Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykrywanie translokacji toksyny do cytozolu gospodarza przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmonowego

12.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3686

⸱

3 stycznia 2012

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology and Microbiology, University of Central Florida

W tym artykule

Podsumowanie

W niniejszym raporcie opisujemy, w jaki sposób rezonans plazmonów powierzchniowych jest wykorzystywany do wykrywania przenikania toksyn do cytozolu gospodarza. Ta wysokoczuła metoda pozwala na uzyskanie ilościowych danych dotyczących zawartości toksyn w cytozolu i może być zastosowana w przypadku wielu rodzajów toksyn.

Streszczenie

Toksyny AB składają się z enzymatycznej podjednostki A oraz wiążącej się z komórką podjednostki B1. Toksyny te są wydzielane do środowiska pozakomórkowego, lecz działają na cele znajdujące się w cytozolu eukariotycznym. Niektóre toksyny AB przemieszczają się za pomocą pęcherzyków transportowych z powierzchni komórki do retikulum endoplazmatycznego (ER), zanim dostaną się do cytozolu2-4. W ER katalityczny łańcuch A oddziela się od reszty toksyny i przechodzi przez kanał białkowy, aby dotrzeć do swojego celu w cytozolu5. Przetransportowany do cytozolu łańcuch A jest trudny do wykrycia, ponieważ transport toksyny do ER jest procesem niezwykle nieefektywnym: większość zinternalizowanej toksyny jest kierowana do lizosomów w celu degradacji, w związku z czym tylko niewielka frakcja toksyny związanej z powierzchnią dociera do aparatu Golgiego i ER6-12.

Aby monitorować translokację toksyny z ER do cytozolu w hodowlach komórkowych, połączyliśmy protokół frakcjonowania subkomórkowego z wysoce czułą metodą detekcji opartą na powierzchniowym rezonansie plazmonowym (SPR)13-15. Błona plazmatyczna komórek traktowanych toksyną jest selektywnie permeabilizowana za pomocą digitoniny, co umożliwia pobranie frakcji cytozolowej, która następnie jest przepuszczana nad sensorem SPR pokrytym przeciwciałem przeciwko łańcuchowi A toksyny. Sensor pokryty przeciwciałami może wychwytywać i wykrywać ilości toksyny cytozolowej rzędu pg/mL. Dzięki temu protokołowi możliwe jest śledzenie kinetyki wnikania toksyny do cytozolu oraz charakteryzacja efektów hamujących proces translokacji. Stężenie toksyny cytozolowej można również obliczyć na podstawie krzywej wzorcowej wygenerowanej z znanych ilości standardów łańcucha A przepuszczonych nad sensorem. Nasza metoda stanowi szybki, czuły i ilościowy system detekcji, który nie wymaga znakowania radioizotopowego ani innych modyfikacji docelowej toksyny.

Protokół

1. Przygotowanie digitoniny

  1. Do probówki do mikrocentryfugi dodać 500 μL 100% etanolu i umieścić ją w bloku grzejnym ustawionym na 80 °C na 10 min.
  2. Rozpuścić 2,5 mg digitoniny w 250 μL podgrzanego etanolu, aby przygotować 1% roztwór zapasowy digitoniny.
  3. Aby przygotować roztwór roboczy digitoniny o stężeniu 0,04%, dodać 40 μL roztworu zapasowego digitoniny do 960 μL buforu HCN (50 mM Hepes pH 7.5, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 10 mM N-ethylmaleimide oraz koktajl inhibitorów proteaz).

2. Intoksykacja i permeabilizacja komórek

Naszą analizę translokacji można zastosować do szeregu toksyn i linii komórkowych. Poniżej przedstawiamy szczegółowy protokół wykrywania toksyny cholery (CT). Przegląd procedury przedstawiono na Rysunku 1.

