Ostatnie postępy w mikroskopii dwufotonowej umożliwiły obrazowanie in situ żywych tkanek w modelach zwierzęcych w czasie rzeczywistym, co zwiększyło nasze możliwości badania zachowania komórek zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych. W niniejszym materiale przedstawiamy przygotowania niezbędne do przeprowadzenia obrazowania przyżyciowego węzła chłonnego podkolanowego myszy.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie intravitalne węzła chłonnego podkolanowego myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Węzły chłonne (LNs) są wtórnymi narządami limfatycznymi, rozmieszczonymi strategicznie w całym organizmie, aby umożliwić wychwytywanie i prezentację obcych antygenów z tkanek obwodowych w celu zainicjowania adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej. Znajdując się na styku odpowiedzi immunologicznej wrodzonej i adaptacyjnej, węzeł chłonny stanowi idealne miejsce do badania oddziaływań między komórkami odpornościowymi1,2. Limfocyty (komórki T, komórki B i komórki NK), komórki dendrytyczne (DCs) oraz makrofagi stanowią główną część elementów komórkowych węzła chłonnego pochodzących z szpiku kostnego. Komórki te są strategicznie rozmieszczone w węźle chłonnym, co pozwala na efektywny nadzór nad autoantygenami oraz potencjalnymi antygenami obcymi3-5. Proces, w którym limfocyty skutecznie napotykają cognatywne antygeny, jest przedmiotem intensywnych badań w ostatnich latach i obejmuje integrację kontaktów molekularnych, w tym receptorów antygenowych, cząsteczek adhezyjnych, chemokin oraz struktur zrębowych, takich jak sieć włóknisto-siateczkowa2,6-12.
Przed opracowaniem obrazowania fluorescencyjnego in vivo w czasie rzeczywistym o wysokiej rozdzielczości, badacze polegali na obrazowaniu statycznym, które dostarcza odpowiedzi jedynie w zakresie morfologii, położenia i architektury. Choć pytania te są fundamentalne dla naszego zrozumienia zachowania komórek odpornościowych, ograniczenia właściwe dla tej techniki nie pozwalają na analizę w celu rozszyfrowania ruchu limfocytów oraz wskazówek środowiskowych wpływających na dynamiczne zachowanie komórek. Niedawno opracowanie intravitalnej dwufotonowej skaningowej mikroskopii laserowej (2P-LSM) umożliwiło badaczom obserwację dynamicznych ruchów i interakcji pojedynczych komórek w żywych węzłach chłonnych (LN) in situ12-16. W szczególności my oraz inni autorzy zastosowali tę technikę do obrazowania zachowania i interakcji komórkowych w obrębie poplitowego LN, gdzie jego zwarta, gęsta natura daje korzyść w postaci wielokrotnego pozyskiwania danych z dużego obszaru tkanki z różnorodnymi podstrukturami tkankowymi11,17-18. Należy zauważyć, że technika ta oferuje dodatkowe korzyści w porównaniu z metodami obrazowania tkanek eksplantowanych, które wymagają przerwania przepływu krwi, limfy i w konsekwencji dynamiki komórkowej systemu. Ponadto tkanki eksplantowane mają bardzo ograniczone okno czasowe, w którym tkanka pozostaje żywotna do obrazowania po eksplantacji. Przy odpowiednim nawadnianiu i monitorowaniu warunków środowiskowych zwierzęcia, czas obrazowania może zostać znacznie wydłużony dzięki tej technice intravitalnej. W niniejszej pracy przedstawiamy szczegółową metodę przygotowania poplitowego LN myszy w celu przeprowadzenia obrazowania intravitalnego.
Protokół
1. Montaż uchwytu dla myszy
- Nałóż pokrywkę szklanej szalki Petriego o średnicy 100 mm na odwróconą do dołu plastikową pokrywkę szalki Petriego o średnicy 100 mm. Szkło powinno ledwo dotykać środka plastikowej szalki. Używając szklanej pokrywki jako szablonu, odrysuj jej kształt na plastikowej pokrywce.
