Artykuł metodologiczny

Inżynieria bakteryjnego chromosomu w konkretnych miejscach: wymiana kasety zapośredniczona przez integrazę $\Phi$C31 (IMCE)

DOI:

10.3791/3698

⸱

16 marca 2012

 ,  , 
1Biology, University of Waterloo

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano szybką i wydajną metodę wprowadzania obcego DNA o określonym znaczeniu do wcześniej przygotowanych szczepów akceptorowych, nazywanych szczepami z platformą lądowania (landing pad strains). Metoda ta umożliwia specyficzną dla miejsca integrację kasety DNA w zaprojektowanym locus platformy lądowania danego szczepu, poprzez koniugację i ekspresję integrazu ΦC31.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chromosom bakteryjny może być wykorzystany do stabilnego utrzymywania obcego DNA w zakresie mega-baz1. Integracja z chromosomem pozwala uniknąć problemów takich jak replikacja plazmidów, stabilność plazmidów, niekompatybilność plazmidów oraz zmienność liczby kopii plazmidów. Metoda ta wykorzystuje integrazę specyficzną dla miejsca pochodzącą z faga (Φ) C312,3 bakterii Streptomyces. Integraza ΦC31 katalizuje bezpośrednią rekombinację pomiędzy dwoma specyficznymi miejscami w DNA: attB i attP (odpowiednio 34 i 39 bp)4. Rekombinacja ta jest stabilna i nieodwracalna5. Sekwencja „platformy lądowania” (LP), składająca się z genu oporności na spektynomycynę, aadA (SpR), oraz genu ß-glukuronidazy E. coli (uidA) flankowanego przez miejsca attP , została zintegrowana z chromosomami Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi oraz Agrobacterium tumefaciens odpowiednio w regionie międzygenowym, locus ampC oraz locus tetA . W niniejszym protokole wykorzystano S. meliloti . Skonstruowano również mobilizowane wektory donorowe zawierające miejsca attB flankujące gen wypełniający kodujący czerwone białko fluorescencyjne (rfp) oraz gen oporności na antybiotyk. W tym przykładzie zastosowano plazmid pJH110 oporny na gentamycynę. Gen rfp6 można zastąpić pożądaną konstrukcją przy użyciu enzymów SphI i PstI. Alternatywnie, syntetyczną konstrukcję flankowaną przez miejsca attB można subklonować do wektora mobilizowanego, takiego jak pK19mob7. Ekspresja genu integrazą ΦC31 (sklonowanego z pHS628) jest sterowana przez promotor lac na mobilizowanym plazmidzie o szerokim zakresie gospodarzy pRK78139.

Protokół kojenia tetraparentalnego jest wykorzystywany do przeniesienia kasety donora do szczepu LP, co pozwala na zastąpienie markerów w sekwencji LP kasetą donora. Powstałe komórki są trans-integrantami. Trans-integranty tworzą się z typową wydajnością na poziomie 0,5%. Trans-integranty są zazwyczaj znajdowane wśród pierwszych 500–1 000 kolonii przesiewanych pod kątem wrażliwości na antybiotyki lub w badaniu niebiesko-białym z użyciem kwasu 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-beta-D-glukuronowego (X-gluc). Niniejszy protokół zawiera procedury kojenia i selekcji służące do tworzenia oraz izolowania trans-integrantów.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie hodowli

  1. Przygotować sterylne pożywki płynne: TY10 (5 g/l tryptony, 3 g/l ekstraktu drożdżowego, 0.44 g/l bezwodnego chlorku wapnia) oraz LB11 (10 g/l tryptony, 5 g/l ekstraktu drożdżowego, 5 g/l chlorku sodu, pH 7).
  2. Zaszczepić pojedynczą kolonię: SmUW227 (S. meliloti szczep LP: konstrukcja zostanie opisana w innym opracowaniu, szczegóły konstrukcji szczepu dostępne na żądanie) () do 5 ml pożywki TY z dodatkiem 50 μg/ml spektynomycyny. Zaszczepić poniższe szczepy do 5 ml płynnej pożywki LB, uzupełnionej o odpowiedni antybiotyk: E. coli DH5α12 zawierający pJC2, plazmid ekspresyjny integrazu, z dodatkiem 10 μg/ml tetracykliny; E. coli MT61613, szczep mobilizujący, z dodatkiem 10 μg/ml chloramfenikolu; oraz E. coli DH5α zawierający pJH110, plazmid kasety donorowej, z dodatkiem 5 μg/ml gentamycyny.
  3. Inkubować szczepy E. coli przez noc w temperaturze 37 °C przy ciągłym wytrząsaniu. Inkubować szczep S. meliloti w temperaturze 30 °C przez dwa dni z wytrząsaniem. Możliwe jest uzyskanie kultury S. meliloti przez noc przy zastosowaniu większego inokulum (podział 1:500 z kultury nasyconej).

