, komórki SKBR3 współhodowano z różnymi stężeniami limfocytów T pochodzących z linii limfocytów T specyficznych dla HER-2/neu p369. Jak pokazano na Rysunku 2A, spadki impedancji były zależne od dawki limfocytów T. Rysunek 2B pokazuje, że wskaźniki komórkowe po 10 godzinach wykazują prostą zależność wielomianową drugiego stopnia w zakresie zastosowanych stężeń limfocytów T. Zatem stacja xCelligence monitoruje w czasie rzeczywistym śmierć guzów SKBR3 pośredniczoną przez limfocyty T CD8 jako spadek wskaźnika komórkowego.
Test oparty na impedancji wykrywa limfocyty T swoiste dla antygenu
Aby ustalić, czy spadki impedancji linii komórek raka piersi SKBR3, która jest dodatnia pod kątem HER-2/neu i HLA-A2, wywołane przez limfocyty T specyficzne dla p369 HER-2/neu były specyficzne antygenowo, oddzielne studzienki zawierające komórki SKBR3 inkubowano również z limfocytami T pochodzącymi z linii limfocytów T specyficznych dla grypy (FLU). Limfocyty T specyficzne dla FLU, będące dodatnie pod kątem HLA-A2, ale niezdolne do rozpoznawania HER-2/neu, posłużyły jako kontrola nieswoista. Jak pokazano na Rysunku 3, istnieje znacząca różnica między aktywnością lityczną limfocytów T specyficznych dla p369 HER-2/neu a aktywnością limfocytów T specyficznych dla FLU (p<0,0001). W niektórych przypadkach limfocyty T nieswoiste dla guza (np. specyficzne dla FLU lub stymulowane przeciwciałami anty-CD3/anty-CD28) wykazywały niski poziom aktywności litycznej (Rysunki 3A-B). Limfocyty T mogą zabijać na dwa sposoby: nieswoiście, poprzez interakcje Fas:ligand Fas, lub swoiście antygenowo, poprzez uwalnianie granzymów i perforyn. Aby dodatkowo potwierdzić tezę, że limfocyty T specyficzne dla HER-2/neu zabijają w sposób swoisty antygenowo, zastosowano przeciwciało blokujące ligand Fas. Jak pokazano na Rysunku 3B, przeciwciało to nie zmniejszyło aktywności litycznej limfocytów T specyficznych dla p369 HER-2/neu. Przeciwciało mogło hamować interakcje między Fas a ligandem Fas, co wykazano na przykładzie limfocytów T aktywowanych nieswoiście za pomocą kulek anty-CD3/CD28. Wyniki te sugerują, że podczas badania limfocytów T swoistych dla guza w porównaniu z limfocytami T nieswoistymi dla guza może być konieczna blokada liganda Fas w celu zminimalizowania interakcji niezależnych od TCR. Alternatywnie, w przypadku stosowania krótko hodowanych linii limfocytów T, w których tylko część komórek jest specyficzna dla antygenu użytego do generowania ex vivo, może dojść do aktywacji limfocytów T spowodowanej niedopasowaniem MHC, co prowadzi do nieswoistej lizy. W takim przypadku zasadne może być dodanie przeciwciał blokujących nieistotne cząsteczki HLA. Aby ustalić, czy limfocyty T specyficzne dla p369 zabijają komórki nowotworowe w sposób zależny od cząsteczek HLA klasy I, do kokultur dodano przeciwciało anty-HLA klasy I lub przeciwciało kontrolne izotypowe. Jak pokazano na Rysunku 3C, liza przez limfocyty T specyficzne dla p369 została zahamowana przez dodanie przeciwciała, co dowodzi restrykcji HLA klasy I. Na koniec, ponieważ opracowanie tego testu przeprowadzono głównie z użyciem SKBR3, istotne było sprawdzenie, czy inne adherentne komórki nowotworowe wykazujące ekspresję HLA-A2 i HER-2/neu mogą być zabijane przez limfocyty T specyficzne dla p369. W związku z tym przygotowano limfocyty T i dodano je w stosunku 1:5 do komórek nowotworowych wykazujących ekspresję HLA-A2 i HER-2/neu: linii SKBR3, MCF-7 oraz HCC1419. Linia komórek nowotworowych BT20, ujemna pod kątem HLA-A2, posłużyła jako kontrola negatywna. Jak pokazano na Rysunku 3D, wszystkie te dodatkowe komórki nowotworowe, z wyjątkiem BT20, również zostały zabite, co oceniono na podstawie impedancji. Zatem metoda ta wydaje się być użyteczna dla wielu rodzajów adherentnych komórek nowotworowych będących celem.
