Opisano szybką i wydajną metodę wprowadzania obcego DNA o określonym znaczeniu do wcześniej przygotowanych szczepów akceptorowych, nazywanych szczepami z platformą lądowania (landing pad strains). Metoda ta umożliwia specyficzną dla miejsca integrację kasety DNA w zaprojektowanym locus platformy lądowania danego szczepu, poprzez koniugację i ekspresję integrazu ΦC31.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Inżynieria bakteryjnego chromosomu w konkretnych miejscach: wymiana kasety zapośredniczona przez integrazę $\Phi$C31 (IMCE)
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Chromosom bakteryjny może być wykorzystany do stabilnego utrzymywania obcego DNA w zakresie mega-baz1. Integracja z chromosomem pozwala uniknąć problemów takich jak replikacja plazmidów, stabilność plazmidów, niekompatybilność plazmidów oraz zmienność liczby kopii plazmidów. Metoda ta wykorzystuje integrazę specyficzną dla miejsca pochodzącą z faga (Φ) C312,3 bakterii Streptomyces. Integraza ΦC31 katalizuje bezpośrednią rekombinację pomiędzy dwoma specyficznymi miejscami w DNA: attB i attP (odpowiednio 34 i 39 bp)4. Rekombinacja ta jest stabilna i nieodwracalna5. Sekwencja „platformy lądowania” (LP), składająca się z genu oporności na spektynomycynę, aadA (SpR), oraz genu ß-glukuronidazy E. coli (uidA) flankowanego przez miejsca attP , została zintegrowana z chromosomami Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi oraz Agrobacterium tumefaciens odpowiednio w regionie międzygenowym, locus ampC oraz locus tetA . W niniejszym protokole wykorzystano S. meliloti . Skonstruowano również mobilizowane wektory donorowe zawierające miejsca attB flankujące gen wypełniający kodujący czerwone białko fluorescencyjne (rfp) oraz gen oporności na antybiotyk. W tym przykładzie zastosowano plazmid pJH110 oporny na gentamycynę. Gen rfp6 można zastąpić pożądaną konstrukcją przy użyciu enzymów SphI i PstI. Alternatywnie, syntetyczną konstrukcję flankowaną przez miejsca attB można subklonować do wektora mobilizowanego, takiego jak pK19mob7. Ekspresja genu integrazą ΦC31 (sklonowanego z pHS628) jest sterowana przez promotor lac na mobilizowanym plazmidzie o szerokim zakresie gospodarzy pRK78139.
Protokół kojenia tetraparentalnego jest wykorzystywany do przeniesienia kasety donora do szczepu LP, co pozwala na zastąpienie markerów w sekwencji LP kasetą donora. Powstałe komórki są trans-integrantami. Trans-integranty tworzą się z typową wydajnością na poziomie 0,5%. Trans-integranty są zazwyczaj znajdowane wśród pierwszych 500–1 000 kolonii przesiewanych pod kątem wrażliwości na antybiotyki lub w badaniu niebiesko-białym z użyciem kwasu 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-beta-D-glukuronowego (X-gluc). Niniejszy protokół zawiera procedury kojenia i selekcji służące do tworzenia oraz izolowania trans-integrantów.
Protokół
1. Przygotowanie hodowli
- Przygotować sterylne pożywki płynne: TY10 (5 g/l tryptonu, 3 g/l ekstraktu drożdżowego, 0,44 g/l chlorku wapnia dehydratu) oraz LB11 (10 g/l tryptonu, 5 g/l ekstraktu drożdżowego, 5 g/l chlorku sodu, pH 7).
- Zaszczepić z pojedynczej kolonii: SmUW227 (S. meliloti szczep LP: konstrukcja zostanie opisana w innym opracowaniu, szczegóły konstrukcji szczepu dostępne na żądanie) () do 5 ml pożywki TY z dodatkiem 50 μg/ml spectynomycyny. Zaszczepić następujące szczepy do 5 ml płynnej pożywki LB z dodatkiem odpowiedniego antybiotyku: E. coli DH5α12 zawierający pJC2, plazmid ekspresyjny integrazu, z 10 μg/ml tetracykliny; E. coli MT61613, mobilizator, z 10 μg/ml chloramfenikolu; oraz E. coli DH5α zawierający pJH110, plazmid kasety donora, z 5 μg/ml gentamycyny.