- Za pomocą wiertarki ręcznej (np. Dremel) usuń część plastikowej pokrywki szalki o średnicy 100 mm, aby utworzyć platformę w kształcie półksiężyca. Ta plastikowa pokrywka w kształcie półksiężyca będzie służyć jako podparcie dla górnej części tułowia myszy (Rycina 1a). Wywierć dwa otwory w pokrywce w kształcie półksiężyca, aby przymocować maskę gazową za pomocą metalowej opaski skręcanej. Przymocuj plastikową pokrywkę do krawędzi szklanej szalki Petriego, używając superglue lub równoważnego silnego kleju (Rycina 1b).
- Przyklej pokrywki dwóch probówek PCR z kopułkowym zamknięciem (odcięte w miejscu zawiasu) w odstępach 1 cm do środka dolnej szalki w celu zakotwiczenia płatów skóry podkolanowej.
2. Przygotowanie myszy
Uwaga: Przy odpowiedniej wprawie przygotowanie myszy i kroki chirurgiczne powinny zająć od 20 do 30 minut.
- Zanurzyć mysz w narkozie za pomocą izofluranu (2 do 2,5% w fazie indukcji, 1,5 do 2% podczas operacji/obrazowania) domieszanego w stosunku 1:1 w mieszaninę O2 : powietrze przy przepływie 1L/min, stosując procedurę zatwierdzoną przez IACUC. Po znieczuleniu myszy zabezpieczyć maskę gazową na nosie za pomocą taśmy. Potwierdzić pełne znieczulenie myszy poprzez brak reakcji na uciśnięcia palców stopy i/lub ogona. Poziom izofluranu można odpowiednio dostosować, aby zapewnić pełną sedację zwierzęcia przy stabilnej, nieutrudnionej częstości oddechów w zakresie 60-80 oddechów/min.
- Użyć elektrycznego trymera do usunięcia sierści z prawej tylnej łapy i okolicy pachwinowej myszy.
- Omiotły luźną sierść i za pomocą patyczka kosmetycznego delikatnie nanieść niewielką warstwę kremu Nair na ogoloną okolicę. Po jednej minucie od pierwszej aplikacji usunąć preparat Nair i oczyścić odsłoniętą skórę wilgotnym ręcznikiem papierowym. Przed kontynuacją upewnić się, że mysz jest czysta i sucha.
- Za pomocą nożyczek wykonać niewielkie nacięcie o długości 2 do 3 mm w okolicy prawego kolana, aby odsłonić ścięgno prostownika.
- Nanieść klej Vetbond wzdłuż środka uchwytu do myszy, w miejscu, gdzie znajdować się będzie ciało i łapa zwierzęcia. Ostrożnie przymocować mysz do uchwytu, kierując prawe kolano w dół, aby odsłonić prawy dół podkolanowy. Zabezpieczyć ścięgno prawego kolana klejem Vetbond pomiędzy dwoma uchwytami do płatów skóry, aby pomóc w stabilizacji pola obrazowania.
- Wyprostować i przymocować taśmą przednie łapy oraz lewą tylną łapę do górnej platformy uchwytu.
- Użyć opaski zaciskowej, aby unieruchomić maskę gazową na miejscu.
- Umieścić uchwyt pod mikroskopem sekcyjnym. Węzeł chłonny (LN) musi pozostawać całkowicie nieruchomy, niezależnie od ruchów oddechowych myszy. Dlatego podczas przeprowadzania operacji należy podjąć środki ostrożności w celu zoptymalizowania stabilności łapy. Ustalić położenie ogona (zazwyczaj nad głową), które zapewni największą stabilność prawej łapy, a następnie przymocować ogon taśmą.
3. Operacja
- Podczas pracy pod mikroskopem stereoskopowym należy utrzymywać temperaturę ciała myszy za pomocą grzejnika przestrzennego lub mata grzewczego. Dla skutecznego obrazowania węzła chłonnego podkolanowego kluczowe jest zachowanie odpowiedniej temperatury ciała przez cały czas trwania zabiegu, a także utrzymanie wilgotności tkanki poprzez stałe nakładanie ciepłego PBS na odsłoniętą tkankę.
- Skórę należy wysterylizować Betadynem. Używając sterylnych nożyczek, należy wykonać nacięcie wzdłuż linii środkowej skóry w połowie prawej łydki, a następnie kontynuować cięcie pionowo w górę, aż do górnej części prawego uda.