Analiza oparta na impedancji jest bardziej czuła niż standardowy test uwalniania chromu w wykrywaniu aktywności cytotoksycznych limfocytów T
Analiza uwalniania chromu (51Cr) (CRA), służąca do pomiaru aktywności cytolitycznej, od dawna jest złotym standardem monitorowania odpowiedzi limfocytów T CD8. W tym badaniu komórki docelowe (np. komórki nowotworowe) są znakowane 51Cr. W większości przypadków zdrowe komórki docelowe są w stanie zatrzymać większość radiomarkera w trakcie trwania analizy. Do komórek docelowych dodaje się limfocyty T CD8, zazwyczaj w różnych stężeniach, a śmierć komórek docelowych jest wykrywana poprzez uwalnianie 51Cr do medium. Poza faktem wykorzystania niebezpiecznego promieniowania, dwoma głównymi problemami CRA są brak czułości oraz fakt, że analiza ta zazwyczaj wymaga dużych ilości limfocytów T CD8, co ogranicza jej użyteczność. Aby sprawdzić, czy analiza oparta na impedancji jest bardziej czuła niż CRA, in vitro wygenerowano limfocyty T specyficzne dla HER-2/neu p369 i zastosowano je, w różnych ilościach, albo do płytek E zawierających nieznakowane komórki nowotworowe, albo do standardowych płytek polipropylenowych zawierających komórki docelowe znakowane 51Cr. Pomiary, albo impedancji, albo wolnego chromu, przeprowadzono 5 godzin po dodaniu limfocytów T. Rycina 4, przedstawiająca reprezentatywny przykład, pokazuje, że analiza impedancji daje lepsze wyniki niż analiza uwalniania chromu.
Zmienność wewnątrzanaliza testu opartego na impedancji wynosi zazwyczaj poniżej 20%.
Zbadano zmienność wewnątrzanalizową, ponieważ szersze zastosowanie tego testu będzie w dużej mierze zależeć od jego powtarzalności i zmienności (Rysunek 5). Dwie linie limfocytów T specyficzne dla p369 zostały wygenerowane niezależnie w odstępie 30 dni i dodane w trzech powtórzeniach przy różnych stosunkach liczby komórek nowotworowych do limfocytów T. Wykres wstawiony w Rysunek 5 pokazuje, że linie te były w dużej mierze równoważne pod względem lizy komórek SKBR3. Obliczono i wykreślono procentowy współczynnik zmienności dla każdego stosunku komórek. Jak pokazano na Rysunku 5, przy stosunkach od 1:40 do 1:5 procentowe współczynniki zmienności (CV) wynosiły poniżej 15%. Jednakże przy stosunkach 1:2,5 i 1:1,25 wartości CV były wysokie lub nieprzewidywalne. Ze względu na znaczną zmienność biologiczną nie jest możliwe zmierzenie zmienności międzyanalizowej z zastosowaniem pierwotnych linii limfocytów T.