- Inkubować szczepy E. coli przez noc w temperaturze 37 °C przy stałym wstrząsaniu. Inkubować szczep S. meliloti w temperaturze 30 °C przez dwa dni z wstrząsaniem. Możliwe jest uzyskanie kultury S. meliloti przez noc przy zastosowaniu większego inokulum (podpłytowanie 1:500 z kultury nasyconej).
2. Przygotowanie i mieszanie hodowli
- Przemyć 1,5 ml kultury dla każdego szczepu, zbierając osad komórkowy poprzez wirowanie przy 17,000 x g przez 30 sekund i resuspensując w 1 ml sterylnego 0,85% NaCl; powtórzyć raz.
- Resuspender osad w 100 μl sterylnego 0,85% NaCl.
- Nanieść punktowo 10 μl przemytej kultury każdego szczepu na zwykłą płytkę z agarem TY. Plamki te stanowią kontrolę.
- Przenieść do sterylnej probówki po 40 μl każdego szczepu z wyłączeniem E. coli DH5α12 zawierającego pJC2, wymieszać i nanieść punktowo 120 μl tej mieszaniny na zwykłą płytkę z agarem TY. Plamka ta stanowi ujemną kontrolę braku integrazji.
- Przenieść do sterylnej probówki po 40 μl każdego szczepu, wymieszać i nanieść punktowo 160 μl tej mieszaniny na zwykłą płytkę z agarem TY. Plamka ta stanowi miejsce kojenia IMCE.
- Pozostawić plamki do wyschnięcia w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
- Zapieczętować płytki i inkubować w temperaturze 30 °C przez noc.
3. Izolacja trans-integrantów
- Wymaż plamki kontrolne oraz plamkę IMCE na płytkach z agarem TY uzupełnionym o 200 μg/ml streptomycyny (SmUW227 opiera się na szczepie Rm1021, który posiada mutację zapewniającą wysoką odporność na streptomycynę14) i 30 μg/ml gentamycyny.
- W celu obliczenia wydajności IMCE, resuspenduj około ¼ plamki po kojeniu IMCE w 500 μl sterylnego 0,85% NaCl. Wykonaj dziesięciokrotne rozcieńczenia szeregowe do 10-7. Wysiej rozcieńczenia od 10-2 do 10-5 na płytkach z agarem TY uzupełnionym o 200 μg/ml streptomycyny i 30 μg/ml gentamycyny, aby wyselekcjonować trans-integranty. Wysiej rozcieńczenia od 10-3 do 10-7 na płytkach z agarem TY uzupełnionym o 200 μg/ml streptomycyny, aby wyselekcjonować zarówno trans-integranty, jak i potencjalnych biorców, tj. całkowitą liczbę biorców.
- W celu izolacji trans-integrantów bez markerów resuspenduj około jednej czwartej plamki po kojeniu IMCE w 500 μl sterylnego 0,85% NaCl. Wykonaj dziesięciokrotne rozcieńczenia szeregowe do 10-6. Wysiej rozcieńczenia od 10-4 do 10-6 na czterech płytkach z agarem TY uzupełnionym o 200 μg/ml streptomycyny i 200 μg/ml X-gluc.
- Inkubuj płytki w temperaturze 30 °C przez 3 dni.
- Obejrzyj trans-integranty RFP pod światłem zielonym (525 nm) i przez filtr czerwony (>610 nm) 15.
- Oblicz procent wydajności IMCE jako stosunek CFU trans-integrantów do CFU całkowitej liczby biorców. Około połowa trans-integrantów przeszła prawdziwą wymianę kasety, co czyni je białymi i wrażliwymi na spectynomycynę.
- Aby zidentyfikować trans-integranty bez markerów (gdzie wektor donora nie zawiera Gmr, jak w pJH110), wyszukaj białe kolonie (wydłużony okres inkubacji, dodatkowe 1-2 dni w temperaturze pokojowej, wzmocni różnicowanie kolonii za pomocą X-gluc, co jest niezbędne w przypadku S. meliloti SmUW227); potwierdź wrażliwość kolonii na spectynomycynę, przesiewając ją na płytce z agarem TY bez antybiotyków oraz na płytce z agarem TY zawierającej 100 μg/ml spectynomycyny.
