Artykuł metodologiczny

Techniki analityczne do oznaczania bioaktywności tlenku azotu

DOI:

10.3791/3722

⸱

18 czerwca 2012

 ,  ,  ,  , 
1Texas Therapeutics Institute, University of Texas Health Science Center at Houston , 2Deptartment of Pediatrics, Baylor College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endogenna produkcja tlenku azotu (NO) reguluje szeroki zakres funkcji biologicznych. Staje się coraz bardziej oczywiste, że zakłócenie lub rozregulowanie sygnalizacji opartej na NO jest zaangażowane w wiele chorób u ludzi. Metody ilościowego oznaczania istotnych metabolitów NO mogą dostarczyć nowych biomarkerów diagnostycznych lub prognostycznych chorób u ludzi.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tlenek azotu (NO) jest dwuatomowym wolnym rodnikiem, który jest niezwykle krótkotrwały w systemach biologicznych (mniej niż 1 sekunda w krążącej krwi)1. NO może być uważana za jedną z najważniejszych cząsteczek sygnałowych wytwarzanych w naszym organizmie, regulującą podstawowe funkcje, w tym między innymi regulację ciśnienia krwi, odpowiedź immunologiczną i komunikację neuronalną. Dlatego jego dokładne wykrycie i kwantyfikacja w matrycach biologicznych ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia roli NO w zdrowiu i chorobie. Przy tak krótkim fizjologicznym okresie półtrwania NO opracowano alternatywne strategie wykrywania produktów reakcji biochemii NO. Kwantyfikacja istotnych metabolitów NO w wielu kompartmentach biologicznych dostarcza cennych informacji na temat produkcji, biodostępności i metabolizmu NO in vivo. Pobranie próbki z pojedynczego przedziału, takiego jak krew lub osocze, nie zawsze może zapewnić dokładną ocenę stanu NO w całym organizmie, szczególnie w tkankach. Możliwość porównania krwi z wybranymi tkankami u zwierząt doświadczalnych pomoże wypełnić lukę między naukami podstawowymi a medycyną kliniczną, jeśli chodzi o diagnostyczną i prognostyczną użyteczność biomarkerów NO w zdrowiu i chorobie. W związku z tym ekstrapolacja statusu NO w osoczu lub krwi na konkretne tkanki będące przedmiotem zainteresowania nie jest już uzasadnionym podejściem. W związku z tym nadal opracowywane i walidowane są metody, które umożliwiają wykrywanie i kwantyfikację produktów/metabolitów związanych z NO i NO w wielu kompartmentach zwierząt doświadczalnych in vivo. Ustalony paradygmat biochemii NO od produkcji przez syntazy NO do aktywacji rozpuszczalnej cyklazy guanylowej (sGC) do ostatecznego utleniania do azotynów (NO2-) i azotanów (NO3-) może reprezentować tylko część efektów NO in vivo. Interakcja metabolitów pochodzących z NO i NO z tiolami białkowymi, aminami drugorzędowymi i metalami w celu wytworzenia S-nitrozotioli (RSNO), N-nitrozoamin (RNNO) i nitrozylohemu odpowiednio reprezentuje niezależne od cGMP efekty NO i jest prawdopodobnie tak samo ważne fizjologicznie, jak aktywacja sGC przez NO. Prawdziwe zrozumienie NO w fizjologii wywodzi się z eksperymentów in vivo polegających na jednoczesnym pobieraniu próbek z wielu przedziałów. Metodologia tlenku azotu (NO) jest złożoną i często zagmatwaną nauką, która jest przedmiotem wielu debat i dyskusji dotyczących biochemii NO. Wyjaśnienie nowych mechanizmów i szlaków sygnałowych z udziałem NO zależy od naszej zdolności do specyficznego, selektywnego i czułego wykrywania i ilościowego określania NO oraz wszystkich istotnych produktów i metabolitów NO w złożonych matrycach biologicznych. W tym miejscu przedstawiono metodę szybkiej i czułej analizy azotynów i azotanów za pomocą HPLC oraz detekcji wolnego NO w próbkach biologicznych za pomocą chemiluminescencji in vitro opartej na ozonie z pochodną chemiczną w celu określenia molekularnego źródła NO, a także ex vivo z miografią kąpieli narządowej.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Pobieranie krwi pełnej

  1. Pobrać krew żylną od ludzi lub od zwierząt doświadczalnych w probówkach zawierających NEM/EDTA.
  2. Natychmiast odwiruj krew w wirówce stołowej przy 14 300 rcf (względna siła odśrodkowa) przez 7 minut, aby przygotować osocze i osady czerwonych krwinek.
  3. Przygotowanie próbek osocza do analizy metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) i detekcji chemiluminescencyjnej (CLD).
    HPLC: Dodaj objętość zimnego metanolu w stosunku 1:1 do osocza, wiruj i odwiruj z prędkością 13 200 obr./min przez 10 minut, aby wytrącić białka osocza. Zebrać supernatant do analizy HPLC.
    CLD: podwielokrotność próbki i preinkubacja z sulfanilamidem i chlorkiem rtęci w celu specyficznego oznaczenia nitrozotioli.
  4. Przygotować osad krwinek czerwonych do analizy HPLC i CLD.
    HPLC: Dodać osad krwinek czerwonych w stosunku 1:4 do hipotonicznego roztworu do lizy zawierającego 10 mM NEM, 2,5 mM EDTA i 10 mM żelazocyjanku. Dokładnie zwirować, a następnie dodać metanol w stosunku 1:1, wirować i wirować z prędkością 13 200 obr./min przez 10 minut, aby wytrącić białko. Zebrać supernatant do analizy HPLC.
    CLD. Dodać osad krwinek czerwonych w stosunku 1:4 do hipotonicznego roztworu do lizy zawierającego 10 mM EDTA, 2,5 mM EDTA i 10 mM żelazocyjanku. Podwielokrotne próbki do probówek zawierających sulfanilamid i chlorek rtęci w celu specyficznego wykrywania nitrozotioli.