2. Przygotowanie i mieszanie kultur

  1. Przemyć 1,5 ml kultury każdego szczepu, zbierając osad komórkowy poprzez wirowanie przy 17,000 x g przez 30 sekund i resuspending w 1 ml sterylnego 0,85% NaCl; powtórzyć raz.
  2. Resuspender osad w 100 μl sterylnego 0,85% NaCl.
  3. Nanieść pojedynczo po 10 μl przemytej kultury każdego szczepu na zwykłą płytkę z agarem TY. Plamki te stanowią punkty kontrolne.
  4. Do sterylnej probówki dodać po 40 μl każdego szczepu z wyjątkiem E. coli DH5α12 zawierającego pJC2, wymieszać i nanieść 120 μl tej mieszaniny na zwykłą płytkę z agarem TY. Plamka ta stanowi ujemną kontrolę bez integrazu.
  5. Do sterylnej probówki dodać po 40 μl każdego szczepu, wymieszać i nanieść 160 μl tej mieszaniny na zwykłą płytkę z agarem TY. Plamka ta stanowi punkt kojenia IMCE.
  6. Pozostawić plamki do wyschnięcia w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
  7. Uszczelnić płytki i inkubować w temperaturze 30 °C przez noc.

3. Izolacja trans-integrantów

  1. Wykulturuj kontrolne plamki oraz plamki IMCE na płytkach z agarem TY uzupełnionym o 200 μg/ml streptomycyny (SmUW227 opiera się na szczepie Rm1021, który posiada mutację nadającą wysoką odporność na streptomycynę14) oraz 30 μg/ml gentamycyny.
  2. W celu obliczenia wydajności IMCE, resuspenduj około ¼ plamki kojarzenia IMCE w 500 μl sterylnego 0,85% NaCl. Przygotuj 10-krotne rozcieńczenia seryjne do 10-7. Rozcieńczenia od 10-2 do 10-5 wysiej na płytki z agarem TY uzupełnionym o 200 μg/ml streptomycyny i 30 μg/ml gentamycyny, aby wyselekcjonować trans-integranty. Rozcieńczenia od 10-3 do 10-7 wysiej na płytki z agarem TY uzupełnionym o 200 μg/ml streptomycyny, aby wyselekcjonować zarówno trans-integranty, jak i potencjalne biorcy, tj. całkowitą liczbę biorców.
  3. W celu izolacji bezmarkerowych trans-integrantów resuspenduj około jednej czwartej plamki kojarzenia IMCE w 500 μl sterylnego 0,85% NaCl. Przygotuj 10-krotne rozcieńczenia seryjne do 10-6. Rozcieńczenia od 10-4 do 10-6 wysiej na cztery płytki z agarem TY uzupełnionym o 200 μg/ml streptomycyny i 200 μg/ml X-gluc.
  4. Inkubuj płytki w temperaturze 30 °C przez 3 dni.
  5. Obejrzyj trans-integranty RFP w świetle zielonym (525 nm) i przez filtr czerwony (>610 nm) 15.
  6. Oblicz procentową wydajność IMCE jako stosunek CFU trans-integrantów do CFU całkowitej liczby biorców. Około połowa trans-integrantów przeszła prawdziwą wymianę kasety, co czyni je białymi i wrażliwymi na spektynocynę.
  7. Aby znaleźć bezmarkerowe trans-integranty (w których wektor donora nie zawiera Gmr, tak jak w pJH110), wyszukaj białą kolonię (wydłużony okres inkubacji, dodatkowe 1-2 dni w temperaturze pokojowej, wzmocni różnicowanie kolonii za pomocą X-gluc, co jest konieczne u S. meliloti SmUW227); potwierdź wrażliwość kolonii na spektynocynę, przeprowadzając przesiew na płytce z agarem TY bez antybiotyków oraz na płytce z agarem TY zawierającej 100 μg/ml spektynocyny.