- Na górze linii nacięcia pionowego należy wykonać dwa poziome nacięcia skóry, aby stworzyć płaty skórne po obu stronach.
- Oba płaty skórne należy odsunąć i przykleić za pomocą Vetbond. Napięcie skóry przed nałożeniem Vetbond dodatkowo poprawi stabilność nogi; należy jednak upewnić się, że napięcie skóry nie blokuje przepływu krwi (np. zmiany koloru lub średnicy naczynia). Należy kontynuować przyklejanie innych obszarów skóry, aby zapewnić stabilność nogi przed odsłonięciem węzła chłonnego. Wielkość myszy określi, ile dodatkowej skóry należy przykleić. Zazwyczaj większe myszy wymagają przyklejenia większej powierzchni skóry do uchwytu.
- Węzeł chłonny powinien znajdować się w dole podkolanowym, po prawej lub lewej stronie żyły podkolanowej, w zależności od ułożenia myszy w uchwycie. Należy ostrożnie oddzielić węzeł chłonny od otaczających go tkanek tłuszczowych i mięśni, używając mikropincet i kleszczyków do mikrodissekcji. Aby zminimalizować krwawienie i urazy, do rozdzielania tkanek należy stosować techniki rozsuwania za pomocą mikropincet. Należy ostrożnie odsłonić węzeł chłonny podkolanowy, nie naruszając integralności naczyń krwionośnych doprowadzających i odprowadzających oraz naczyń limfatycznych doprowadzających.
- W celu zwiększenia stabilności tkanki nad wilgotnym węzłem chłonnym można umieścić kwadratowe szkiełko nakrywkowe, które powinno ledwie dotykać węzła chłonnego, unikając przy tym okluzji naczyń. Szkiełko nakrywkowe można przymocować plasteliną po obu stronach myszy.
- Na tym etapie można dożylnie wprowadzić fluorescencyjne barwniki do naczyń o różnych wielkościach (np. TRITC-dekstran, minimum 70kDa), aby pomóc w uwidocznieniu relacji strukturalnych i integralności węzła chłonnego podczas obrazowania.
4. Pozyskiwanie obrazów w mikroskopii dwufotonowej**
- Gdy węzeł chłonny (LN) zostanie odpowiednio odsłonięty i osiągnięta zostanie stabilność, bezzwłocznie przenieś cały uchwyt dla myszy na stolik mikroskopu wyposażony w programowalną matę grzewczą z kontrolą temperatury przez sprzężenie zwrotne, znajdujący się w komorze mikroskopowej utrzymywanej w temperaturze 37°C. Dodaj wystarczającą ilość sterylnego, ciepłego (37°C) PBS lub HBSS, aby zanurzyć LN. Objętość będzie zależeć od wielkości i ułożenia myszy. Alternatywnie ciepły PBS lub HBSS można podawać bezpośrednio na wypreparowany LN za pomocą cienkiej szklanej pipety podłączonej do pompy perystaltycznej i przymocowanej taśmą do kolumny obiektywu imersyjnego. Przepływ cieczy powinien być taki, aby między soczewką a tkanką można było utrzymać stabilną kolumnę wody.
- Utrzymuj temperaturę PBS lub HBSS na poziomie 37°C za pomocą maty grzewczej z sondą sprzężenia zwrotnego. Oddzielną sondę temperatury należy umieścić w uchwycie dla myszy, aby potwierdzić, że temperatura PBS mieści się w zakresie od 36,5 do 37,5°C. Można również użyć sondy rektalnej do monitorowania temperatury głębokiej ciała myszy doświadczalnej przez cały czas trwania sesji obrazowania.
- Użyj lampy epifluorescencyjnej, aby pomóc w odpowiednim ustawieniu LN pod obiektywem. Pozyskaj serie obrazów fluorescencyjnych w odstępach czasu odpowiednich dla badanej interakcji komórkowej (zazwyczaj od 10 sekund do 1 minuty pomiędzy każdą serią obrazów xyz).
