Wykrywanie translokacji toksyny do cytozolu gospodarza przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmonowego

Podsumowanie

W niniejszym raporcie opisujemy, w jaki sposób rezonans plazmonów powierzchniowych jest wykorzystywany do wykrywania przenikania toksyn do cytozolu gospodarza. Ta wysokoczuła metoda pozwala na uzyskanie ilościowych danych dotyczących zawartości toksyn w cytozolu i może być zastosowana w przypadku wielu rodzajów toksyn.

Streszczenie

Toksyny AB składają się z enzymatycznej podjednostki A oraz wiążącej się z komórką podjednostki B¹. Toksyny te są wydzielane do środowiska pozakomórkowego, lecz działają na cele znajdujące się w cytozolu eukariotycznym. Niektóre toksyny AB przemieszczają się za pomocą pęcherzyków transportowych z powierzchni komórki do retikulum endoplazmatycznego (ER), zanim dostaną się do cytozolu^2-4. W ER katalityczny łańcuch A oddziela się od reszty toksyny i przechodzi przez kanał białkowy, aby dotrzeć do swojego celu w cytozolu⁵. Przetransportowany do cytozolu łańcuch A jest trudny do wykrycia, ponieważ transport toksyny do ER jest procesem niezwykle nieefektywnym: większość zinternalizowanej toksyny jest kierowana do lizosomów w celu degradacji, w związku z czym tylko niewielka frakcja toksyny związanej z powierzchnią dociera do aparatu Golgiego i ER^6-12.

Aby monitorować translokację toksyny z ER do cytozolu w hodowlach komórkowych, połączyliśmy protokół frakcjonowania subkomórkowego z wysoce czułą metodą detekcji opartą na powierzchniowym rezonansie plazmonowym (SPR)^13-15. Błona plazmatyczna komórek traktowanych toksyną jest selektywnie permeabilizowana za pomocą digitoniny, co umożliwia pobranie frakcji cytozolowej, która następnie jest przepuszczana nad sensorem SPR pokrytym przeciwciałem przeciwko łańcuchowi A toksyny. Sensor pokryty przeciwciałami może wychwytywać i wykrywać ilości toksyny cytozolowej rzędu pg/mL. Dzięki temu protokołowi możliwe jest śledzenie kinetyki wnikania toksyny do cytozolu oraz charakteryzacja efektów hamujących proces translokacji. Stężenie toksyny cytozolowej można również obliczyć na podstawie krzywej wzorcowej wygenerowanej z znanych ilości standardów łańcucha A przepuszczonych nad sensorem. Nasza metoda stanowi szybki, czuły i ilościowy system detekcji, który nie wymaga znakowania radioizotopowego ani innych modyfikacji docelowej toksyny.

Protokół

1. Przygotowanie digitoniny

1. Do probówki do mikrocentryfugi dodać 500 μL 100% etanolu i umieścić ją w bloku grzejnym ustawionym na 80 °C na 10 min.
2. Rozpuścić 2,5 mg digitoniny w 250 μL podgrzanego etanolu, aby przygotować 1% roztwór zapasowy digitoniny.
3. W celu przygotowania 0,04% roztworu roboczego digitoniny, dodać 40 μL roztworu zapasowego digitoniny do 960 μL buforu HCN (50 mM Hepes pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl₂, 10 mM N-ethylmaleimide oraz koktajl inhibitorów proteaz).

2. Intoksykacja i permeabilizacja komórek

Nasz test translokacji można zastosować do szerokiego spektrum toksyn i linii komórkowych. Poniżej przedstawiamy szczegółowy protokół wykrywania toksyny cholerycznej (CT). Przegląd procedury przedstawiono na Rysunku 1.