4. Reprezentatywne wyniki
Po trzech dniach inkubacji na podłożu TY uzupełnionym o streptomycynę i gentamycynę, smugi kontrolne nie powinny wykazywać wzrostu. Smuga IMCE powinna wykazywać wzrost zlewający się w miejscu pierwszego posiewu i liczne kolonie w drugim posiewie, jak pokazano na Rysunku 2. Efektywność transintegracji, wyrażona jako procent transintegrantów w stosunku do całkowitej liczby biorców, powinna mieścić się w zakresie 0,5%. Około połowa transintegrantów będzie wrażliwa na spektynomycynę i biała, co wskazuje na zajście rzeczywistej wymiany kasety. Transintegranty zawierające testową kasetę donora rfp z pJH110 powinny wykazywać wyraźną fluorescencję RFP podczas obserwacji w świetle zielonym (525 nm) i przez filtr czerwony (>610 nm) 15.
Rysunek 1. Ilustracja mieszaniny koniugacyjnej: Dzięki ekspresji genów transferu z pRK600 wszystkie plazmidy są przenoszone losowo z komórki do komórki. Transfer ten prowadzi do powstania trans-integrantów w mieszaninie poprzez nabycie przez szczep LP dwóch plazmidów wymaganych do IMCE: plazmidu pomocniczego integrazą (int) pJC2 oraz plazmidu donora pJH110. Kaseta donora z niereplikującego się plazmidu donora (pJH110) zostaje wymieniona poprzez aktywność integrazą ΦC31 z markerami kasety LP na chromosomie, co skutkuje utratą markerów LP (Spr i uidA) oraz zachowaniem kasety donora (rfp i Gmr) w powstałym trans-integrancie.
Rysunek 2. A: Płytka z punktami krzyżowania na nie wybiórczej pożywce TY, przedstawiająca wysuszone mieszaniny komórek na powierzchni agaru. B: Punkty krzyżowania wymazane na płytce z streptomycyną, gentamycyną i X-gluk, od górnego lewego rogu zgodnie z ruchem wskazówek zegara: kontrola bez integrazą, IMCE w S. meliloti, kontrola E. coli DH5α zawierająca pJC2, kontrola E. coli DH5a zawierająca pJH110, kontrola E. coli MT616 oraz kontrola S. meliloti UW227. C: Rozcieńczenie 10-2 resuspensji punktu krzyżowania na agarze TY ze streptomycyną i X-gluk. D: Rozcieńczenie 10-2 resuspensji punktu krzyżowania na agarze TY ze streptomycyną, gentamycyną i X-gluk (niebieskie kolonie to pojedyncze rekombinanty, białe kolonie przeszły prawidłową wymianę kasety). E: Rozcieńczenie 10-2 resuspensji punktu krzyżowania na agarze TY ze streptomycyną i X-gluk, wykazujące brak fluorescencji. F: Rozcieńczenie 10-2 resuspensji punktu krzyżowania na agarze TY ze streptomycyną, gentamycyną i X-gluk, wykazujące dwa poziomy fluorescencji (jaśniejsze kolonie odpowiadają koloniom niebieskim i mają wyższą ekspresję rfp, prawdopodobnie z powodu odczytu promotora z sekwencji wektora; kolonie, które przeszły prawidłową wymianę kasety, zawierają RFP z samym bezpośrednim promotorem, bez odczytu z promotora lac w wektorze, który jest nieobecny).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Technika IMCE umożliwia efektywną integrację pojedynczej kasety DNA flankowanej sekwencjami attB w locus LP wcześniej zmodyfikowanego szczepu. Po sklonowaniu pożądanego konstruktu w miejsce rfp w celu stworzenia kasety donora, technika ta nie wymaga późniejszego oczyszczania DNA i transformacji, co czyni ją bardzo niezawodną. Kluczowe jest uwzględnienie odpowiednich kontroli wzrostu, aby upewnić się, że oporność na antybiotyk wynika z powstania trans-integrantów, a nie z innych czynników.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Podziękowania dla Margaret C.M. Smith za uprzejme udostępnienie klonu integrazu
Wsparcie finansowe zapewnione przez:
Genome Canada/Genome Prairie
Granty NSERC Discovery oraz Strategic Project
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Streptomycyna | BioShop Canada | STP101 | |
| Spektynomycyna | BioShop Canada | SPE201 | |
| Gentamycyna | BioShop Canada | GTA202 | |
| Chloramphenikol | BioShop Canada | CLR201 | |
| Tetracyklina | BioShop Canada | TET701 | |
| Kanamycyna | BioShop Canada | KAN201 | |
| Agar klasy bakteriologicznej | BioShop Canada | AGR001 | |
| Tryptona | BioShop Canada | TRP402 | |
| Ekstrakt drożdżowy | BioShop Canada | YEX401 | |
| Chlorek sodu | BioShop Canada | SOD001 | |
| Chlorek wapnia | BioShop Canada | CCL444 | |
| X-gluc | Gold Biotechnology | G1281C1 | |
| Szczep E. coli MT616 | Dostępny na zapytanie | Używany również poza naszym laboratorium | |
| Szczep E. coli pJC2 | Wewnętrzny | ||
| Szczep E. coli pJH110 | Wewnętrzny | ||
| Szczep SmUW227 | Wewnętrzny |
Bibliografia
- Itaya, M., Tsuge, K., Koizumi, M., Fujita, K. Combining two genomes in one cell: Stable cloning of the Synechocystis PCC6803 genome in the Bacillus subtilis 168 genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15971-15976 (2005).