  1. Komórki HeLa wysiewać do płytek 6-dołkowych zawierających 1 mL DMEM uzupełnionego o 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz antybiotyk-antymykotyk, aby po inkubacji nocnej w 37 °C uzyskać gęstość 1x106 komórek/dołek. Aby uzyskać wystarczającą ilość toksyny cytozolowej do powtarzalnej detekcji, dla każdego warunku wymagane są trzy powtórzenia w osobnych dołkach.
  2. Po inkubacji nocnej zastąpić pożywkę hodowlaną 1 mL DMEM zawierającego 100 ng/mL gangliozydy GM1. Zwiększa to liczbę miejsc wiązania dla CT, ponieważ receptor GM1 dla CT wbuduje się w błonę plazmatyczną komórek eksponowanych na roztwór GM1.
  3. Po 1 h inkubacji w 37 °C usunąć pożywkę zawierającą GM1 i dwukrotnie przemyć komórki DMEM. Następnie inkubować komórki w 4 °C przez 30 min w 1 mL DMEM zawierającego 1 μg/mL CT.
  4. Usunąć pożywkę zawierającą toksynę, dwukrotnie przemyć komórki DMEM i inkubować je w 1 mL DMEM w 37 °C przez wybrany odstęp lub odstępy czasu.
  5. Po każdym okresie pogoni (chase period) przemyć komórki PBS i inkubować każdą dołkę z 250 μL 0,5 mM EDTA w PBS. Pozostawić komórki na 10 min w temperaturze pokojowej, a następnie zebrać je z płytki 6-dołkowej poprzez energiczne triturację za pomocą pipety p1000. Po zebraniu komórek z jednej dołki, połączyć je z komórkami z drugiej, a następnie z trzeciej dołki z tego samego warunku. Do zbierania komórek można również użyć skrobaczek do komórek.
  6. Połączoną zawiesinę komórkową z trzech powtórzeń (całkowita objętość 750 μL) przenieść do jednej probówki do mikrowirowania i wirować w mikrowirowarce stołowej przez 5 min przy 5,000 x g. Dla wszystkich warunków powinny zostać uzyskane osady komórkowe o zbliżonej wielkości.
  7. Odlać nadsącz i zawiesić osad komórkowy w 100 μL 0,04% roztworu roboczego digitoniny. Umieścić zawiesinę komórkową na lodzie na 10 min.
  8. Wirować komórki permeabilizowane digitoniną przy 16,000 x g przez 10 min w mikrowirowarce stołowej. Przenieść frakcję nadsączu zawierającą cytozol do nowej probówki do mikrowirowania, a frakcję osadu zawierającą organelle zachować.

3. Przygotowanie próbek

  1. Frakcje nadsączu zawierające cytozol rozcieńza się w buforze HCN do końcowej objętości 1 mL. Objętości próbek wynoszące co najmniej 1 mL są niezbędne, aby zapewnić usunięcie powietrza z pętli próbkowej o pojemności 500 μL przed wtryskiem.
  2. Frakcje osadu zawierające organelle resuspensuje się w 1 mL buforu HCN zawierającego 1% Triton X-100. Dodanie detergentu jest niezbędne do uwolnienia puli toksyny zamkniętej w błonach.
  3. Standardy toksyny o stężeniach 100, 10, 1 i 0,1 ng/mL przygotowuje się w buforze HCN.
  4. Równoległe zestawy frakcji cytozolowych i organellowych przygotowuje się do eksperymentu kontrolnego w celu potwierdzenia rzetelności procedury frakcjonowania. Frakcje uzyskane zgodnie z opisem w sekcji 2 resuspensuje się w 20 μL 4x buforu do próbek (frakcja cytozolowa) lub 120 μL 1x buforu do próbek (frakcja organellowa). Równe objętości każdej frakcji rozdziela się za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu i analizuje metodą Western blot, aby wykazać podział białka cytozolowego do frakcji nadsączu oraz rozpuszczalnego, rezydentnego białka ER do frakcji osadu16-19.

4. Przygotowanie płytki SPR

  1. Do eksperymentów SPR wykorzystuje się refraktometr SPR Reichert SR7000.
  2. W instrumentach SPR umieszcza się szklaną płytkę pozłacaną z samoorganizującą się monowarstwą. Aby aktywować płytkę sensoryczną, należy przepływać nad nią roztwór 0,4 M EDC i 0,1 M NHS w stosunku 1:1 (v:v) przez 10 min przy szybkości przepływu 41 μL/min. Wszystkie kolejne etapy perfuzji będą odbywać się przy tej samej szybkości przepływu.
  3. Aby usunąć bufor aktywacyjny EDC:NHS, płytkę przemywa się przez 5 min roztworem PBS zawierającym 0,05% Tween 20 (PBST). Na płytce znajdują się teraz reaktywne wiązania amidowe powstałe w wyniku odblokowania przez roztwór EDC:NHS.
  4. Nad aktywowaną płytkę sensoryczną przepływa przeciwciało anty-CTA w rozcieńczeniu 1:20 000 w 20 mM octanie sodu (pH 5,5) przez 15 min. Początkowo zaobserwowany zostanie spadek jednostki współczynnika załamania światła (RIU) wynikający ze zmiany pH. Następnie nastąpi wzrost RIU w miarę wiązania przeciwciał przez reaktywne wiązania amidowe na płytce sensorycznej.
  5. Niezwiązane przeciwciała usuwa się z płytki sensorycznej poprzez 5-minutowe płukanie w PBST. Sygnał RIU generowany przez związane przeciwciała osiągnie plateau i ustabilizuje się, tworząc nową linię bazową.
  6. Nad płytkę sensoryczną przepływa 1 M etanolaminę (pH 8,5) przez 5 min. Pozwala to na zablokowanie i inaktywację wszystkich pozostałych na płytce sensorycznej niezwiązanych wiązań.