1. Komórki HeLa wysiewuje się do płytek 6-dołkowych zawierających 1 mL DMEM uzupełnionego o 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz antybiotyk-antymykotyk, aby uzyskać 1x10⁶ komórek/dołek po inkubacji przez noc w temperaturze 37 °C. Aby wygenerować wystarczającą ilość toksyny cytozolowej do powtarzalnej detekcji, wymagane są trzy powtórzenia (triplikaty) dla każdego stanu badawczego.
2. Po inkubacji przez noc zastępuje się pożywkę hodowlaną 1 mL DMEM zawierającego 100 ng/mL gangliozidu GM1. Zwiększa to liczbę miejsc wiązania dla CT, ponieważ receptor GM1 dla CT wbuduje się w błonę komórkową komórek eksponowanych na roztwór GM1.
3. Po 1 h inkubacji w 37 °C usuwa się pożywkę zawierającą GM1 i dwukrotnie przemywa komórki DMEM. Następnie komórki umieszcza się w temperaturze 4 °C na 30 min w 1 mL DMEM zawierającego 1 μg/mL CT.
4. Usuwa się pożywkę zawierającą toksynę, dwukrotnie przemywa komórki DMEM i inkubuje je w 1 mL DMEM w 37 °C przez wybrany przedział czasowy.
5. Po zakończeniu każdego okresu pogoni (chase period) komórki przemywa się PBS i inkubuje każdą dołkę z 250 μL 0,5 mM EDTA w PBS. Komórki pozostawia się na 10 min w temperaturze pokojowej, a następnie usuwa się je z płytki 6-dołkowej poprzez energiczne triturację za pomocą pipety p1000. Po zebraniu komórek z jednej dołki łączy się je z komórkami z drugiej, a następnie z trzeciej dołki z tego samego stanu badawczego. Do zebrania komórek można również użyć skrobaków komórkowych.
6. Połączoną zawiesinę komórkową z trzech powtórzeń (całkowita objętość 750 μL) umieszcza się w jednej probówce do mikrocentryfugi i wiruje w mikrocentryfudze stołowej przez 5 min przy 5,000 x g. W przypadku wszystkich stanów badawczych powinny zostać uzyskane pellety komórkowe o zbliżonej wielkości.
7. Odciek zostaje usunięty, a pellet komórkowy resuspenderowany w 100 μL 0,04% roztworu roboczego digitoniny. Zawiesinę komórkową umieszcza się na lodzie na 10 min.
8. Komórki przepuszczone za pomocą digitoniny wiruje się przy 16,000 x g przez 10 min w mikrocentryfudze stołowej. Frakcję nadosadową zawierającą cytozol przenosi się do nowej probówki do mikrocentryfugi, zachowując frakcję pelletu zawierającą organelle.

3. Przygotowanie próbek

1. Frakcje nadosadu zawierające cytozol rozcieńza się w buforze HCN do końcowej objętości 1 mL. Objętości próbek wynoszące co najmniej 1 mL są niezbędne, aby zapewnić usunięcie powietrza z pętli próbkowania o pojemności 500 μL przed wtryskiem.
2. Frakcje osadu zawierające organelle resuspensuje się w 1 mL buforu HCN zawierającego 1% Triton X-100. Dodanie detergentu jest konieczne, aby uwolnić pulę toksyny uwięzioną w błonach.
3. Standardy toksyny o stężeniach 100, 10, 1 i 0,1 ng/mL przygotowuje się w buforze HCN.
4. Równoległe zestawy frakcji cytozolowych i organellowych przygotowuje się do eksperymentu kontrolnego w celu potwierdzenia dokładności procedury frakcjonowania. Frakcje otrzymane zgodnie z opisem w Sekcji 2 resuspensuje się w 20 μL 4-krotnego buforu do próbek (frakcja cytozolowa) lub 120 μL 1-krotnego buforu do próbek (frakcja organellowa). Równe objętości każdej frakcji rozdziela się za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu i analizuje metodą Western blot, aby wykazać obecność białka cytozolowego we frakcji nadosadu oraz rozpuszczalnego, rezydentnego białka ER we frakcji osadu^16-19.