- Kushtoss, S., Rao, R. N. Analysis of the Integration Function of the Streptomycete Bacteriophage FC31. J. Mol. Biol. 222, 897-908 (1991).
- Brown, W. R., Lee, N. C., Xu, Z., Smith, M. C. Serine recombinases as tools for genome engineering. Methods. 53, 372-379 (2011).
- Groth, A. C., Olivares, E. C., Thyagarajan, B., Calos, M. P. A phage integrase directs efficient site-specific integration in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5995-6000 (2000).
- Rowley, P. A., Smith, M. C., Younger, E. A motif in the C-terminal domain of FC31 integrase controls the directionality of recombination. Nuc. Acid. Res. 36, 3879-3891 (2008).
- Campbell, R. E. A monomeric red fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 7877-7882 (2002).
- Schafer, A. Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutumicum. Gene. 145, 69-73 (1994).
- Thorpe, H. M., Smith, M. C. In vitro site-specific integration of bacteriophage DNA catalyzed by a recombinase of the resolvase/invertase family. Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 5505-5510 (1998).
- Jones, J. D., Gutterson, N. An efficient mobilizable cosmid vector, pRK7813, and its use in a rapid method for marker exchange in Pseudomonas fluorescens strain HV37a. Gene. 61, 299-306 (1987).
- Beringer, J. E. R Factor transfer in Rhizobium leguminosarum. J. Gen. Microbiol. 84, 188-198 (1974).
- Lennox, E. S. Transduction of linked genetic characters of the host by bacteriophage P1. Virology. 1, 190-206 (1955).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166, 557-580 (1983).
- Charles, T. C., Finan, T. M. Genetic map of Rhizobium meliloti megaplasmid pRmeSU47b. J. Bacteriol. 172, 2469-2476 (1990).
- Leigh, J. A., Signer, E. R., Walker, G. C. Exopolysaccharide-deficient mutants of Rhizobium meliloti that form ineffective nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6231-6235 (1985).
- Heil, J. R., Nordeste, R. F., Charles, T. C. The fluorescence theatre: a cost-effective device using theatre gels for fluorescent protein and dye screening. Can. J. Microbiol. 57, 339-342 (2011).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).
- Lesic, B., Rahme, L. G. Use of the lambda Red recombinase system to rapidly generate mutants in Pseudomonas aeruginosa. BMC Mol. Biol.. 9, 20-20 (2008).
- Choi, K. -H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat. Protocols. 1, 153-161 (2006).
- Thomason, L. C., Calendar, R., Ow, D. W. Gene insertion and replacement in Schizosaccharomyces pombe mediated by the Streptomyces bacteriophage FC31 site-specific recombination system. Molecular Genetics and Genomics. 265, 1031-1038 (2001).
- Katzen, F. Gateway recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin. Drug Discovery. , 571-586 (2007).
- Charles, T. C., Doty, S. L., Nester, E. W. Construction of Agrobacterium strains by electroporation of genomic DNA and its utility in analysis of chromosomal virulence mutations. Appl. Environ. Microbiol. 60, 4192-4194 (1994).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