5. Analiza próbek metodą SPR

  1. Aby ustalić odczyt bazowy, przepłucz sensor pokryty przeciwciałem roztworem PBST przez 5 min.
  2. Przepłucz sensor próbką eksperymentalną lub wzorcem toksyny przez 300 sec. Usuń ligand z buforu i przepłucz sensor roztworem PBST przez kolejne 200 sec.
  3. Po każdym przepłukaniu związaną toksynę usuwa się z sensora poprzez 100 sec płukania roztworem PBST o pH 5.0. Przywróci to sygnał do początkowego odczytu bazowego, co pozwoli na analizę kolejnej próbki na tym samym sensorze.
  4. Przed załadowaniem nowej próbki przepchnij niewielką ilość powietrza przez pętlę próbkową, aby usunąć pozostałości cieczy z poprzedniej próbki. Stosując procedurę opisaną w punktach 5.2-5.4, przeanalizowano do 12 próbek na jednym slajdzie bez znaczącej utraty sygnału bazowego.
  5. Analizę danych przeprowadzono za pomocą oprogramowania Scrubber 2, a do przygotowania rycin wykorzystano oprogramowanie Igor.

6. Reprezentatywne wyniki

Toksyna krztuśca (PT) jest toksyną typu AB, która przemieszcza się z powierzchni komórki do ER, zanim jej łańcuch A (PTS1) przedostanie się do cytozolu3, 12. Jak pokazano na Rysunku 2, nasz test translokacji oparty na SPR pozwolił wykryć PTS1 w cytozolu zaintoksykowanych komórek CHO. W cytozolu komórek niepoddanych działaniu toksyny nie odnotowano sygnału, co potwierdziło, że przeciwciało anty-PTS1 nie wykazuje reakcji krzyżowej z komponentami cytozolu gospodarza. Frakcja cytozolowa z komórek zaintoksykowanych w obecności brefeldyny A (BfA) również nie wygenerowała sygnału dodatniego. BfA zapobiega transportowi toksyny do miejsca translokacji w ER6-8, 12, 20-25, a tym samym uniemożliwia dostarczenie łańcucha A do cytozolu. Na koniec każdego pomiaru związana toksyna jest usuwana z płytki sensora. Pozwoliło to na przebadanie wielu próbek na jednej płytce sensora, zapewniając tym samym bezpośrednie porównanie wyników uzyskanych w różnych warunkach doświadczalnych.

CT jest kolejną toksyną typu AB, która translokuje do ER4. Na rysunku 3A w frakcji cytozolowej z komórek HeLa traktowanych CT wykryto CTA1. Podkreśla to, że nasza metodologia działa w przypadku wielu typów komórek i może być zastosowana do każdej toksyny, dla której dostępne jest przeciwciało przeciwko łańcuchowi A. Nie wykryto sygnału, gdy frakcja cytozolowa z komórek traktowanych CT była przepuszczana przez sensor SPR pokryty przeciwciałem przeciwko CTB (rys. 3B), co dowodzi, że do cytozolu wnika podjednostka CTA1, a nie wiążący się z komórką pentamer CTB. Rysunek 3C pokazuje, że sygnał z frakcji organelli wykracza poza skalę w porównaniu z wyraźnie słabszym sygnałem z frakcji cytozolowej. Jest to zgodne ze znaną niską wydajnością transportu CT do miejsca translokacji w ER6, 7, co z kolei ogranicza ilość toksyny, która może dotrzeć do cytozolu. Co więcej, frakcja organelli zawiera holotoksynę CT oraz CTA1 zlokalizowaną w ER, zatem wynikowy sygnał SPR dla frakcji organelli jest zawyżony ze względu na dodatkową masę pentameru CTB związanego z holotoksyną. W związku z tym nie jest praktyczne przedstawianie danych z frakcji organelli i cytozolowej na tym samym sensorgramie.