4. Przygotowanie płytki SPR

1. Do eksperymentów SPR wykorzystuje się refraktometr SPR Reichert SR7000.
2. W urządzeniu SPR umieść pozłacaną szkiełko przedmiotowe z samoorganizującą się monowarstwą. Aby aktywować szkiełko sensora, przepłucz je roztworem 0,4 M EDC i 0,1 M NHS w stosunku 1:1 (v:v) przez 10 min przy szybkości przepływu 41 μL/min. Wszystkie kolejne przepłukiwania będą odbywać się z tą samą szybkością przepływu.
3. Aby usunąć bufor aktywacyjny EDC:NHS, płucz płytkę przez 5 min w PBS zawierającym 0,05% Tween 20 (PBST). Płytka zawiera teraz reaktywne wiązania amidowe dzięki odblokowaniu ich przez roztwór EDC:NHS.
4. Przepłucz aktywowane szkiełko sensora przeciwciałem anty-CTA w rozcieńczeniu 1:20 000 w 20 mM octanie sodu (pH 5,5) przez 15 min. Początkowo zaobserwowany zostanie spadek jednostki współczynnika załamania światła (RIU) ze względu na zmianę pH. Następnie nastąpi wzrost RIU w miarę wiązania przeciwciał przez reaktywne wiązania amidowe na szkiełku sensora.
5. Usuń niewiązane przeciwciała ze szkiełka sensora, płucząc je przez 5 minut PBST. Sygnał RIU generowany przez związane przeciwciała osiągnie plateau i ustabilizuje się, tworząc nowy sygnał bazowy.
6. Przepłucz szkiełko sensora 1 M etanolaminą (pH 8,5) przez 5 min. Pozwala to na zablokowanie i dezaktywację wszelkich niewiązanych wiązań pozostałych na szkiełku sensora.

5. Analiza próbek metodą SPR

1. Aby ustalić odczyt bazowy, przepływaj PBST nad sensorem pokrytym przeciwciałami przez 5 min.
2. Przepływaj próbkę eksperymentalną lub standard toksyny nad sensorem przez 300 sec. Usuń ligand z buforu i przepływaj PBST nad sensorem przez kolejne 200 sec.
3. Po każdym przepływie związaną toksynę usuwa się z sensora poprzez 100 sec płukania PBST o pH 5.0. Przywróci to sygnał do początkowego odczytu bazowego, co umożliwi przetworzenie kolejnej próbki na tym samym sensorze.
4. Przed załadowaniem nowej próbki przepchnij niewielką ilość powietrza przez pętlę próbkową, aby usunąć resztki płynu z poprzedniej próbki. Stosując procedurę opisaną w punktach 5.2-5.4, przeanalizowano do 12 próbek na jednej płytce bez znaczącej utraty sygnału bazowego.
5. Analizę danych wykonuje się za pomocą oprogramowania Scrubber 2, a oprogramowanie Igor służy do przygotowania rycin.

6. Reprezentatywne wyniki

Toksyna krztuśca (PT) jest toksyną typu AB, która przemieszcza się z powierzchni komórki do retikulum endoplazmatycznego (ER), zanim jej łańcuch A (PTS1) przedostanie się do cytosolu^{3, 12}. Jak pokazano na Ryc. 2, nasz test translokacji oparty na SPR pozwolił wykryć PTS1 w cytosolu zatrutych komórek CHO. W cytosolu komórek niezatrutych nie wygenerowano sygnału, co potwierdziło, że przeciwciało anty-PTS1 nie wykazuje reakcji krzyżowej z komponentami cytosolu gospodarza. Frakcja cytosolowa z komórek zatrutych w obecności brefeldyny A (BfA) również nie wywołała pozytywnego sygnału. BfA zapobiega transportowi toksyny do miejsca translokacji w ER^{6-8, 12, 20-25}, a tym samym uniemożliwia dostarczenie łańcucha A do cytosolu. Po każdym pomiarze związana toksyna jest usuwana z płytki sensorycznej. Pozwoliło to na analizę wielu próbek na jednej płytce sensorycznej, zapewniając bezpośrednie porównanie wyników uzyskanych w różnych warunkach eksperymentalnych.