- Często monitoruj stan zwierzęcia w komorze mikroskopowej poprzez kontrolę wizualną lub za pomocą systemu monitorowania zwierząt. Sprawdź, czy mysz jest w pełni znieczulona, oceniając brak reakcji na uszczypnięcia palców i/lub paznokci oraz stałą, nieutrudnioną częstość oddechów w zakresie 60-80 oddechów/min. Poziom izofluranu można odpowiednio dostosować, aby zapewnić pełną sedację zwierzęcia. Przy właściwym monitorowaniu i nawadnianiu obrazowanie zwierząt może trwać od 4 do 6 godzin, a być może dłużej.
- Po zakończeniu eksperymentu obrazowania uśmierć zwierzę w komorze CO2 zgodnie z zatwierdzonym przez IACUC protokołem eutanazji. Nie wolno dopuścić do wybudzenia zwierzęcia z narkozy przed eutanazją.
** Ta procedura chirurgiczna może być również przydatna w innych formach obrazowania intravitalnego niż 2P-LSM.
5. Reprezentatywne wyniki
Różne krążące komórki odpornościowe są rekrutowane do węzła chłonnego (LN) z różną prędkością po transferze adopcyjnym. W przypadku limfocytów CD4+ i CD8+ komórki te zaczynają docierać do LN poprzez żyłki wysokomiąższowe (HEV) kilka minut po transferze dożylnym (i.v.), a znaczne ich liczby pojawiają się w LN podkolanowym po 2 do 4 godzinach6,17-18. W odniesieniu do limfocytów B, znaczna ich liczba gromadzi się po 8 do 24 godzinach19. Aktywowane komórki dendrytyczne (DCs) powinny zacząć pojawiać się w drenującym LN podkolanowym od 8 do 16 godzin po wstrzyknięciu w poduszkę stopy3,11,16-17. Rycina 2a pokazuje, że nawet bez innych punktów orientacyjnych, struktury takie jak mieszkowe limfocyty B można łatwo rozpoznać po okrągłych, sferycznych skupiskach komórek widocznych w 2P-LSM19. Wykorzystując endogenny reporter fluorescencyjny, taki jak splenocyty ubiquitin-GFP (Rycina 2, Filmy uzupełniające 1 i 2), można śledzić migrację i zachowanie tych limfocytów przez wiele dni, nawet do tygodnia, w niestymulujących warunkach fizjologicznych. Dzięki wielokanałowym detektorom o wysokiej czułości możliwe jest pozyskanie multipleksowego zbioru danych obrazowych, który obejmuje zarówno informacje strukturalne, jak i dynamikę oddziaływań między wieloma partnerami komórkowymi17,19.
Przy prawidłowym wykonaniu technik chirurgicznych i starannym monitorowaniu warunków środowiskowych limfocyty powinny wykazywać charakterystyczną prędkość migracji, co przedstawiono na rysunkach 2c, 2d oraz w innych źródłach13-14,16. Limfocyty mogą również wykazywać różnice w prędkości migracji w zależności od obrazowanych podregionów węzła chłonnego (LN), dlatego dodatkowe punkty orientacyjne, takie jak naczynia krwionośne (uwidocznione poprzez wprowadzenie barwników naczyniowych), pomogą określić ogólną jakość obrazowania (np. właściwą kontrolę temperatury, minimalny uraz LN itp.)3,6,20.
Rycina 1. Konstrukcja uchwytu dla myszy do obrazowania poplitowych węzłów chłonnych (LN). a) Schematy montażu uchwytu dla myszy; b) Reprezentatywne przygotowanie myszy do badania intravitalnego; c) Zmontowany uchwyt dla myszy; d) Powiększone widoki poplitowych LN po odsłonięciu chirurgicznym.
Rycina 2. Analiza migracji limfocytów GFP+ w węźle chłonnym podkolanowym. (a) Migawka 3D pobrana z sekwencji obrazowania 2P-LSM węzła chłonnego podkolanowego u myszy biorcy C57BL/6, której 1 dzień przed obrazowaniem adoptywnie przeniesiono 1x107 limfocytów GFP+. Linia przerywana oznacza granicę mieszków limfocytów B; (b) Ścieżki migracji limfocytów podczas 1 godziny ciągłego obrazowania; c) Rozkład ogólnej prędkości migracji limfocytów. Średnia prędkość = 10.04 ± 4.26 μm/min (analiza łącznie 15 125 ścieżek); d) Różnicowy rozkład prędkości migracji komórek znalezionych w mieszkach limfocytów B (słupki otwarte; średnia prędkość = 8.79 ± 3.90 μm/min; analiza łącznie 1 525 ścieżek) i w strefie limfocytów T (słupki zamknięte; średnia prędkość = 13.77 ± 5.93 μm/min; analiza łącznie 1 250 ścieżek). Pasek skali = 50 μm.