Nasz test pozwala na monitorowanie zależnego od czasu gromadzenia się translokowanej toksyny w cytozolu (Rys. 4). Komórki poddano działaniu CT w temperaturze 4 °C, która umożliwia wiązanie toksyny z błoną plazmatyczną, ale zapobiega internalizacji toksyny związanej z komórką. Po usunięciu niezwiązanej toksyny komórki ogrzano do 37 °C. W tej temperaturze może następować zarówno transport toksyny do ER, jak i translokacja łańcucha A do cytozolu. W cytozolu nie wykryto toksyny 15 minut po ogrzaniu do 37 °C. Odzwierciedlało to czas opóźnienia potrzebny na (i) transport holotoksyny do ER; (ii) dysocjację podjednostek A/B w ER; oraz (iii) eksport łańcucha A do cytozolu. Niewielką pulę toksyny cytozolowej wykryto po 30 minutach w 37 °C, a progresywnie większe ilości toksyny cytozolowej po interwałach pogoni wynoszących 45 i 60 minut. Jeszcze wyższe poziomy toksyny cytozolowej odnotowano po 5-godzinnym interwale pogoni17, co dowodzi ciągłego, długotrwałego dostarczania związanej z komórką toksyny do cytozolu gospodarza.

Nasz test może również wykrywać inhibicję translokacji toksyny do cytosolu (Rys. 5). Komórki traktowane 10% dimetylosulfotlenkiem (DMSO), chaperonem chemicznym zapobiegającym termicznemu rozfałdowaniu wyizolowanej podjednostki CTA1 (T. Banerjee i K. Teter, niepublikowane obserwacje), wykazywały niski poziom CTA1 w cytosolu w porównaniu z nieleczonymi komórkami kontrolnymi. Rozfałdowanie łańcucha A toksyny jest warunkiem koniecznym dla translokacji do cytosolu16-18, zatem indukcyjna stabilizacja CTA1 przez DMSO zapobiegła jego przemieszczaniu się z ER do cytosolu.

Stała szybkości asocjacji (ka) obliczona z eksperymentów SPR jest wprost proporcjonalna do stężenia ligandu w buforze perfuzyjnym14, 15, 26. Zatem możliwe jest określenie stężenia toksyny cytozolowej na podstawie wykresu przedstawiającego wartości ka dla wzorców toksyny w funkcji stężenia toksyny. Procedura ta została wykorzystana do ilościowego określenia blokady translokacji toksyny indukowanej przez DMSO przedstawionej na rysunku 5: krzywa wzorcowa wygenerowana z znanych stężeń toksyny posłużyła do obliczenia cytozolowego stężenia CTA1 wynoszącego 0,3 ng/mL dla komórek nieleczonych i 0,1 ng/mL dla komórek traktowanych DMSO (Rys. 6). Hamowanie rozfałdowania CTA1 przez DMSO spowodowało zatem 3-krotny spadek translokacji CTA1 z ER do cytozolu.

Schemat działania biosensora, ilustrujący krok po kroku wiązanie białek i analizę śladu SPR.
Rysunek 1. Przegląd protokołu. (A) Komórki inkubuje się z toksyną AB w temperaturze 4 °C, która umożliwia wiązanie toksyny z powierzchnią komórki, ale zapobiega jej endocytozie. Podjednostki A i B toksyny przedstawiono odpowiednio czerwonymi i niebieskimi kółkami. (B) Niewiązaną toksynę usuwa się z medium, a komórki ogrzewa się do 37 °C, aby promować endocytozę i transport retrogradny holotoksyny do ER. Dysocjacja holotoksyny zachodzi w ER, co pozwala wyizolowanemu łańcuchowi A przedostać się do cytosolu poprzez kanał(y) białkowe w błonie ER. (C) Komórki traktuje się digitoniną w celu selektywnej permeabilizacji błony plazmatycznej. (D) Wirowanie stosuje się do rozdzielenia komórek na osobne frakcje cytosolowe i organellowe. Cytosol jest wyciskany z komórki przez pory utworzone przez digitoninę i znajduje się w supernatancie. Nienaruszone, związane błoną organelle znajdują się we frakcji osadu. (E) Aby wykryć przetransportowaną pulę łańcucha A toksyny w cytosolu gospodarza, frakcję supernatantu przepuszcza się nad sensorem SPR pokrytym przeciwciałem przeciwko łańcuchowi A.

