Artykuł metodologiczny

Indukowana przez pasożyta genetycznie sterowana autoimmunologiczna choroba serca Chagasa w modelu kurzym

17.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3716

⸱

29 lipca 2012

 ,  ,  , 
1Chagas Disease Multidisciplinary Research Laboratory, University of Brasilia

W tym artykule

Podsumowanie

Inokulacja Trypanosoma cruzi do zapłodnionych jaj przed inkubacją powoduje integrację minikołk kDNA pasożyta w genomie komórek embrionalnych. Krzyżowanie wykazuje pionowy transfer mutacji na potomstwo. kDNA integruje się z regionami kodującymi w kilku chromosomach, a kurczaki giną w wyniku zapalnej autoimmunologicznej choroby serca.

Streszczenie

Ostre infekcje *Trypanosoma cruzi* nabyte w okresie niemowlęcym i dzieciństwie wydają się bezobjawowe, jednak około jednej trzeciej przypadków z przewlekłą infekcją wykazuje objawy choroby Chagasa po trzech dekadach lub później. Autoimmunizacja oraz przetrwanie pasożyta to konkurujące ze sobą teorie wyjaśniające patogenezę choroby Chagasa. 1, 2Aby rozróżnić role, jakie odgrywa utrzymywanie się pasożyta oraz autoimmunizacja w chorobie Chagasa, inokulujemy *T. cruzi* w komorze powietrznej zapłodnionych jaj. Dojrzały układ odpornościowy kurczaka stanowi szczelną barierę biologiczną przeciwko T. cruzi a infekcja zostaje wyeliminowana po wykształceniu się układu odpornościowego pod koniec pierwszego tygodnia wzrostu 3Pisklęta w momencie wyklucia są wolne od pasożytów, jednak w ich genomie zachowane pozostają zintegrowane minikoła mitochondrialnego kDNA (kinetoplastycznego DNA) pasożytów, które są przekazywane potomstwu. Potwierdzenie integracji minikół kDNA w genomie kurczaka uzyskano za pomocą ukierunkowanej metody prime TAIL-PCR, hybrydyzacji Southern, klonowania oraz sekwencjonowania. 3, 4Integracje minikoł kDNA przerywają ramki odczytu dla transkrypcji oraz czynników układu odpornościowego, fosfatazy (GTPaza), cyklazy adenylanowej i fosforylaz (PKC, aktywator NF-Kappa B, PI-3K) związanych z fizjologią, wzrostem i różnicowaniem komórek. 3, 5-7or innych funkcji genów. W przypadku kurcząt z mutacją kDNA obserwuje się ciężkie zapalenie mięśnia sercowego wywołane odrzuceniem docelowych włókien serca przez efektorowe limfocyty cytotoksyczne, co objawia się zapalną kardiomiopatią podobną do tej występującej w przebiegu choroby Chagasa u ludzi. Co istotne, u dorosłych kurcząt z pęknięciem kDNA w obrębie genu dystrofiny w chromosomie 1 występuje niewydolność serca oraz osłabienie mięśni szkieletowych. 8Podobne zmiany genotypowe wiążą się z destrukcją tkanek prowadzoną przez efektorowe limfocyty CD45+, CD8γδ+ oraz CD8α+. W związku z tym infekcja tym pierwotniakiem może indukować genetycznie uwarunkowaną chorobę autoimmunologiczną.

Protokół

1. Hodowla pasożytów

  1. Hodować formy trypomastigote T. cruzi Berenice oraz ekspresujący β-galaktozydazę szczep Tulahuen T. cruzi MHOM/CH/00 C4 w mysich komórkach mięśniowych (L6) hodowanych w podłożu Dulbecco minimal essential medium z dodatkiem 10% FSB, 100 IU/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny oraz 250 nM L-glutaminy (pH 7.2), w atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Wolno pływające trypomastigote w nadsączu podłoża wykorzystano do inokulacji jaj kurzych.
  2. Hodować szczep Leishmania braziliensis (Lb) LTB300 w podłożu DMEM z 20% FBS. Formę promastigote Lb w fazie wykładniczego wzrostu wykorzystano do inokulacji jaj 9.

2. Inokulacja pasożyta do zapłodnionych jaj kurzych

  1. Inokuluj zawiesinę 100 trypomastigotów T. cruzi w 10 μl pożywki hodowlanej przez otwór o średnicy 2 mm w skorupce jaja, na szczycie komory powietrznej zapłodnionych jaj w stadium X. Inwazja i replikacja zjadliwych pasożytów w komórkach embrionu są pokazane w Video S1. Grupy kontrolne są następujące: a) kurczaki kontrolne; b) jaja kontrolne (mock), które otrzymały 10 μl pożywki hodowlanej; c) zapłodnione jaja w stadium X inokulowane zawiesiną 100 promastigotów Lb w 10 μl pożywki hodowlanej. T. cruzi i Lb należą do rodziny kinetoplastydów. Protozoony te namnażają się odpowiednio swobodnie w cytoplazmie lub w wakuolit parasitophorous komórek gospodarza 10.
  2. Uszczelnij otwory taśmą klejącą.
  3. Inkubuj jaja zainfekowane T. cruzi oraz próbki kontrolne (mock i niezainfekowane) w temperaturze 37,5 °C i wilgotności 65% przez 21 dni.
  4. Przetrzymaj wyklute pisklęta w inkubatorze przez 24 h, a następnie w temperaturze 32 °C przez trzy tygodnie.