Rysunek 1. Impedancja musi zostać znormalizowana po dodaniu limfocytów T. Panel A: wykazuje, że za impedancję odpowiadają komórki nowotworowe (linia czerwona), a nie limfocyty T (linia niebieska). Przedstawiono zapisy impedancji w czasie 40 godzin dla samych komórek nowotworowych lub samych limfocytów T. Podobne wyniki uzyskano w drugim eksperymencie. Należy zauważyć, że zaburzenie sygnału w około 20 godzinie reprezentuje moment dodania limfocytów T do studzienek niezawierających komórek nowotworowych. Panel B: pokazuje, że pomiary impedancji są przejściowo zakłócone po dodaniu limfocytów T do komórek nowotworowych. Wymaga to normalizacji w pewnym punkcie czasowym po dodaniu limfocytów T (patrz punkt normalizacji zaznaczony na wykresie). Krzywe zostały opracowane z podwójnych punktów danych. Krzywa dla samych komórek nowotworowych przedstawiona jest na czerwono. Pozostałe krzywe reprezentują komórki nowotworowe w kozywnie z limfocytami T specyficznymi dla HER-2/neu p369 (niebieski: stosunek 1,25 limfocytu T/komórka nowotworowa, zielony: stosunek 40 limfocytów T/komórka nowotworowa). Każda krzywa została obliczona z podwójnych punktów danych zbieranych co 5 minut przez cały czas trwania hodowli. Wyniki są reprezentatywne dla 3 oddzielnych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek.
Rycina 2. Redukcja impedancji pośredniczona przez limfocyty T jest zależna od dawki. Panel A: Przedstawiono przebiegi impedancji komórek nowotworowych SKBR3 inkubowanych samodzielnie lub z różnymi stężeniami specyficznych dla nowotworu limfocytów T. Każdy przebieg został obliczony z trzech powtórzeń pomiarów zbieranych co 5 minut przez cały czas trwania hodowli. Wyniki są reprezentatywne dla 3 niezależnych eksperymentów. Panel B: Przedstawiono indeksy komórkowe po 10 godzinach dla wszystkich stężeń limfocytów T/komórek nowotworowych. Linia przerywana reprezentuje indeks komórkowy dla samych komórek nowotworowych. Każdy symbol oznacza średnią (±s.e.m.) z trzech pomiarów. Wyniki są reprezentatywne dla 3 niezależnych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.
Rysunek 3. Test oparty na impedancji wykrywa antygenowo specyficzne odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T. Panel A przedstawia poziom lizy komórek SKBR3 przez limfocyty T specyficzne dla HER-2/neu p369 (kolor czerwony) lub limfocyty T specyficzne dla FLU (kolor niebieski) po 5, 10 i 15 godzinach od rozpoczęcia kokultury. Każdy punkt danych to średnia (±s.e.m.) z pomiarów wykonanych w trzech powtórzeniach. Wyniki są reprezentatywne dla 3 niezależnych eksperymentów. Panel B przedstawia lizę komórek SKBR3 przez limfocyty T specyficzne dla p369 lub nieswoiście aktywowane limfocyty T, wykazując, że antygenowo specyficzna liza nie wynika z oddziaływań Fas-ligand Fas. Czarne słupki reprezentują kokultury zawierające przeciwciało przeciwko ligandowi Fas. Każdy słupek to średnia (±s.e.m.) lizy w trzech powtórzeniach po 5 godzinach od dodania limfocytów T. Wyniki są reprezentatywne dla 3 niezależnych eksperymentów. Panel C pokazuje, że liza komórek SKBR3 przez limfocyty T specyficzne dla p369 po 10 godzinach od dodania limfocytów T jest zależna od cząsteczek HLA klasy I. Podczas kokultury dodano przeciwciało blokujące HLA klasy I lub kontrolę izotypową. Każdy słupek to średnia (±s.e.m.) lizy w trzech powtórzeniach. Eksperyment ten powtórzono dwukrotnie, uzyskując podobne wyniki. Panel D przedstawia % lizy po 10 godzinach od dodania limfocytów T kilku linii komórkowych nowotworu wykazujących ekspresję HLA-A2+ i HER-2/neu przez limfocyty T specyficzne dla p369. Jako kontrolę negatywną wykorzystano BT20, linię komórkową raka piersi ujemną pod kątem HLA-A2. Każdy punkt reprezentuje osobny eksperyment obliczony na podstawie trzech pomiarów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.