Wideo dodatkowe 1. Obrazowanie intravitalne w czasie rzeczywistym za pomocą 2P-LSM w węźle chłonnym podszybowym myszy, zgodnie z opisem w Rysunku 2. Łącznie 1x107 limfocytów wyizolowano od myszy donora ubiquitin-GFP+ i przeniesiono adoptywnie dożylnie do myszy biorcy C57BL/6 na 24 godziny przed obrazowaniem. Seria obrazów fluorescencyjnych xy (750 μm x 750 μm) została wykonana przez stałe stosy z (kroki 5 μm, 13 kroków), aby uzyskać stos obrazowania xyz (750 μm x 750 μm x 65 μm); procedurę powtarzano co 20 sekund przez łącznie 60 minut, co pozwoliło na uzyskanie sekwencji obrazowania xyzt do analizy prędkości (Rysunki 2c, 2d). Prędkość odtwarzania = 450x. Pasek skali = 50 μm. Znacznik czasu = min:sek. Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo dodatkowe.
Film uzupełniający 2. Powiększenie sekwencji obrazowania z Filmu uzupełniającego 1 na granicy mieszka komórek B i strefy komórek T. Prędkość odtwarzania = 450x. Pasek skali = 25 μm. Znacznik czasu = min: sek. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film uzupełniający.
Dyskusja
Ostatnie postępy w technikach obrazowania in situ o wysokiej rozdzielczości, w szczególności w 2P-LSM, wiążą się z rosnącym zainteresowaniem badaniem dynamicznego zachowania komórek in vivo. Technika obrazowania 4D w obrębie węzła chłonnego podkolanowego żywej myszy umożliwia przeprowadzanie takich analiz dynamicznego zachowania komórek odpornościowych w niezakłóconym mikrośrodowisku tkankowym. Zastosowanie 2P-LSM z wieloma detektorami obejmującymi całe widmo widzialne pozwala na jednoczesne zbieranie danych obrazowych z wielu populacji komórek. Można to obecnie osiągnąć poprzez wykorzystanie myszy z fluorescencyjnymi reporterami specyficznymi dla konkretnych komórek in vivo (np. Ubiquitin-eGFP, -RFP lub -eCFP) w połączeniu z adoptywnym transferem różnie znakowanych populacji komórek przy użyciu organicznych fluorescencyjnych barwników komórkowych (np. CFSE, SNARF-1 i Cell Tracker Orange), aby badać mechanizmy i funkcje komórkowe w obrębie węzła chłonnego. Oprócz bezpośredniej obserwacji oddziaływań między różnie śledzonymi populacjami komórek, wieloodpadowy zestaw danych obrazowych może zostać poddany dalszej analizie przy użyciu komercyjnie dostępnego oprogramowania do przetwarzania obrazów (np. Imaris, BitPlane Inc.) w celu dokładniejszego wyjaśnienia zachowania i funkcji komórek. Istnieje szeroki wachlarz możliwości badania mechanizmów oddziaływań komórkowych z wykorzystaniem tych technik in vivo i in silico.