3. Pobieranie próbek do ekstrakcji DNA

  1. Mononuklearne komórki krwi obwodowej pobrano od kurcząt: a) wyklutych z jaj inokulowanych T. cruzi; b) kontrolnych; c) pozornych, którym podano 10 μl medium hodowlanego; d) wyklutych z jaj inokulowanych Lb. Krwi białe kurcząt poddano ekstrakcji DNA zgodnie ze standardowym protokołem 11.
  2. Wyekstrahowano DNA również z nasienia pobranego od kogutów oraz z niepłodnych oocytów (< 5 mm) pobranych od kur rozklutych z jaj inokulowanych T. cruzi oraz od kur rozklutych z jaj kontrolnych 3, 4.
  3. Wyekstrahowano kDNA z form epimastygot T. cruzi oraz z promastygot Lb, zgodnie z opisem zawartym w innym opracowaniu 9.

4. Wykorzystane primery i sondy

Startery użyte do amplifikacji PCR oraz warunki termiczne przedstawiono w Tabeli 1.

Sondy użyte w hybrydyzacjach Southern blot były następujące:

  1. sekwencje minikół typu dzikiego (~1.4 kb) oczyszczone z form epimastigote T. cruzi;
  2. fragmenty minikół (362 bp) uzyskane poprzez trawienie kDNA typu dzikiego enzymem NsiI;
  3. powtarzalna sekwencja DNA jądrowego (nDNA) (188 bp) uzyskana poprzez amplifikację DNA pasożyta z użyciem starterów Tcz1/2. Sondy oczyszczono z żeli agarozowych 1% 3.
  4. sekwencje minikół typu dzikiego (~0.820 kb) z promastigote Lb.

5. Analizy PCR

  1. Przeprowadzić standardową procedurę PCR z wykorzystaniem genomowego DNA z zakażonych piskląt, niezakażonych kontroli oraz prób mock, stosując primery T. cruzi nDNA Tcz1/2 12 oraz kDNA s35/s36 13. Przeprowadzić również PCR z wykorzystaniem genomowego DNA z kurcząt wyklutych z jaj zakażonych Lb, stosując specyficzne dla pierwotniaków primery Lb3 i Lb5 (Tabela 1).
  2. Przygotować mieszaninę reakcyjną zawierającą 100 ng matrycowego DNA, 0,4 μM każdej pary primerów, 2 U polimerazy Taq DNA, 0,2 mM dNTP oraz 1,5 mM MgCl2 w końcowej objętości 25 μL.
  3. Ustawić program termocyklera: 95 °C przez 5 min, 30 cykli obejmujących 30 s w 95 °C / 30 s w 68 °C / 1 min w 72 °C, z końcową elongacją przez 5 min przed schłodzeniem.
  4. Analizować produkty amplifikacji w 1,3% żelu agarozowym, który następnie przenieść na dodatnio naładowaną membranę nylonową (GE Life Sciences) metodą alkaliczną w celu hybrydyzacji ze specyficznymi sondami znakowanymi [α-32P] dATP przy użyciu zestawu Random Primer Labeling Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA).

6. Genomowe analizy Southern blot

  1. Użyć enzymów MboI i/lub EcoRI (Invitrogen), które dokonują pojedynczych cięć w minikołach zintegrowanych z próbkami DNA tkanek organizmu.
  2. Przeprowadzić trawienie DNA z kurcząt kontrolnych niezakażonych oraz z kurcząt wyklutych z jaj inokulowanych zjadliwymi formami T. cruzi.
  3. Produkty trawienia DNA z T. cruzi oraz z badanych próbek kurcząt poddać elektroforezie w 0,8% żelu agarozy przy 50 V przez noc w temperaturze 4 °C.
  4. Przenieść rozdzielone prążki DNA na dodatnio naładowaną membranę nylonową.
  5. Przeprowadzić hybrydyzację prążków DNA z radioznakowaną sondą kDNA.
  6. Przemyć membranę dwukrotnie przez 15 min w 65 °C roztworem 2X SSC i 0,1% SDS, dwukrotnie przez 15 min w 65 °C każdy z roztworem 0,2X SSC i 0,1% SDS, a następnie wykonać autoradiografię w zmiennych odstępach czasu.