Rycina 4. Test oparty na impedancji jest bardziej czuły niż test uwalniania chromu w detekcji limfocytów T specyficznych dla antygenu nowotworowego. Przedstawiono % lizy komórek SKBR3 w odpowiedzi na różne stężenia limfocytów T specyficznych dla p369, zmierzony 5 godzin po zmieszaniu komórek nowotworowych z limfocytami T, z wykorzystaniem zarówno testu opartego na impedancji, jak i testu uwalniania chromu. Każdy symbol oznacza średnią (±s.e.m) z trzech powtórzeń. Wyniki są reprezentatywne dla 3 oddzielnych eksperymentów.
Rysunek 5. % wewnątrzassayowych współczynników zmienności testu cytotoksyczności limfocytów T opartego na impedancji. Przedstawiono średnie (±SD) % wewnątrzassayowych współczynników zmienności lizy SKBR3 w zakresie różnych stężeń limfocytów T specyficznych dla antygenu. Każdy symbol reprezentuje średnią z trzech powtórzeń. Liczby naniesione na wykres to średnie wartości % CV. Panel wstawkowy przedstawia średnią (±s.e.m, n=3) % lizy SKBR3 przy różnych stężeniach limfocytów T specyficznych dla p369-377. Przedstawiono dwie niezależnie wygenerowane linie limfocytów T specyficznych dla p369, otrzymane od dwóch oddzielnych dawców.
Dyskusja
Limfocyty T CD8 są istotne dla adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej, ponieważ potrafią bezpośrednio niszczyć zakażone lub nowotworowe komórki4. Choć istnieje kilka metod pomiaru liczby antygenowo swoistych limfocytów T CD8 (np. ELIspot, tetramery, cytometria przepływowa), często pomocne jest ustalenie, czy komórki te są funkcjonalnie cytotoksyczne3. Najbardziej rozpoznawalnym testem do oceny funkcji cytotoksycznej jest CRA, który uznaje się za metodę referencyjną (gold standard)4. Głównymi ograniczeniami CRA są: (1) konieczność użycia substancji promieniotwórczych, (2) brak czułości, (3) brak informacji mechanistycznych, (4) zapotrzebowanie na dużą liczbę komórek oraz (5) pracochłonne przygotowanie. Dlatego w ciągu ostatniej dekady pojawiło się zainteresowanie wdrożeniem nowych strategii w celu zminimalizowania tych ograniczeń. Nowsze podejścia obejmują metody mierzące uwalnianie kaspazy4, aktywność esterazy BLT5 oraz ekspresję powierzchniową CD1076. Niniejszy artykuł sugeruje, że test oparty na impedancji, przeprowadzany w systemie Roche xCelligence, może być również przydatny jako alternatywa dla CRA. Możliwość zastosowania podejścia opartego na impedancji wynika z obserwacji, że limfocyty T, które nie przylegają ściśle do powierzchni, nie wydają się mieć dużego wpływu na impedancję, co eliminuje obawy dotyczące bezpośredniego zakłócania pomiaru przez limfocyty T. Przewiduje się, że nakład pracy wymagany przy użyciu systemu pomiaru impedancji będzie znacznie mniejszy, przede wszystkim ze względu na wyeliminowanie kwestii regulacyjnych związanych z użyciem radioaktywności. Jedyną istotną wadą systemu opartego na impedancji jest konieczność poniesienia wydatku rzędu 50 000 do 60 000 USD na zakup urządzenia xCelligence. Jednak urządzenie xCelligence eliminuje potrzebę posiadania licznika promieniowania i jest znacznie bardziej wszechstronne, gdyż jest użyteczne do oceny odpowiedzi komórkowej na leki i migracji, oprócz badania cytotoksyczności limfocytów T 8.