Graf interakcji białka PTS1; analiza sensorgramu; krzywe odpowiedzi zależne od stężenia.
Rysunek 2. Detekcja translokacji PTS1 do cytozolu gospodarza. Komórki CHO poddano znakowaniu impulsowemu w 4 °C przez 30 min przy użyciu 1 μg/mL PT. Następnie komórki inkubowano przez 3 hr w 37 °C w medium wolnym od toksyny bez dodatków (intoxicated) lub z dodatkiem 5 μg BfA/mL (+BfA intoxicated). Do rozdzielenia ekstraktów komórkowych na oddzielne frakcje organelli i cytozolu wykorzystano permeabilizację błony plazmatycznej za pomocą digitoniny. Do detekcji puli cytozolowej PTS1 z komórek nieleczonych lub traktowanych BfA użyto sensora SPR pokrytego przeciwciałem anty-PTS1. Standardy PTS1 przepuszczano przez sensor jako kontrole pozytywne, natomiast frakcję cytozolową z komórek niezatrutych przepuszczano przez płytkę sensora jako kontrolę negatywną. Po każdym pomiarze związany materiał próbkowy usuwano z płytki sensora.

Wykres przedstawiający oddziaływanie białek w frakcjach cytozolu i organelli w czasie; wyniki eksperymentu.
Rysunek 3. Detekcja translokacji CTA1 do cytozolu gospodarza. Komórki HeLa poddane znakowaniu impulsowemu w 4 °C z użyciem 1 μg/mL CT inkubowano przez 2 hr w 37 °C w medium wolnym od toksyny bez dodatków (intoxicated) lub z dodatkiem 5 μg BfA/mL (+BfA intoxicated). Do rozdziału ekstraktów komórkowych na oddzielne frakcje organelli i cytozolu wykorzystano permeabilizację błony plazmatycznej przy użyciu digitoniny. (A) Frakcje cytozolowe przepuszczano przez sensor SPR pokryty przeciwciałem anty-CTA. Znane ilości CTA posłużyły jako kontrole pozytywne, natomiast cytozol z komórek niepoddanych działaniu toksyny posłużył jako kontrola negatywna. (B) Frakcję cytozolową z komórek poddanych działaniu toksyny w obecności BfA przepuszczano przez sensor SPR pokryty przeciwciałem anty-CTB. Jako kontrolę pozytywną przez płytkę przepuszczano oczyszczony pentamer CTB. (C) Frakcję organelli solubilizowano w 1% Triton X-100 przed przepuszczeniem przez sensor SPR pokryty przeciwciałem anty-CTA. W celu porównania przez sensor przepuszczano również frakcję cytozolową (objętość końcowa 1 mL) z tego samego ekstraktu komórkowego oraz standard CTA. We wszystkich panelach związaną próbkę usuwano z sensora na koniec każdego cyklu pomiarowego.

Wykres chromatograficzny mikro RIU w funkcji czasu, przedstawiający wpływ stężenia i czasu trwania.
Rycina 4. Kinetyka wnikania CTA1 do cytozolu. Komórki HeLa poddane znakowaniu pulsacyjnemu w 4 °C przy użyciu 1 μg/mL CT inkubowano przez 15, 30, 45 lub 60 min w 37 °C w medium wolnym od toksyny. W celu wykrycia translokowanej puli toksyny, frakcje cytozolowe z komórek permeabilizowanych digitoniną przepuszczano przez sensor SPR pokryty przeciwciałem anty-CTA. Przez sensor przepuszczano również standardy CTA. Po każdym pomiarze związana próbka była usuwana z płytki sensora.

Wykres odpowiedzi wiązania CTA, mikro RIU w funkcji czasu; analiza próbek zainfekowanych i niezatrutych.
Rycina 5. Hamowanie translokacji CTA1 przez DMSO. Komórki HeLa poddane pulsowemu znakowaniu w 4 °C przy użyciu 1 μg/mL CT inkubowano przez 2 hr w 37 °C w medium wolnym od toksyny, bez dodatków (zainfekowane) lub z dodatkiem 10% DMSO (+DMSO zainfekowane). Aby wykryć pulę przelokalizowanej toksyny, frakcje cytozolowe z komórek permeabilizowanych digitoniną przepuszczano nad sensorem SPR pokrytym przeciwciałami anty-CTA. Standardy CTA (100, 10, 1 oraz 0,1 ng/mL) przepuszczano nad sensorem jako kontrole pozytywne; w celu przeskalowania przedstawiono jedynie standardy 1 i 0,1 ng/mL. Cytozol z komórek niezatrutych posłużył jako kontrola negatywna. Na koniec każdego pomiaru związana próbka była usuwana z płytki sensora.