7. Celowana metoda Prime TAIL-PCR

  1. Uzyskać amplifikację minikoła kDNA zintegrowanego z genomem kurczaka za pomocą zmodyfikowanej techniki TAIL-PCR, która łączy primery kDNA ze specyficznymi zestawami primerów 2 w trzech cyklach zagnieżdżonej reakcji PCR (nested PCR), jak pokazano na Rysunku 1.
  2. Cykl pierwotny: Każda reakcja zawiera 200 ng matrycowego DNA, 2,5 mM MgCl2, 0,4 μM primerów kDNA (S34 lub S67), 0,2 mM dNTP oraz 2,5 U Taq Platinum (Invitrogen, Carlsbad, CA). Użyć primerów kDNA w połączeniu z 0,04 μM primerów Gg (Gg1 do Gg6, Tabela 1), osobno. Ustawić temperatury od 57,9 do 60,1 °C dla primerów kDNA oraz od 59,9 do 65,6 °C dla primera CR-1. Należy zauważyć, że temperatury te są wyższe niż te (~45 °C) wymagane dla arbitralnych primerów zdegenerowanych stosowanych w TAIL-PCR 10. Zastosować temperaturę i cykle (termocykler MyCycle, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) opisane w poprzedniej publikacji 3.
  3. Cykl wtórny: Rozcieńczyć produkty PCR z cyklu pierwotnego w stosunku 1:40 (v/v) w wodzie. Primery kDNA S35 i S35 antisense zastąpiono poprzednimi, wraz z tymi samymi primerami Gg.
  4. Cykl trzeciowy: Rozcieńczyć produkty PCR z cyklu wtórnego w stosunku 1:10 (v/v) w wodzie i połączyć primery Gg z primerem S67 antisense lub S36, osobno.
  5. Sklonować produkty trzeciowego cyklu PCR: Sklonować bezpośrednio do wektora pGEM T easy (Promega, Madison, WI) produkty ostatniej amplifikacji, które hybrydyzują z sondą kDNA.
  6. Wyselekcjonować klony poprzez hybrydyzację z sondą kDNA i przeprowadzić sekwencjonowanie.
  7. Zwalidować metodę tpTAIL-PCR w mieszaninie 300 pg kDNA z T. cruzi oraz 200 ng DNA z ptaków kontrolnych, które nigdy nie były eksponowane na kDNA. Temperatura i cykle amplifikacji są takie same, jak w przypadku DNA badanych ptaków.

8. Objawy kliniczne choroby Chagasa

  1. Codziennie monitoruj śmiertelność oraz raz w tygodniu objawy chorobowe, obserwując wzrost i rozwój kurcząt wyklutych z jaj zainfekowanych T. cruzi oraz zdrowych kurcząt kontrolnych wyklutych z jaj niezainfekowanych.
  2. Wykryj nieprawidłowości kliniczne u tych kurcząt (Rysunek 2) i wykonaj zapisy elektrokardiograficzne (EKG) w celu oceny osi elektrycznych, częstości akcji serca oraz arytmii 3.
  3. Raz w miesiącu poddawaj kurczęta z mutacją kDNA oraz grupę kontrolną zapisom EKG jednobiegunowych odprowadzeń wzmocnionych jamnych aVF (lewa noga), aVL (lewa ręka) i aVR (prawa ręka) oraz oceniaj odchylenie średniej osi elektrycznej w lewo, co sugeruje powiększenie serca 3.

9. Analizy patomorfologiczne i immunochemiczne

  1. Zapisz wskaźniki masy serca i masy ciała po naturalnej śmierci kurcząt z mutacją kDNA (Rycina 3). Uzyskaj analogiczne wskaźniki dla kurcząt kontrolnych w tym samym wieku i o tej samej płci.
  2. Pobierz wycinki z serca, przełyku, jelit, mięśni szkieletowych, płuc, wątroby i nerek.
  3. Utrwal tkanki w 10% formalinie buforowanej (pH 7.4), zalej parafiną i wykonaj skrawki o grubości 4 μm do barwienia hematoksyliną i eozyną (HE) oraz analiz histologicznych (Rycina 3).
  4. Pobierz i podziel na pół tkanki z embrionów wyklutych z jaj zaszczepionych pasożytami wykazującymi ekspresję β-galaktozydazy, a następnie poddaj je barwieniu X-Gal.9
  5. Utrwal drugą połowę tkanek embrionalnych w 10% formalinie o pH 7.4 i postąp zgodnie z krokiem 9.3.
  6. Wykonaj skrawki tkanek w parafini o grubości 4 μm i zamocuj je na szkiełkach przedmiotowych do badania mikroskopowego.
  7. Inkubuj skrawki wykazujące obecność niebieskich komórek zabarwionych X-Gal z ludzkim anty serum przeciwko antygenowi T. cruzi (rozcieńczenie 1:1024).
  8. Przepłucz skrawki trzykrotnie w PBS o pH 7.4, po 5 min każdy raz.
  9. Zbarw niebieskie komórki w tkankach embrionalnych poprzez drugą inkubację z fluoresceina-sprzężonym króliczym przeciwciałem anty-ludzkim IgG.
  10. Przepłucz skrawki w PBS (krok 8), przykryj szkiełkiem i obserwuj zielone świecenie niebieskich komórek podczas badania w świetle UV o długości fali 502 nm i powiększeniu 200x, w celu kolokalizacji T. cruzi w komórkach embrionalnych.