Obserwacje wskazujące na to, że spadek impedancji komórek nowotworowych jest zależny od dawki, co przedstawiono na Rysunku 2, przy stosunkowo stromym nachyleniu zgodnym z prostą wtórną funkcją kwadratową, sugerują, że test ten mógłby zostać wykorzystany w testach rozcieńczeń ograniczających (LDAs) do szacowania częstotliwości występowania komórek cytotoksycznych9. Jedną z zalet podejścia opartego na impedancji jest fakt, że wymagana liczba limfocytów T i komórek nowotworowych jest mniejsza niż w przypadku CRA, co potencjalnie zwiększa wykonalność LDA. Na przykład w CRA, przy stosunku 1:40, w każdej studzience wysiewa się 1 x 105 komórek nowotworowych, co wymaga 4 x 106 całkowitej liczby limfocytów T na studzinkę. Natomiast w teście opartym na impedancji potrzebnych jest tylko 1,5 x 104 komórek nowotworowych na studzinkę, co zużywa jedynie 6 x 105 całkowitej liczby limfocytów T na studzinkę. Zatem test oparty na impedancji wykorzystuje o 85% mniej limfocytów T i komórek nowotworowych. Ta redukcja sugeruje, że system oparty na impedancji mógłby zostać przystosowany do monitorowania immunologicznego w badaniach klinicznych u ludzi, gdzie objętość pobranej krwi może być ograniczona. Ponadto, podczas gdy CRA ogranicza się do jednego punktu czasowego, test oparty na impedancji gromadzi ciągłe dane w czasie rzeczywistym, co pozwala użytkownikowi porównać wiele punktów czasowych lizy w tym samym eksperymencie przy minimalnym dodatkowym nakładzie pracy i komórek. Obliczenia częstotliwości mogłyby zostać potencjalnie połączone z innymi strategiami, które nie mierzą funkcji, takimi jak analizy tetramerów, aby ustalić stosunek funkcjonalnych cytotoksycznych limfocytów T do całkowitej liczby antygenowo swoistych limfocytów T CD810. Jedną z najatrakcyjniejszych cech podejścia opartego na impedancji jest to, że w przeciwieństwie do większości innych testów, cytotoksyczność może być monitorowana w czasie rzeczywistym, co potencjalnie ułatwia badanie interakcji komórkowych z użyciem inhibitorów lub przeciwciał. Kolejną zaletą jest to, że metoda ta może być odpowiednia dla komórek nowotworowych opornych na znakowanie. Wreszcie, ponieważ niezabite komórki nowotworowe nie są znakowane i pozostają sterylne, możliwe jest ich dalszey odzyskanie i badanie komórek opornych na działanie limfocytów T.
Podsumowując, choć oba systemy dostarczają danych o niszczeniu nowotworu w odpowiedzi na specyficzne limfocyty T, test oparty na impedancji jest czulszy niż metoda CRA i stanowi bardziej elastyczną platformę.
Oświadczenia
Produkcja i bezpłatny dostęp do tego artykułu wideo są sponsorowane przez Roche Diagnostics.