4. Reprezentatywne wyniki

Po trzech dniach inkubacji na podłożu TY uzupełnionym o streptomycynę i gentamycynę, kreski kontrolne nie powinny wykazywać wzrostu. Kreska IMCE powinna wykazywać wzrost zlewający się w miejscu pierwszego posiewu oraz liczne kolonie w drugim posiewie, co przedstawiono na rysunku 2. Wydajność trans-integracji, wyrażona jako procent trans-integrantów w stosunku do całkowitej liczby biorców, powinna wynosić około 0,5%. Około połowa trans-integrantów będzie wrażliwa na spektynocynę i będzie miała biały kolor, co świadczy o zajściu prawidłowej wymiany kasety. Trans-integranty zawierające testerową kasetę donorową rfp z pJH110 powinny wykazywać wyraźną fluorescencję RFP podczas obserwacji w świetle zielonym (525 nm) i przez filtr czerwony (>610 nm) 15.

Schemat koniugacji bakteryjnej; transfer plazmidów; integracja genetyczna; analiza oporności na antybiotyki.
Rycina 1. Ilustracja mieszaniny koniugacyjnej: Dzięki ekspresji genów transferu z pRK600 wszystkie plazmidy są losowo przenoszone z komórki do komórki. Transfer ten prowadzi do powstania trans-integrantów w mieszaninie poprzez nabycie przez szczep LP dwóch plazmidów niezbędnych do IMCE: pomocniczego plazmidu integrazowego (int) pJC2 oraz plazmidu donora pJH110. Kaseta donora z niereplikującego się plazmidu donora (pJH110) zostaje wymieniona dzięki aktywności integrazy ΦC31 z markerami kasety LP w chromosomie, co skutkuje utratą markerów LP (Spr i uidA) i zachowaniem kasety donora (rfp i Gmr) w powstałym trans-integrancie.

Eksperymenty na szalkach Petriego, hodowle bakteryjne, porównanie wzrostu kolonii, obserwacja sześciu próbek
Rycina 2. A: Płytka z miejscami kojenia na nie selektywnej pożywce TY, pokazująca wysuszone mieszaniny komórek na powierzchni agaru. B: Miejsca kojenia wykreślone na płytce z streptomycyną, gentamiciną i X-gluc; zaczynając od lewego górnego rogu zgodnie z ruchem wskazówek zegara: kontrola bez integrazą, IMCE w S. meliloti, kontrola E. coli DH5α zawierająca pJC2, kontrola E. coli DH5a zawierająca pJH110, kontrola E. coli MT616 oraz kontrola S. meliloti UW227. C: Rozcieńczenie 10-2 resuspensji z miejsca kojenia na agarze TY z streptomycyną i X-gluc. D: Rozcieńczenie 10-2 resuspensji z miejsca kojenia na agarze TY ze streptomycyną, gentamiciną i X-gluc (niebieskie kolonie to pojedyncze rekombinanty, kolonie białe przeszły rzeczywistą wymianę kasety). E: Rozcieńczenie 10-2 resuspensji z miejsca kojenia na agarze TY ze streptomycyną i X-gluc, wykazujące brak fluorescencji. F: Rozcieńczenie 10-2 resuspensji z miejsca kojenia na agarze TY ze streptomycyną, gentamiciną i X-gluc, wykazujące dwa poziomy fluorescencji (jaśniejsze kolonie odpowiadają koloniom niebieskim i mają wyższą ekspresję rfp, prawdopodobnie z powodu przeczytania promotora z sekwencji wektora, podczas gdy kolonie, które przeszły rzeczywistą wymianę kasety, zawierają RFP wyłącznie z jego bezpośrednim promotorem, bez przeczytania z promotora lac w wektorze, którego w nich nie ma.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technika IMCE umożliwia efektywną integrację pojedynczej kasety DNA flankowanej sekwencjami attB w locus LP wcześniej zmodyfikowanego szczepu. Po sklonowaniu pożądanego konstruktu w miejsce rfp w celu stworzenia kasety donora, technika ta nie wymaga późniejszego oczyszczania DNA i transformacji, co czyni ją bardzo niezawodną. Kluczowe jest uwzględnienie odpowiednich kontroli wzrostu, aby upewnić się, że oporność na antybiotyk wynika z powstania trans-integrantów, a nie z innych czynników.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podziękowania dla Margaret C.M. Smith za uprzejme udostępnienie klonu integrazu
Wsparcie finansowe zapewnione przez:
Genome Canada/Genome Prairie
Granty NSERC Discovery oraz Strategic Project