10. Fenotypowanie komórek układu odpornościowego w zmianach serca

  1. Przeprowadź fenotypowanie komórek efektorowych układu odpornościowego w przekrojach tkanek serca kurcząt kDNA-dodatnich oraz kontrolnych kurcząt kDNA-ujemnych.
  2. Umieść slajdy z zatopionymi w parafinie przekrojami tkanek w temperaturze 65 °C na 30 min, aby roztopić wosk przed poddaniem ich czterokrotnemu przemywaniu w ksylenie o stężeniu od 100% do 70%, a następnie w bezwodnym etanolu oraz PBS przez 5 min każdy etap.
  3. Opłucz slajdy w wodzie destylowanej, wysusz na powietrzu i potraktuj swoistymi przeciwciałami monoklonalnymi (przeciwciałami monoklonalnymi koniugowanymi z fluoresceiną lub R-fizkoerytryną) otrzymanymi z firmy SouthernBiotech, Birmingham, AL.
    1. Użyj mysiego przeciwciała przeciwkurzego Bu-1 (allele Bu-1a i Bu-1b, Mr 70-75 kDa) Mab AV20 w celu rozpoznania monomorficznego determinanta antygenów komórek B u kurcząt inbredowych.
    2. Użyj mysiego przeciwciała przeciwkurzego CD45, izotypu Ig IgM1 κ, swoistego dla komórek linii grasicy kurcząt (wariant Mr 190 do 215-KDa).
    3. Użyj mysiego przeciwciała przeciwkurzego TCRγδ+ (heterodimer Mr 90-kDa) Mab swoistego dla komórek CD8α+T zależnych od grasicy.
    4. Użyj mysiego przeciwciała przeciwkurzego Mab CD-8 swoistego dla łańcucha α kurczaka (Mr 34 kDa) do rozpoznawania komórek CD8 w tymocytach, śledzionie, sercu i innych tkankach.
    5. Użyj mysiego przeciwciała przeciwkurzego KuL01 do wyłącznego rozpoznawania monocytów/makrofagów układu fagocytarnego.
  4. Przemyj slajd trzykrotnie 0.1 M PBS, pH 7.4, po 5 min każdy, po 90-minutowej inkubacji ze swoistym przeciwciałem przeciwfenotypowym w komorze wilgotnościowej.
  5. Zamontuj preparat na slajdzie za pomocą gliceryny buforowanej do badania pod mikroskopem fluorescencyjnym z filtrem emisyjnym o długości fali odpowiednio 567 i 502 nm, aby wykryć komórki znakowane fluorescencją czerwoną i zieloną (Ryc. 4).

11. Analiza danych

  1. Do analizy sekwencji BLASTn należy wykorzystać bazę danych genomu kurcząt (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=9031).
  2. Do określenia wartości e-value należy zastosować dopasowania CLUSTALW.
  3. Do lokalizacji różnych klas powtórzeń w sekwencjach chimerycznych należy użyć algorytmu maskowania powtórzeń GIRI CENSOR (http://girinst.org/censor/index.php).
  4. Do identyfikacji potencjalnych gRNA w sekwencjach kDNA, przy użyciu zmodyfikowanej macierzy WU-Blastn-modified-matrix 3, należy wykorzystać narzędzie Kinetoplastid Insertion and Deletion Sequence Search Tool (KISS).
  5. Do wyszukiwania gRNA w chimerach kDNA-DNA gospodarza należy użyć sekwencji T. cruzi dostępnych pod adresem http://www.biomedcentral.com/content/supplementary/1471- 2164-8-133-s1.fas. 11.6) Do wykrywania istotnych różnic pomiędzy odchyleniami osi elektrycznych oraz między indeksami masy serca/ciała uzyskanymi w grupach eksperymentalnych i kontrolnych, a także do wykrywania istotnych różnic w wskaźnikach śmiertelności między kurczętami wyklutymi z jaj inokulowanych T. cruzi a grupą kontrolną, należy zastosować odpowiednio test t Studentowi oraz test Kołmogorowa-Smirnowa.