Głównym ograniczeniem opisanego tutaj podejścia eksperymentalnego jest złożoność techniczna właściwa dla zastosowanej metody chirurgicznej. Technika ta wymaga rygorystycznego szkolenia w celu zapoznania się z odpowiednią anatomią oraz precyzyjnymi procedurami technicznymi i umiejętnościami wymaganymi przez niniejszy protokół. Dodatkowe czynniki utrudniające obejmują trudność w minimalizowaniu uszkodzeń tkanek podczas eksploracji LN, optymalizację stabilności tkanek podczas obrazowania oraz zapobieganie uszkodzeniom termicznym i laserowym LN przed i w trakcie eksperymentów obrazowych. Zaburzenie któregokolwiek z tych czynników doprowadzi do nieoptymalnej ruchomości limfocytów, co w konsekwencji będzie utrudniać prawidłową interpretację wyników analizy danych obrazowych.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Niniejsza praca jest finansowana z grantów NCI 1R01CA154656, NIAID 1R21AI092299, Cancer Research Institute, St. Baldrick's Foundation, Dana Foundation, Gabrielle's Angel Foundation oraz programu „Hope-on-Wheels” firmy Hyundai Motors of America.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Izofluran, USP | Baxter International Inc. | NDC 10019-773-60 | |
| Vetbond | 3M | 1469SB | |
| Nair – balsam do depilacji | Nair | ||
| PBS, 1X | Cellgro | 21-040-CV | |
| Podkładka grzewcza | Watlow | ||
| Sterownik maty grzewczej | Watlow | ||
| Powietrze i tlen2 | Airgas | ||
| Sonda temperatury | Harvard Apparatus | ||
| Pinceta Dumont #5 | World Precision Instruments, Inc. | 14101 | |
| Pinceta Graefe Iris, 7 cm zakrzywiona | World Precision Instruments, Inc. | 14141 | |
| Nożyczki | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5880 | |
| Pokrywa szklanej szalki do hodowli komórkowych 100x20 mm | Corning | 70165-102 | |
| Pokrywka naczynia do hodowli komórkowej z polistyrenu o wymiarach 100x20 mm | Corning | 430167 | |
| Roztwór Betadine (10% roztwór do stosowania miejscowego powidonu z jodem) | Purdue Products L.P. | NDC 67618-150-08 |
Bibliografia
- Bousso, P. T-Cell activation by dendritic cells in the lymph node: lessons from the movies. Nat. Rev. Immunol. 8, 675-684 (2008).
- Germain, R. N. Making friends in out-of-the-way places: how cells of the immune system get together and how they conduct their business as revealed by intravital imaging. Immunol. Rev. 221, 163-181 (2008).
- Huang, A. Illuminating the landscape of in vivo immunity: insights from dynamic in situ imaging of secondary lymphoid tissues. Immunity. 21, 331-339 (2004).
- Stefanova, I. Self-recognition promotes the foreign antigen sensitivity of naive T lymphocytes. Nature. 420, 429-434 (2002).
- Stefanova, I. On the role of self-recognition in T cell responses to foreign antigen. Immunol. Rev. 191, 97-106 (2003).
- Bajenoff, M. Fibroblastic reticular cells guide T lymphocyte entry into and migration within the splenic T cell zone. J. Immunol. 181, 3947-3954 (2008).
- Celli, S. Decoding the dynamics of T cell-dendritic cell interactions in vivo. Immunol. Rev. 221, 182-187 (2008).
- Mempel, T. R., Junt, T., von Andrian, U. H. Rulers over randomness: stroma cells guide lymphocyte migration in lymph nodes. Immunity. 25, 867-869 (2006).
- Worbs, T. CCR7 ligands stimulate the intranodal motility of T lymphocytes in vivo. J. Exp. Med. 204 (3), 489-495 (2007).
- Bajenoff, M. byways and breadcrumbs: directing lymphocyte traffic in the lymph node. Trends Immunol. 28, 346-352 (2007).
- Mempel, T. R. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
- Mempel, T. R. In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues. Curr. Opin. Immunol. 16, 406-417 (2004).
- Miller, M. J. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 2604-2609 (2003).
- Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. Intravital microscopy: visualizing immunity in context. Immunity. 21, 315-329 (2004).
- von Andrian, U. H., Mempel, T. R. Homing and cellular traffic in lymph nodes. Nat. Rev. Immunol. 3, 867-878 (2003).
- Bousso, P., Robey, E. Dynamics of CD8+ T cell priming by dendritic cells in intact lymph nodes. Nat. Immunol. 4, 579-585 (2003).
- Castellino, F. Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction. Nature. 440, 890-895 (2006).
- Halin, C. In vivo imaging of lymphocyte trafficking. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 581-603 (2005).
- Qi, H. Extrafollicular activation of lymph node B cells by antigen-bearing dendritic cells. Science. 312, 1672-1676 (2006).
- Germain, R. N. An extended vision for dynamic high-resolution intravital immune imaging. Semin. Immunol. 17, 431-441 (2005).
Przedruki i uprawnienia