Wykres korelacji szybkości asocjacji (ka) w funkcji stężenia CTA; punkty danych z linią trendu.
Rysunek 6. Obliczenie ilości CTA1 w cytozolu. Wartości ka dla standardów CTA z Rysunku 5 przedstawiono w funkcji stężenia toksyny. Otrzymaną krzywą wzorcową wykorzystano do wyznaczenia, na podstawie wartości ka próbek eksperymentalnych z Rysunku 5, stężenia CTA1 w cytozolu komórek nieleczonych oraz leczonych DMSO. Standardy toksyny przedstawiono jako wypełnione koła; cytozol nieleczony jako pusty kwadrat, a cytozol leczony DMSO jako puste koło. Przedstawiono średnie ± zakresy z dwóch niezależnych eksperymentów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Porównanie z istniejącą metodologią

Nasze badanie translokacji oparte na SPR stanowi szybką, czułą i ilościową metodę wykrywania dostarczania toksyny do cytozolu gospodarza. Technika ta nie wymaga znakowania radioizotopowego ani innych modyfikacji toksyny i może być zastosowana do każdej toksyny, dla której dostępny jest przeciwciało przeciwko łańcuchowi A toksyny. Istniejące metody monitorowania przenikania toksyny do cytozolu opierają się również na protokole frakcjonowania subkomórkowego w c...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca ta była finansowana z grantu NIH R01 AI073783 przyznanego K. Teter. Dziękujemy dr. Shane’owi Masseyowi za pomoc w opracowaniu protokołu frakcjonowania subkomórkowego oraz Helen Burress za krytyczne przeczytanie rękopisu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DigitoninaSigma-AldrichD141
EthanolAcros Organics61509-0010
DMEMInvitrogen11995065
Płódkowa surowica bydlęcaAtlanta BiologicalsS11550
Gangliozyd GM1Sigma-AldrichG7641
CTASigma-AldrichC2398
PTS1List182
NHS (N-hydroksysukcynimid)Pierce, Thermo Scientific24500
EDC (1-etylo-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid)Thermo Fisher Scientific, Inc.22981
EtanoloaminaSigma-AldrichE0135
PBSTMedicago09-8903-100
Przeciwciało anty-CTASanta Cruz Biotechnology, Inc.sc-80747
Przeciwciało anty-CTBCalbiochem227040
Przeciwciało anty-PTS1Santa Cruz Biotechnology, Inc.sc-57639
RefraktometrReichertSR7000, SR7000DC
Slajdy z sensorem SPRReichert13206060
Pompa strzykawkowaCole-Parmer780200C