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
StreptomycynaBioShop CanadaSTP101
SpektynomycynaBioShop CanadaSPE201
GentamycynaBioShop CanadaGTA202
ChloramphenikolBioShop CanadaCLR201
TetracyklinaBioShop CanadaTET701
KanamycynaBioShop CanadaKAN201
Agar klasy bakteriologicznejBioShop CanadaAGR001
TryptonaBioShop CanadaTRP402
Ekstrakt drożdżowyBioShop CanadaYEX401
Chlorek soduBioShop CanadaSOD001
Chlorek wapniaBioShop CanadaCCL444
X-glucGold BiotechnologyG1281C1
Szczep E. coli MT616Dostępny na zapytanieUżywany również poza naszym laboratorium
Szczep E. coli pJC2Wewnętrzny
Szczep E. coli pJH110Wewnętrzny
Szczep SmUW227Wewnętrzny

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Itaya, M., Tsuge, K., Koizumi, M., Fujita, K. Combining two genomes in one cell: Stable cloning of the Synechocystis PCC6803 genome in the Bacillus subtilis 168 genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15971-15976 (2005).
  2. Kushtoss, S., Rao, R. N. Analysis of the Integration Function of the Streptomycete Bacteriophage FC31. J. Mol. Biol. 222, 897-908 (1991).
  3. Brown, W. R., Lee, N. C., Xu, Z., Smith, M. C. Serine recombinases as tools for genome engineering. Methods. 53, 372-379 (2011).
  4. Groth, A. C., Olivares, E. C., Thyagarajan, B., Calos, M. P. A phage integrase directs efficient site-specific integration in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5995-6000 (2000).
  5. Rowley, P. A., Smith, M. C., Younger, E. A motif in the C-terminal domain of FC31 integrase controls the directionality of recombination. Nuc. Acid. Res. 36, 3879-3891 (2008).
  6. Campbell, R. E. A monomeric red fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 7877-7882 (2002).
  7. Schafer, A. Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutumicum. Gene. 145, 69-73 (1994).
  8. Thorpe, H. M., Smith, M. C. In vitro site-specific integration of bacteriophage DNA catalyzed by a recombinase of the resolvase/invertase family. Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 5505-5510 (1998).
  9. Jones, J. D., Gutterson, N. An efficient mobilizable cosmid vector, pRK7813, and its use in a rapid method for marker exchange in Pseudomonas fluorescens strain HV37a. Gene. 61, 299-306 (1987).
  10. Beringer, J. E. R Factor transfer in Rhizobium leguminosarum. J. Gen. Microbiol. 84, 188-198 (1974).
  11. Lennox, E. S. Transduction of linked genetic characters of the host by bacteriophage P1. Virology. 1, 190-206 (1955).
  12. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166, 557-580 (1983).
  13. Charles, T. C., Finan, T. M. Genetic map of Rhizobium meliloti megaplasmid pRmeSU47b. J. Bacteriol. 172, 2469-2476 (1990).
  14. Leigh, J. A., Signer, E. R., Walker, G. C. Exopolysaccharide-deficient mutants of Rhizobium meliloti that form ineffective nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6231-6235 (1985).
  15. Heil, J. R., Nordeste, R. F., Charles, T. C. The fluorescence theatre: a cost-effective device using theatre gels for fluorescent protein and dye screening. Can. J. Microbiol. 57, 339-342 (2011).
  16. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).
  17. Lesic, B., Rahme, L. G. Use of the lambda Red recombinase system to rapidly generate mutants in Pseudomonas aeruginosa. BMC Mol. Biol.. 9, 20-20 (2008).
  18. Choi, K. -H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat. Protocols. 1, 153-161 (2006).
  19. Thomason, L. C., Calendar, R., Ow, D. W. Gene insertion and replacement in Schizosaccharomyces pombe mediated by the Streptomyces bacteriophage FC31 site-specific recombination system. Molecular Genetics and Genomics. 265, 1031-1038 (2001).
  20. Katzen, F. Gateway recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin. Drug Discovery. , 571-586 (2007).
  21. Charles, T. C., Doty, S. L., Nester, E. W. Construction of Agrobacterium strains by electroporation of genomic DNA and its utility in analysis of chromosomal virulence mutations. Appl. Environ. Microbiol. 60, 4192-4194 (1994).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

integraza specyficzna dla miejscaintegraza PhiC31sekwencja landing padmobilizowane wektory donoraprotok kojenia tetraparentalnegoselekcja trans integrant wbadanie wra liwo ci na antybiotykiselekcja niebiesko bia a

Powiązane artykuły