CT jest kolejną toksyną typu AB, która przemieszcza się przez ER⁴. Na rysunku 3A wykryto CTA1 w frakcji cytozolowej z komórek HeLa traktowanych CT. Podkreśla to, że nasza metodologia działa w przypadku wielu typów komórek i może być zastosowana do każdej toksyny, dla której dostępny jest przeciwciało przeciwko łańcuchowi A. Nie wykryto sygnału, gdy frakcja cytozolowa z komórek traktowanych CT była przepuszczana przez sensor SPR pokryty przeciwciałem anty-CTB (Rys. 3B), co dowodzi, że do cytozolu przedostaje się podjednostka CTA1, a nie wiążący się z komórkami pentamer CTB. Rysunek 3C pokazuje, że sygnał z frakcji organelli przekracza skalę w porównaniu z słabszym sygnałem z frakcji cytozolowej. Jest to zgodne ze znaną niską wydajnością transportu CT do miejsca translokacji w ER^{6, 7}, co z kolei ogranicza ilość toksyny, która może dotrzeć do cytozolu. Ponadto frakcja organelli zawiera holotoksynę CT, a także CTA1 zlokalizowaną w ER, zatem wynikowy sygnał SPR dla frakcji organelli jest zawyżony przez dodatkową masę pentameru CTB powiązanego z holotoksyną. W związku z tym nie jest praktyczne nanoszenie danych z frakcji organelli i cytozolowej na tym samym sensorgramie.

Nasza analiza pozwala monitorować zależną od czasu akumulację translokowanej toksyny w cytozolu (Rys. 4). Komórki poddano działaniu CT w temperaturze 4 °C, która umożliwia wiązanie toksyny z błoną komórkową, lecz zapobiega internalizacji związanej z komórką toksyny. Po usunięciu niezwiązanej toksyny komórki ogrzano do 37 °C. W tej temperaturze może następować zarówno transport toksyny do ER, jak i translokacja łańcucha A do cytozolu. Piętnaście minut po ogrzaniu do 37 °C w cytozolu nie wykryto toksyny. Odzwierciedlało to czas opóźnienia wymagany dla (i) transportu holotoksyny do ER; (ii) dysocjacji podjednostek A/B w ER; oraz (iii) eksportu łańcucha A do cytozolu. Po 30 minutach w 37 °C wykryto niewielką pulę toksyny cytozolowej, a progresywnie większe ilości toksyny cytozolowej wykryto po 45 i 60 minutowych odstępach czasu inkubacji (chase). Jeszcze wyższe poziomy toksyny cytozolowej odnotowano po 5-godzinnym odstępie czasu¹⁷, co wykazuje ciągłe, długoterminowe dostarczanie związanej z komórką toksyny do cytozolu gospodarza.

Nasz test pozwala również na wykrycie zahamowania translokacji toksyny do cytozolu (Rys. 5). Komórki traktowane 10% dimetylosulfotlenkiem (DMSO), chaperonem chemicznym zapobiegającym termicznemu rozfałdowaniu wyizolowanej podjednostki CTA1 (T. Banerjee i K. Teter, niepublikowane obserwacje), wykazały niskie poziomy CTA1 w cytozolu w porównaniu z niepoddanymi działaniu DMSO komórkami kontrolnymi. Rozfałdowanie łańcucha A toksyny jest warunkiem niezbędnym do translokacji do cytozolu^16-18, zatem indukowana przez DMSO stabilizacja CTA1 zapobiegła jego przemieszczaniu się z ER do cytozolu.

Stała szybkości asocjacji (k_a) obliczona z eksperymentów SPR jest wprost proporcjonalna do stężenia liganda w buforze perfuzyjnym^{14, 15, 26}. Zatem możliwe jest oznaczenie stężenia toksyny cytozolowej na podstawie wykresu przedstawiającego wartości k_a dla wzorców toksyny w funkcji stężenia toksyny. Procedura ta została zastosowana do ilościowego określenia indukowanej przez DMSO blokady translokacji toksyny przedstawionej na rysunku 5: krzywa wzorcowa wygenerowana z znanych stężeń toksyny posłużyła do obliczenia cytozolowego stężenia CTA1 wynoszącego 0,3 ng/mL dla komórek niepoddanych działaniu DMSO oraz 0,1 ng/mL dla komórek traktowanych DMSO (Rys. 6). Inhibicja rozwijania się CTA1 przez DMSO spowodowała zatem 3-krotny spadek translokacji CTA1 z ER do cytozolu.