Bibliografia

  1. Sandvig, K., van Deurs, B. Membrane traffic exploited by protein toxins. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 18, 1-24 (2002).
  2. Watson, P., Spooner, R. A. Toxin entry and trafficking in mammalian cells. Adv. Drug Deliv. Rev. 58, 1581-1596 (2006).
  3. Carbonetti, N. H. Pertussis toxin and adenylate cyclase toxin: key virulence factors of Bordetella pertussis and cell biology tools. Future Microbiol. 5, 455-469 (2010).
  4. Wernick, N. L. B., Chinnapen, D. J. -F., Cho, J. A., Lencer, W. I. Cholera toxin: an intracellular journey into the cytosol by way of the endoplasmic reticulum. Toxins. 2, 310-325 (2010).
  5. Lord, J. M., Roberts, L. M., Lencer, W. I. Entry of protein toxins into mammalian cells by crossing the endoplasmic reticulum membrane: co-opting basic mechanisms of endoplasmic reticulum-associated degradation. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 300, 149-168 (2005).
  6. Lencer, W. I. Entry of cholera toxin into polarized human intestinal epithelial cells. Identification of an early brefeldin A sensitive event required for A1-peptide generation. J. Clin. Invest. 92, 2941-2951 (1993).
  7. Orlandi, P. A., Curran, P. K., Fishman, P. H. Brefeldin A blocks the response of cultured cells to cholera toxin. Implications for intracellular trafficking in toxin action. J. Biol. Chem. 268, 12010-12016 (1993).
  8. Sandvig, K., Prydz, K., Hansen, S. H., van Deurs, B. Ricin transport in brefeldin A-treated cells: correlation between Golgi structure and toxic effect. J. Cell. Biol. 115, 971-981 (1991).
  9. Sandvig, K., Prydz, K., Ryd, M., van Deurs, B. Endocytosis and intracellular transport of the glycolipid-binding ligand Shiga toxin in polarized MDCK cells. J. Cell Biol. 113, 553-562 (1991).
  10. van Deurs, B. Estimation of the amount of internalized ricin that reaches the trans-Golgi network. J. Cell Biol. 106, 253-267 (1988).
  11. Tam, P. J., Lingwood, C. A. Membrane cytosolic translocation of verotoxin A1 subunit in target cells. Microbiology. 153, 2700-2710 (2007).
  12. Plaut, R. D., Carbonetti, N. H. Retrograde transport of pertussis toxin in the mammalian cell. Cell. Microbiol. 10, 1130-1139 (2008).
  13. Willander, M., Al-Hilli, S. Analysis of biomolecules using surface plasmons. Methods Mol. Biol. 544, 201-229 (2009).
  14. Homola, J. Present and future of surface plasmon resonance biosensors. Anal. Bioanal. Chem. 377, 528-539 (2003).
  15. Medaglia, M. V., Fisher, R. J. Protein-Protein Interactions. Golemis, E. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 255-272 (2002).
  16. Banerjee, T. Contribution of subdomain structure to the thermal stability of the cholera toxin A1 subunit. Biochemistry. 49, 8839-8846 (2010).
  17. Massey, S. Stabilization of the tertiary structure of the cholera toxin A1 subunit inhibits toxin dislocation and cellular intoxication. J. Mol. Biol. 393, 1083-1096 (2009).
  18. Taylor, M. A therapeutic chemical chaperone inhibits cholera intoxication and unfolding/translocation of the cholera toxin A1 subunit. PLoS ONE. 6, e18825-e18825 (2011).
  19. Taylor, M. Hsp90 is required for transfer of the cholera toxin A1 subunit from the endoplasmic reticulum to the cytosol. J. Biol. Chem. 285, 31261-31267 (2010).
  20. Donta, S. T., Beristain, S., Tomicic, T. K. Inhibition of heat-labile cholera and Escherichia coli enterotoxins by brefeldin A. Infect. Immun. 61, 3282-3286 (1993).
  21. Donta, S. T., Tomicic, T. K., Donohue-Rolfe, A. Inhibition of Shiga-like toxins by brefeldin. A. J. Infect. Dis. 171, 721-724 (1995).
  22. Nambiar, M. P., Oda, T., Chen, C., Kuwazuru, Y., Wu, H. C. Involvement of the Golgi region in the intracellular trafficking of cholera toxin. J. Cell. Physiol. 154, 222-228 (1993).
  23. Rapak, A., Falnes, P. O., Olsnes, S. Retrograde transport of mutant ricin to the endoplasmic reticulum with subsequent translocation to cytosol. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 3783-3788 (1997).
  24. Xu, Y., Barbieri, J. T. Pertussis toxin-mediated ADP-ribosylation of target proteins in Chinese hamster ovary cells involves a vesicle trafficking mechanism. Infect. Immun. 63, 825-832 (1995).
  25. Yoshida, T., Chen, C. C., Zhang, M. S., Wu, H. C. Disruption of the Golgi apparatus by brefeldin A inhibits the cytotoxicity of ricin, modeccin, and Pseudomonas toxin. Exp. Cell Res. 192, 389-395 (1991).
  26. Godber, B. Direct quantification of analyte concentration by resonant acoustic profiling. Clin. Chem. 51, 1962-1972 (2005).
  27. Bernardi, K. M., Forster, M. L., Lencer, W. I., Tsai, B. Derlin-1 facilitates the retro-translocation of cholera toxin. Mol. Biol. Cell. 19, 877-884 (2008).
  28. Wernick, N. L., De Luca, H., Kam, W. R., Lencer, W. I. N-terminal Extension of the Cholera Toxin A1-chain Causes Rapid Degradation after Retrotranslocation from Endoplasmic Reticulum to Cytosol. J. Biol. Chem. 285, 6145-6152 (2010).