Podziękowania
Praca ta była finansowana z grantów przyznanych Keithowi L. Knutsonowi przez fundację Susan G. Komen for the Cure oraz NIH/NCI 9R01 CA152045 i P50-CA116201.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | Stosowane do izolacji PBMC z krwi |
| RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV | Pożywki do hodowli komórkowych |
| wołowia surowica płodowa | Denville Scientific | FB5001-H | Pożywki do hodowli komórkowych |
| Ludzka IL-2 | eBioscience | 14-8029-81 | Do stymulacji wzrostu limfocytów T |
| Ludzki interferon gamma | Nauki o komórce | CR2026 | Do stymulacji ekspresji MHC w komórkach nowotworowych |
| peptyd HER-2/neu p369-377 | Jednostka syntezy peptydów Mayo Clinic | sekwencja aminokwasowa KIFGSLAFL | Wiąże się z HLA-A2 |
| Peptyd p58-66 wirusa grypy | Jednostka syntezy peptydów Mayo Clinic | sekwencja aminokwasowa GILGFVFTL | Wiąże się z HLA-A2 |
| Kule Dynabeads przeciw CD3/CD28 dla ludzi | Invitrogen | 111-61D | Do nieswoistej aktywacji i ekspansji limfocytów T |
| Chrom -51 | MP Biomedicals | 62015 | odczynnik do znakowania CRA |
| Płytka E-plate |  Grupa Roche | 05469830001 | dla urządzenia do pomiaru impedancji xCelligence |
| Płytka Luma 96-dołkowa | PerkinElmer, Inc. | 6005630 | Do pomiaru radioaktywności w liczniku Top Count NXT. |
| Stacja xCelligence RTCA DP | Roche Applied Science | RTCA DP | jednostka impedancji |
| Top Count NXT | PerkinElmer, Inc. | C990601 | Scyntylacja & Luminometr |
| przeciwciało przeciwko ligandowi Fas | BD Biosciences | 556372 | W celu blokowania oddziaływań Fas-ligand Fas |
| przeciwciało HLA-A2 BB7.2 | BD Biosciences | 551230 | Do blokowania HLA klasy I |
| IgG2b mysie, κ | BD Biosciences | 555740 | Kontrola izotypowa dla HLA klasy I |
| linia nowotworowa SKBR3 | ATCC | HTB-30 | Gruczolak naczyń krwionośnych |
| linia nowotworowa MCF7 | ATCC | HTB-22 | Gruczolakorak |
| linia nowotworowa HCC1419 | ATCC | CRL-2326 | Pierwotny rak przewodowy |
| linia nowotworowa BT20 | ATCC | HTB-19 | Rak |
Bibliografia
- Zhang, N., Bevan, M. J. CD8(+) T cells: foot soldiers of the immune system. Immunity. 35, 161-168 (2011).
- Garboczi, D. N. Structure of the complex between human T-cell receptor, viral peptide and HLA-A2. Nature. 384, 134-141 (1996).
- Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. Laboratory analysis of T-cell immunity. Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).
- Andersen, M. H., Schrama, D., Thor Straten, P., Becker, J. C. Cytotoxic T cells. J. Invest. Dermatol. 126, 32-41 (2006).
- Weren, A., Bonnekoh, B., Schraven, B., Gollnick, H., Ambach, A. A novel flow cytometric assay focusing on perforin release mechanisms of cytotoxic T lymphocytes. J. Immunol. Methods. 289, 17-26 (2004).
- Aktas, E., Kucuksezer, U. C., Bilgic, S., Erten, G., Deniz, G. Relationship between CD107a expression and cytotoxic activity. Cell Immunol. 254, 149-154 (2009).
- Knutson, K. L., Schiffman, K., Disis, M. L. Immunization with a HER-2/neu helper peptide vaccine generates HER- 2/neu CD8 T-cell immunity in cancer patients. J. Clin. Invest. 107, 477-484 (2001).
- Asiedu, M. K., Ingle, J. N., Behrens, M. D., Radisky, D. C., Knutson, K. L. TGFbeta/TNF(alpha)-mediated epithelial-mesenchymal transition generates breast cancer stem cells with a claudin-low phenotype. Cancer Res. 71, 4707-4719 (2011).
- Strijbosch, L. W., Buurman, W. A., Does, R. J., Zinken, P. H., Groenewegen, G. Limiting dilution assays. Experimental design and statistical analysis. J. Immunol. Methods. 97, 133-140 (1987).
- Gallimore, A. Induction and exhaustion of lymphocytic choriomeningitis virus-specific cytotoxic T lymphocytes visualized using soluble tetrameric major histocompatibility complex class I-peptide complexes. J. Exp. Med. 187, 1383-1393 (1998).
Przedruki i uprawnienia