Rysunek 1. Przegląd protokołu. (A) Komórki inkubuje się z toksyną AB w temperaturze 4 °C, która umożliwia wiązanie toksyny do powierzchni komórki, ale zapobiega jej endocytozie. Podjednostki A i B toksyny są reprezentowane odpowiednio przez czerwone i niebieskie okręgi. (B) Niewiązaną toksynę usuwa się z medium, a komórki ogrzewa się do 37 °C w celu promowania endocytozy i transportu retrogradnego holotoksyny do ER. Dysocjacja holotoksyny zachodzi w ER, co pozwala wyizolowanemu łańcuchowi A przedostać się do cytozolu poprzez kanał(e) białkowe w błonie ER. (C) Komórki traktuje się digitoniną w celu selektywnej permeabilizacji błony plazmatycznej. (D) Centryfugację wykorzystuje się do rozdziału komórek na oddzielne frakcje cytozolową i organellową. Cytozol zostaje wypchnięty z komórki przez pory utworzone przez digitoninę i znajduje się w supernatancie. Nienaruszone, związane z błonami organelle znajdują się w osadzie. (E) Aby wykryć przetransportowaną pulę łańcucha A toksyny w cytozolu gospodarza, frakcję supernatantu przepuszcza się nad sensorem SPR pokrytym przeciwciałem anty-łańcuch A.

Rycina 2. Wykrywanie translokacji PTS1 do cytosolu gospodarza. Komórki CHO poddano znakowaniu pulsacyjnemu w 4 °C przez 30 min przy użyciu 1 μg/mL PT. Następnie przeprowadzono etap pogoni przez 3 hr w 37 °C w medium wolnym od toksyny, bez dodatków (intoxicated) lub z dodatkiem 5 μg BfA/mL (+BfA intoxicated). Do rozdzielenia ekstraktów komórkowych na oddzielne frakcje organellową i cytosolową wykorzystano permeabilizację błony plazmatycznej za pomocą digitoniny. Do wykrycia puli cytosolowej PTS1 z komórek nieleczonych lub traktowanych BfA użyto sensora SPR pokrytego przeciwciałem anty-PTS1. Standardy PTS1 przepuszczano nad sensorem jako kontrole dodatnie, natomiast frakcję cytosolową z komórek niepoddanych intoksykacji przepuszczano nad płytką sensora jako kontrolę ujemną. Po każdym pomiarze związany próbkę usuwano z płytki sensora.

Rycina 3. Detekcja translokacji CTA1 do cytozolu gospodarza. Komórki HeLa poddane znakowaniu pulsacyjnemu w 4 °C z użyciem 1 μg/mL CT inkubowano przez 2 hr w 37 °C w medium wolnym od toksyny bez dodatków (intoxicated) lub z dodatkiem 5 μg BfA/mL (+BfA intoxicated). Do rozdzielenia ekstraktów komórkowych na oddzielne frakcje organelli i cytozolu zastosowano permeabilizację błony plazmatycznej za pomocą digitoniny. (A) Frakcje cytozolowe przepuszczano nad sensorem SPR pokrytym przeciwciałem anty-CTA. Jako kontrole pozytywne wykorzystano znane ilości CTA, natomiast jako kontrolę negatywną wykorzystano cytozol z komórek niepoddanych działaniu toksyny. (B) Frakcję cytozolową z komórek poddanych działaniu toksyny w obecności BfA przepuszczano nad sensorem SPR pokrytym przeciwciałem anty-CTB. Jako kontrolę pozytywną nad płytką przepuszczono oczyszczony pentamer CTB. (C) Frakcję organelli solubilizowano za pomocą 1% Triton X-100 przed przepuszczeniem nad sensorem SPR pokrytym przeciwciałem anty-CTA. W celach porównawczych nad sensor przepuszczano również frakcję cytozolową (objętość końcowa 1 mL) z tego samego ekstraktu komórkowego oraz standard CTA. Dla wszystkich paneli, na koniec każdego pomiaru, związaną próbkę usuwano z sensora.