12. Reprezentatywne wyniki

Inokulacja 100 wirulentnych trypomastigot T. cruzi do komory powietrznej zapłodnionych jaj kurzych nie powoduje znaczącego obniżenia odsetka piskląt wyklutych żywych. Około 60% jaj daje zdrowe pisklęta, natomiast w 40% może dojść do upłynnienia zarodka lub obumarcia zarodka podczas wylęgu. Przeżyjące pisklęta zachowują zintegrowaną w genomie sekwencję minikoła kDNA. Przewiduje się jednak, że niektóre pisklęta w tygodniach po wykluciu padną z powodu kardiomegalii i niewydolności serca. Pozostałe pisklęta wyrosną na zewnętrznie zdrowe osobniki dorosłe. Na wszystkich etapach życia DNA wyekstrahowane z ich mononuklearnych komórek krwi będzie dawać produkt amplifikacji PCR kDNA, ale nie nDNA. Produkty TAIL-PCR z ukierunkowanym starterem 3, 4, które zostaną sklonowane i zsekwencjonowane, wykażą integrację minikół kDNA głównie w regionach kodujących makrochromosomów od 1 do 5. Kurczaki wykazujące wielokrotne integracje kDNA w genach kodujących wzrost i różnicowanie komórek, czynniki regulacji układu odpornościowego oraz naprawę DNA są kandydatami do odrzucenia własnych tkanek docelowych (Rycina 3). Na przykład kurczak wykazujący mutację kDNA z przerwanym genem dystrofiny (Rycina 5), kodującym białko wiążące cytoszkielet z błoną komórkową, jest kandydatem do rozwoju autoimmunologicznej zapalnej kardiomiopatii i niewydolności serca.

Tych modyfikacji genomowych nie obserwuje się u piskląt wyklutych z Lb zakażone jaja. Istnieją różnice między T. cruzi i Lb minikoliste kDNA; The T. cruzi kKwas deoksyrybonukleinowy (DNA) średnia struktura minikoła o wielkości 1,4 kb z czterema regionami zmiennymi (VR) przeplatanymi regionami konserwatywnymi (CR), z których każdy zawiera regiony CSB1, CSB2 i CSB3, w których bogate w CA wygięte DNA są uważane za specyficzne miejsca inicjacji replikacji, transkrypcji, rekombinacji oraz lateralnego transferu DNA 3, 4Z kolei Lb minikoło kDNA (średnia wielkość 820 bp) zawiera pojedynczy region konserwatywny (CR), po którym następuje region zmienny (VR). CR posiada konserwatywne bloki CSB1 (GGGCGT) i CSB2 (CCCCGTTC), które różnią się od bloków w T. cruzi minikoła DNA 15, 16 i 17Biorąc pod uwagę, że Lb CSB3 (GGGGTTGGTGTA) wykazuje homologię na poziomie 12 nt do T. cruzi można przypuszczać, że albo Lb Minikoła kDNA integrują się z znacznie mniejszą częstotliwością, co może być niewykrywalne za pomocą stosowanych technik, lub też możliwe jest, że w ogóle nie integrują się one z genomem kurczaka.

StarterDocelowe DNASekwencjaTm*
S 34T. cruzi kDNA5' ACA CCA ACC CCA ATC GAA CC 3'57.9
S 67T. cruzi kDNA5' GGT TTT GGG AGG GG(G/C) (G/C)(T/G)T C 3'60.1
S 35T. cruzi kDNA5' ATA ATG TAC GGG (T/G)GA GAT GC 3'59.4
S 36T. cruzi kDNA5' GGT TCG ATT GGG GTT GGT G 3'57,9
Lb3Lb kDNA5' GGG GTT GGT GTA ATA TAG TGG G 3'55.9
Lb5Lb kDNA5' CTA ATT GTG CAC GGG GAG G 3'61.4
Gg1Gallus gallus5' AGC TGA TCC TAA AGG CAG AGC 3'60.1
Gg2G. gallus5' CTG AGC CTC TGC TTT GAA A 3' 56.8
Gg3G. gallus5' TTT CAA AGC AGA GGC TCG G 3' 60.1
Gg4G. gallus3' GCT CTG CCT TTA GGA TCA GCT 5' 64.2
Gg5G. gallus3' AGC AAC TCA GCG TCC ACC TT 5' 62.3
Gg6G. gallus3' CTG TTA GCA TGA GGC TTC ACA A 5' 60.4

Tabela 1. Primery użyte w amplifikacjach PCR. * Tm = średnia temperatura hybrydyzacji °C.