  29. Simpson, J. C. Ricin A chain utilises the endoplasmic reticulum-associated protein degradation pathway to enter the cytosol of yeast. FEBS. Lett. 459, 80-84 (1999).
  30. Veithen, A., Raze, D., Locht, C. Intracellular trafficking and membrane translocation of pertussis toxin into host cells. Int. J. Med. Microbiol. 290, 409-413 (2000).
  31. Castro, M. G., McNamara, U., Carbonetti, N. H. Expression, activity and cytotoxicity of pertussis toxin S1 subunit in transfected mammalian cells. Cell. Microbiol. 3, 45-54 (2001).
  32. Schmitz, A., Herrgen, H., Winkeler, A., Herzog, V. Cholera toxin is exported from microsomes by the Sec61p complex. J. Cell Biol. 148, 1203-1212 (2000).
  33. Teter, K., Allyn, R. L., Jobling, M. G., Holmes, R. K. Transfer of the cholera toxin A1 polypeptide from the endoplasmic reticulum to the cytosol is a rapid process facilitated by the endoplasmic reticulum-associated degradation pathway. Infect. Immun. 70, 6166-6171 (2002).
  34. Winkeler, A., Godderz, D., Herzog, V., Schmitz, A. BiP-dependent export of cholera toxin from endoplasmic reticulum-derived microsomes. FEBS Lett. 554, 439-442 (2003).
  35. Yu, M., Haslam, D. B. Shiga toxin is transported from the endoplasmic reticulum following interaction with the luminal chaperone HEDJ/ERdj3. Infect. Immun. 73, 2524-2532 (2005).
  36. LaPointe, P., Wei, X., Gariepy, J. A role for the protease-sensitive loop region of Shiga-like toxin 1 in the retrotranslocation of its A1 domain from the endoplasmic reticulum lumen. J. Biol. Chem. 280, 23310-23318 (2005).
  37. Teter, K., Jobling, M. G., Sentz, D., Holmes, R. K. The cholera toxin A13 subdomain is essential for interaction with ADP-ribosylation factor 6 and full toxic activity but is not required for translocation from the endoplasmic reticulum to the cytosol. Infect. Immun. 74, 2259-2267 (2006).
  38. Redmann, V. Dislocation of ricin toxin a chains in human cells utilizes selective cellular factors. J. Biol. Chem. 286, 21231-21238 (2011).
  39. Yamaizumi, M., Mekada, E., Uchida, T., Okada, Y. One molecule of diphtheria toxin fragment A introduced into a cell can kill the cell. Cell. 15, 245-250 (1978).
  40. Bellisola, G. Reductive activation of ricin and ricin A-chain immunotoxins by protein disulfide isomerase and thioredoxin reductase. Biochem. Pharmacol. 67, 1721-1731 (2004).
  41. McKee, M. L., FitzGerald, D. J. Reduction of furin-nicked Pseudomonas exotoxin A: an unfolding story. Biochemistry. 38, 16507-16513 (1999).
  42. Orlandi, P. A. Protein-disulfide isomerase-mediated reduction of the A subunit of cholera toxin in a human intestinal cell line. J. Biol. Chem. 272, 4591-4599 (1997).
  43. Spooner, R. A. Protein disulphide-isomerase reduces ricin to its A and B chains in the endoplasmic reticulum. Biochem. J. 383, 285-293 (2004).
  44. Fujinaga, Y. Gangliosides that associate with lipid rafts mediate transport of cholera and related toxins from the plasma membrane to endoplasmic reticulm. Mol. Biol. Cell. 14, 4783-4793 (2003).
  45. Guerra, L. Cellular internalization of cytolethal distending toxin: a new end to a known pathway. Cell. Microbiol. 7, 921-934 (2005).
  46. Johannes, L., Tenza, D., Antony, C., Goud, B. Retrograde transport of KDEL-bearing B-fragment of Shiga toxin. J. Biol. Chem. 272, 19554-19561 (1997).
  47. Deeks, E. D. The low lysine content of ricin A chain reduces the risk of proteolytic degradation after translocation from the endoplasmic reticulum to the cytosol. Biochemistry. 41, 3405-3413 (2002).
  48. Hazes, B., Read, R. J. Accumulating evidence suggests that several AB-toxins subvert the endoplasmic reticulum-associated protein degradation pathway to enter target cells. Biochemistry. 36, 11051-11054 (1997).
  49. Rodighiero, C., Tsai, B., Rapoport, T. A., Lencer, W. I. Role of ubiquitination in retro-translocation of cholera toxin and escape of cytosolic degradation. EMBO Rep. 3, 1222-1227 (2002).
  50. Worthington, Z. E., Carbonetti, N. H. Evading the proteasome: absence of lysine residues contributes to pertussis toxin activity by evasion of proteasome degradation. Infect. Immun. 75, 2946-2953 (2007).
  51. Pande, A. H., Moe, D., Jamnadas, M., Tatulian, S. A., Teter, K. The pertussis toxin S1 subunit is a thermally unstable protein susceptible to degradation by the 20S proteasome. Biochemistry. 45, 13734-13740 (2006).
  52. Pande, A. H. Conformational instability of the cholera toxin A1 polypeptide. J. Mol. Biol. 374, 1114-1128 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wykrywanie cytozolufrakcjonowanie subkom rkowewirowanie r nicowesensor SPRprzeciwcia o antytoksycznefrakcja cytozolowakrzywa wzorcowa toksynypermeabilizacja digitonin
Wykrywanie translokacji toksyny do cytozolu gospodarza przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmonowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.