Rycina 4. Kinetyka wnikania CTA1 do cytozolu. Komórki HeLa poddane znakowaniu impulsowemu w 4 °C przy użyciu 1 μg/mL CT inkubowano przez 15, 30, 45 lub 60 min w 37 °C w medium wolnym od toksyny. Aby wykryć pulę przetransportowanej toksyny, frakcje cytozolowe z komórek permeabilizowanych digitoniną przepuszczano nad sensorem SPR pokrytym przeciwciałami anty-CTA. Nad sensorem przepuszczano również standardy CTA. Na koniec każdego cyklu związany materiał próbkowy usuwano z płytki sensora.

Rycina 5. Hamowanie translokacji CTA1 przez DMSO. Komórki HeLa poddane znakowaniu impulsowemu w 4 °C przy użyciu 1 μg/mL CT inkubowano przez 2 hr w 37 °C w medium wolnym od toksyny bez dodatków (zaintoksykowane) lub z dodatkiem 10% DMSO (+DMSO zaintoksykowane). W celu wykrycia translokowanej puli toksyny, frakcje cytozolowe z komórek permeabilizowanych digitoniną przepuszczano nad sensorem SPR pokrytym przeciwciałem anty-CTA. Standardy CTA (100, 10, 1 i 0,1 ng/mL) przepuszczano nad sensorem jako kontrole dodatnie; w celu przeskalowania przedstawiono jedynie standardy 1 i 0,1 ng/mL. Cytozol z komórek niezaintoksykowanych posłużył jako kontrola ujemna. Po każdym pomiarze związany analizat był usuwany z płytki sensora.

Rycina 6. Obliczanie poziomu CTA1 w cytozolu. Wartości k_a dla standardów CTA z Ryciny 5 naniesiono w funkcji stężenia toksyny. Otrzymana krzywa wzorcowa została wykorzystana do określenia, na podstawie wartości k_a próbek doświadczalnych z Ryciny 5, stężenia CTA1 w cytozolu komórek nieleczonych oraz leczonych DMSO. Standardy toksyny przedstawiono jako wypełnione kółka; cytozol nieleczony jako pusty kwadrat, a cytozol leczony DMSO jako puste kółko. Przedstawiono średnie ± zakresy z dwóch niezależnych eksperymentów.

Dyskusja

Porównanie z istniejącą metodologią

Nasze badanie translokacji oparte na SPR stanowi szybką, czułą i ilościową metodę wykrywania dostarczania toksyny do cytozolu gospodarza. Technika ta nie wymaga znakowania radioizotopowego ani innych modyfikacji toksyny i może być zastosowana do każdej toksyny, dla której dostępny jest przeciwciało przeciwko łańcuchowi A toksyny. Istniejące metody monitorowania przenikania toksyny do cytozolu opierają się również na protokole frakcjonowania subkomórkowego w c...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Digitonina	Sigma-Aldrich	D141
Ethanol	Acros Organics	61509-0010
DMEM	Invitrogen	11995065
Płódkowa surowica bydlęca	Atlanta Biologicals	S11550
Gangliozyd GM1	Sigma-Aldrich	G7641
CTA	Sigma-Aldrich	C2398
PTS1	List	182
NHS (N-hydroksysukcynimid)	Pierce, Thermo Scientific	24500
EDC (1-etylo-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	22981
Etanoloamina	Sigma-Aldrich	E0135
PBST	Medicago	09-8903-100
Przeciwciało anty-CTA	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-80747
Przeciwciało anty-CTB	Calbiochem	227040
Przeciwciało anty-PTS1	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-57639
Refraktometr	Reichert	SR7000, SR7000DC
Slajdy z sensorem SPR	Reichert	13206060
Pompa strzykawkowa	Cole-Parmer	780200C