Mapowanie chromosomowe, schemat metody cyklicznej amplifikacji DNA oraz wyniki elektroforezy żelowej dla analizy DNA.
Rysunek 1. Strategia tpTAIL-PCR zastosowana do wykrycia integracji kDNA Trypanosoma cruzi w genomie Gallus gallus. A) Sekwencja chimeryczna zawierająca fragment konserwatywnych (ciemnoniebieski) i zmiennych (jasnoniebieski) regionów minikoła kDNA zintegrowany w locus NW_001471687.1 w chromosomie 4 (AY237306) genomu kury 10 (zielony) została wykorzystana do otrzymania specyficznych dla gospodarza zestawów starterów (Gg1 do Gg6). B) Amplifikacje tpTAIL-PCR zostały zainicjowane (cykl pierwotny) poprzez przyłączenie specyficznych dla minikoła starterów S34 lub S67 w połączeniu ze specyficznymi dla kury starterami Gg1 do Gg6. Rozcieńczone produkty posłużyły jako matryca dla cyklu wtórnego ze starterami S35 (sens/anty-sens) i kombinacjami starterów Gg. W cyklu trzeciorzędowym rozcieńczenie produktów wtórnych poddano amplifikacji ze starterami anty-sens kDNA S36 lub S67 w połączeniu ze starterami Gg. C) Te produkty amplifikacji zostały rozdzielone w 1% żelach agarozowych i przeniesione na membranę nylonową, a następnie zhybrydyzowane ze specyficzną sondą kDNA. Próbki wykazujące sygnał dodatni wykorzystano do klonowania w celu ustalenia miejsca integracji. Kombinacje kDNA i docelowych starterów Gg1 do Gg6 przedstawiono nad żelem. Sekwencyjne reakcje PCR amplifikowały docelowe sekwencje kDNA-DNA gospodarza z minikołami kDNA (niebieski) i sekwencją ptasią (zielony). (Przedrukowano z PLoS Neglected Tropical Diseases 3). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Genetyka koguta, zmienność koloru upierzenia, schemat przedstawiający porównanie głowy czerwonego i białego koguta.
Rycina 2. Objawy kliniczne upośledzenia funkcji serca u 9-miesięcznego kurczaka zmodyfikowanego genetycznie poprzez integrację mitochondrialnego minikoła kDNA z T. cruzi. Słabe natlenienie krwi u kurczaka z mutacją mitochondrialnego kDNA, objawiające się fioletowym grzebieniem, kontrastuje z jaskrawoczerwonym grzebieniem 9-miesięcznego kurczaka kontrolnego, wolnego od uszkodzeń serca. (Zmodyfikowano na podstawie PLoS Neglected Tropical Diseases 3).

Porównanie tkanki serca, analiza histologiczna, wielkości serca, obrazy mikroskopowe, obecność włóknienia.
Rycina 3. Patologia makroskopowa i mikroskopowa u Gallus gallus z mutacjami kDNA. A) Kardiomegalia u 9-miesięcznej kury, która padła z powodu niewydolności serca. B) Serce kontrolne od niezainfekowanej 9-miesięcznej kury. C) Odrzucenie docelowych komórek serca przez limfocyty cytotoksyczne: Przedstawiono minimalną jednostkę odrzutu z lizą komórek docelowych przez limfocyty odpornościowe (okrąg). D) Histologia serca kontrolnego (Zmodyfikowano na podstawie PLoS Neglected Tropical Diseases 3 ).

Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej komórek traktowanych przeciwciałami anty-CD45, anty-CD8γδ i anty-CD8α; analiza markerów komórkowych.
Rysunek 4. Analizy immunocytochemiczne komórek układu odpornościowego infiltrujących serce kurczaka z mutacją kDNA, przedstawionego na Rysunku 3. A) Limfocyty CD45+ zidentyfikowane (strzałki) w zmianach w sercu za pomocą specyficznego przeciwciała monoklonalnego znakowanego fykoerytryną. B) Limfocyty odpornościowe CD8+γδ (strzałki) biorące udział w rozległym niszczeniu serca. C) Liczne limfocyty T CD8α+ obecne w ciężkich zmianach z lizą komórek serca. Wstawki pokazują brak komórek układu odpornościowego w sercu kontrolnego, niezakażonego kurczaka (Zmodyfikowano na podstawie PLoS Neglected Tropical Diseases 3 ).

Anatomia i histologia serca, z obrazami mikroskopowymi przedstawiającymi struktury tkankowe i szczegóły komórkowe.
Rycina 5. Kardiomiopatia zapalna z rozszerzeniem przypominająca chorobę Chagasa u potomstwa F2 z integracją kDNA w genie dystrofiny. A) Rozszerzone serce 10-miesięcznego kurczaka zajmujące większość jamy klatki piersiowej (masa serca = 16 g). B) Przenikanie ciemnych, okrągłych komórek jednojądrowych, które niszczą mięsień sercowy kury z mutacją kDNA. C) Prawidłowa wielkość serca (masa 7 g) 10-miesięcznego kurczaka kontrolnego. D) Prawidłowa histologia serca kurczaka kontrolnego. (Zmodyfikowano na podstawie PLoS Neglected Tropical Diseases 3).

Analiza histologiczna, obraz mikroskopowy, struktura tkanki komórkowej, skala 10μm, badanie biologiczne.
Rycina 6. Patologia porównawcza u kurczaka z mutacją kDNA oraz w przebiegu choroby Chagasa u ludzi. A) Ciężkie zapalenie mięśnia sercowego i lizy komórek docelowych serca u kurczaka z mutacją kDNA. B) Ciężkie zapalenie mięśnia sercowego i lizy komórek docelowych przez limfocyty immunologiczne w przypadku sercowej postaci choroby Chagasa. C) Odrzucanie komórek serca przez limfocyty immunologiczne u kurczaka z mutacją kDNA. D) Odrzucanie komórek serca przez limfocyty immunologiczne w przebiegu choroby Chagasa u ludzi. Barwienie hematoksyliną i eozyną. (Zmodyfikowano na podstawie Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro 14).

Dyskusja

W przeciwieństwie do ssaków podatnych na dożywotne infekcje T. cruzi, kurczaki są oporne na zakażenie T. cruzi. Główną zaletą modelu kurczaka jest eliminacja infekcji na wczesnym etapie rozwoju embrionalnego układu odpornościowego. W konsekwencji jedyne pozostałe w organizmie kurczaka DNA pasożyta jest zintegrowane w kilku loci.

Użycie optymalnej ilości wirulentnych trypomastigot T. cruzi do inokulacji zapłodnionych jaj jest krytycznym krokiem w celu uzyskania integracji minikół kDNA z genomem zarodka kury. Odsetek żywych piskląt wykluwających się z jaj inokulowanych 100 trypomastigotami jest czterokrotnie wyższy niż w przypadku zastosowania 500 pasożytów. Należy zadbać o to, aby zawiesinę pasożytów w 10 μL pożywki hodowlanej wstrzyknąć do komory powietrznej jaja. Nie powinno dojść do wycieku białka jaja. W optymalnych warunkach wewnątrzkomórkowa infekcja pasożytnicza następuje w ciągu kilku godzin po inkubacji, a namnażanie się pasożytów w komórkach gospodarza trwa przez jeden tydzień; następnie infekcja jest eliminowana przez odporność wrodzoną. Integracja kDNA wymaga żywej infekcji, a inokulacja samych minikół do jaj z wczesnymi zarodkami kur nie prowadzi do integracji. Zarodki kDNA-dodatnie oraz kontrolne powinny być przetrzymywane w kontrolowanych warunkach w temperaturze 37,5 °C i wilgotności 65%. Pisklęta są utrzymywane w klatkach przez dwa tygodnie w temperaturze pokojowej 33 °C. Następnie kury są przetrzymywane w klatkach na zawieszonych regałach, oddzielonych przejściami o szerokości 1,5 metra w pomieszczeniu o temperaturze 22 °C z filtrowanym powietrzem i nadciśnieniem przy stałym wyciągu, aby zapewnić warunki dobrostanu zwierząt. Ptaki dorosłe są karmione paszą dla kur i mają dostęp do zdatnej do picia bieżącej wody, aby osiągnąć pełny wzrost i dojrzałość, zaczynając składać jaja w piątym miesiącu życia. Zachowanie procedur higienicznych jest niezbędne dla powtarzalności wyników podczas pracy z T. cruzi inokulowanym do zapłodnionych jaj kurzych.

W modelu kurzym infekcje T. cruzi są eliminowane po rozwoju układu odpornościowego we wczesnym okresie wzrostu zarodka. Oprócz bycia wolnymi od infekcji, pisklęta wykluwające się z jaj inokulowanych T. cruzi, przy braku swoistych przeciwciał, wykazują tolerancję na antygeny pasożyta. Odrzucenie komórek docelowych serca przez limfocyty cytotoksyczne (minimalna jednostka odrzucenia, Rysunek 3) obserwuje się u kur z mutacją kDNA wykazujących modyfikacje genotypowe i załamanie nadzoru immunologicznego 3. Genotypowo zmodyfikowane limfocyty T wykazują przyspieszone odrzucanie własnych tkanek organizmu. Głównym miejscem zmiany chorobowej jest serce, co stanowi charakterystyczną cechę choroby Chagasa. Przejście ze stanu fizjologicznego (nadzoru) do stanu fizjopatologicznego obserwuje się u kur z mutacją kDNA, u których występuje klonalna proliferacja limfocytów cytotoksycznych 3.

Ten międzykrólestwowy model systemowy wykazuje indukowaną przez pasożyta, uwarunkowaną genetycznie chorobę autoimmunologiczną (Rysunek 6), wynikającą z modyfikacji genomu spowodowanych integracjami minikół kDNA T. cruzi. Modyfikacje te nie występują u kurcząt wyklutych z jaj inokulowanych Lb.

Zjawisko to sugeruje, że leczenie eksperymentalne zapalnej autoimmunologicznej kardiomiopatii u kurcząt z mutacją kDNA może wymagać farmakologicznego tłumienia progenitorów szpiku kostnego o specyficznym fenotypie limfocytów T naciekających mięsień sercowy oraz transplantacji histokompatybilnego, zdrowego szpiku kostnego w celu zapobieżenia odrzuceniu własnej tkanki.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni Nancy R. Sturm z Katedry Immunologii, Mikrobiologii i Biologii Molekularnej w David Geffen School of Medicine na University of California w Los Angeles za krytyczną lekturę manuskryptu. Badanie było wspierane przez National Council of Research-CNPq oraz Foundation for Research Development-FAPDF w Brazylii. Dziękujemy za pomoc techniczną Alessandro O. Souza, Maria C. Guimaro, Ciro Cordeiro, Ana de Cassia Rosa, Roseneide Alves oraz Rafael Andrade z University of Brasilia w Brazylii.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rekombinowana polimeraza DNA TaqInvitrogen11615-010
Polimeraza DNA Platinum TaqInvitrogen10966-030
System znakowania DNA za pomocą losowych starterówInvitrogen18187-013
EcoRI Invitrogen15202-021
MboI Invitrogen15248-016
Zestaw dNTP, roztwory 100mMGE Healthcare28-4065-51
Amersham Hybond - N+ -- nr kat.GE HealthcareRPN303B
Zestaw PlasmidPrep Mini SpinGE Healthcare28-9042-70
NsiI Sigma-AldrichR5884 1KU
DNA, sól sodowa sperm rybAMRESCO0644-10G
Przeciwciało mysie przeciwkurzy Bu-1bSouthernBiotech8370-02
Przeciwciało mysie przeciwkurzy CD45SouthernBiotech8270-08
Przeciwciało mysie przeciwkurzy TCRγδSouthernBiotech8230-08
Przeciwciało mysie przeciwkurzy CD8αSouthernBiotech9220-02
Przeciwciało mysie przeciwkurzym monocytom/makrofagomSouthernBiotech8420-02
Termocykler MyCycleBio-Rad580BR 5501

Bibliografia

  1. Teixeira, A. R. Pathogenesis of chagas' disease: parasite persistence and autoimmunity. CMR. 24, 592-630 (2011).
  2. Teixeira, A. R. Chagas disease. Postg. Med. J. 82, 788-798 (2006).
  3. Teixeira, A. R. Trypanosoma cruzi in the chicken model: Chagas-like heart disease in the absence of parasitism. PLoS Negl. Trop. Dis. 5, e1000(2011).
  4. Hecht, M. M. Inheritance of DNA transferred from American trypanosomes to human hosts. PLoS One. 5, e9181(2010).
  5. Xing, Z. Roles of the ERK MAPK in the regulation of proinflammatory and apoptotic responses in chicken macrophages infected with H9N2 avian influenza virus. J. Gen. Virol. 91, 343-351 (2010).
  6. Kim, H. B. NIK and IKKbeta interdependence in NF-kappaB signalling--flux analysis of regulation through metabolites. Biosystems. 99, 140-149 (2010).
  7. Karakhanova, S. ERK/p38 MAP-kinases and PI3K are involved in the differential regulation of B7-H1 expression in DC subsets. Eur. J. Immunol. 40, 254-266 (2010).
  8. Finsterer, J. The heart in human dystrophinopathies. Cardiology. 99, 1-19 (2003).
  9. Nitz, N. Heritable integration of kDNA minicircle sequences from Trypanosoma cruzi into the avian genome: insights into human Chagas disease. Cell. 118, 175-186 (2004).
  10. Simpson, L. Kinetoplast DNA in trypanosomid flagellates. Int. Rev. Cytol. 99, 1-19 (1986).
  11. Bonney, K. M. Heat-killed Trypanosoma cruzi induces acute cardiac damage and polyantigenic autoimmunity. PLoS One. 6, e14571(2011).
  12. Moser, D. R. Detection of Trypanosoma cruzi by DNA amplification using the polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol. 27, 1477-1482 (1989).
  13. Sturm, N. R. Sensitive detection and schizodeme classification of Trypanosoma cruzi cells by amplification of kinetoplast minicircle DNA sequences: use in diagnosis of Chagas' disease. Mol. Biochem. Parasitol. 33, 205-214 (1989).
  14. Teixeira, A. R. Evolution and pathology in chagas disease--a review. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 101, 463-491 (2006).
  15. Yurchenko, V. Y. Structure of Leishmania minicircle kinetoplast DNA classes. J. Clin. Microbiol. 37, 1656-1657 (1999).
  16. Simpson, L. The genomic organization of guide RNA genes in kinetoplastid protozoa: several conundrums and their solutions. Mol. Biochem. Parasitol. 86, 133-141 (1997).
  17. Thomas, S. A non-universal transcription factor? The Leishmania tarentolae TATA box-binding protein LtTBP associates with a subset of promoters. Int J. Parasitol. 36, 1217-1226 (2006).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

choroba Chagasaintegracja kDNAamplifikacja PCRelektroforeza w eluhybrydyzacja Southernasekwencjonowanie klon wlimfocyty cytotoksyczneniewydolno sercaautoimmunizacja uwarunkowana genetycznie
Indukowana przez pasożyta genetycznie sterowana autoimmunologiczna choroba serca Chagasa w modelu kurzym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.