2. Ekstrakcja i przygotowanie tkanek

  1. Aby określić poziomy metabolitów NO w tkankach, należy najpierw pobrać tkankę wolną od krwi w celu przygotowania próbki, jak opisano powyżej. Pełna wymiana krwi odbędzie się poprzez podanie fizjologicznego buforu przez wierzchołek lewej komory. Po usunięciu całej krwi można pobrać interesujące nas tkanki.
  2. Homogenizować próbki tkanek i przygotować próbki zgodnie z powyższym opisem do analizy HPLC i CLD.

3. Izolacja pierścieni aortalnych dla funkcji śródbłonka

Kąpiel narządowa

  1. Myszy będą znieczulane eterem dietylowym, dopóki nie przestaną reagować na szczypanie palców u nóg i ulegną zwichnięciu szyjki macicy przed operacją. Torakotomię wykonuje się w celu odsłonięcia aorty piersiowej i brzusznej. Strzykawkę o rozmiarze 25 G wprowadza się do wierzchołka lewej komory i perfunduje bez krwi za pomocą natlenionego buforu Krebs Henseleit.
  2. Prawy przedsionek jest przecięty, aby zapewnić ujście krwi. Aorta brzuszna zostanie usunięta i oczyszczona z przydanek.
  3. Pierścienie zostaną pocięte na segmenty o długości 2 mm i zamontowane na czterokanałowej kąpieli tkankowej (DMT 720MO, AD Instruments) skąpanej w fizjologicznym roztworze buforowym.
  4. Pierścienie naczyń utrzymuje się w 10-mililitrowych łaźniach narządowych z natlenionym buforem Krebsa (95%O2 i 5%CO2) w temperaturze 37 °C. Na każdym pierścieniu aortalnym umieszcza się jeden gram napięcia wstępnego (odpowiednie napięcie początkowe dla optymalnej funkcji naczynioruchowej, określone w poprzednich eksperymentach). Ośmiokanałowy mostek ósemkowy (Powerlab) i oprogramowanie do akwizycji danych (Chart w wersji 5.2.2) służą do rejestrowania wszystkich pomiarów siły.
  5. Pierścienie pozostawia się do zrównoważenia przez 80 minut, przy czym bufor w każdej kąpieli narządowej jest wymieniany co 20 minut. Po zrównoważeniu przez 80 minut, do każdego pierścienia dodaje się 1 μM fenylefryny w celu submaksymalnego skurczu.
  6. Po ustabilizowaniu zostanie dodany agonista śródbłonka, taki jak acetylocholina, w celu określenia produkcji NO i stopnia rozluźnienia naczyń. Po reakcji na dawkę acetylocholiny, kąpiele zostaną przepłukane i ponownie skurczone, a następnie potraktowane egzogennym źródłem tlenku azotu, nitroprusydkiem sodu, w celu określenia reakcji mięśni gładkich i uzyskania wartości 100% relaksu.
  7. Do kąpieli nie można dodawać zmiataczy NO, aby wyraźnie zilustrować uwalnianie NO i hamowanie rozluźnienia naczyń.

4. Reprezentatywne wyniki

Użycie dedykowanego HPLC ENO-20 zapewnia łatwą w użyciu metodę o wysokiej przepustowości do specyficznego i czułego wykrywania azotynów i azotanów w matrycach biologicznych. Zasada detekcji i oryginalny chromatogram są pokazane na rysunku 1. Metodę tę można zastosować do dowolnej próbki biologicznej do oznaczania azotynów i azotanów. Wykrywanie metabolitów NO na podstawie CLD wymaga etapu chemicznej derywatyzacji w celu określenia molekularnego źródła NO. Układ doświadczalny do jednoczesnej denitrozacji oksydacyjnej i denitrozacji redukcyjnej dla detektora chemiluminescencji pokazano na rysunku 2. Naczynie reakcyjne po prawej stronie jest wypełnione 800 mM żelazocyjankiem o pH PBS 7,4, a naczynie reakcyjne po lewej stronie jest wypełnione mieszaniną jodku potasu / jodu w kwasie octowym w celu denitrozacji redukcyjnej (ryc. 2A). Cała konfiguracja jest pokazana na rysunku 2B. Rysunek 3 ilustruje specyficzne dla grupy testy denitrozacji, które mogą wykrywać i określać ilościowo azotyny, nitrozotiole, nitrozoaminy, a także produkty nitrozylohemu. Metoda ta została wcześniej opisana i zwalidowanaw 4,5 minucie. Te ważne analizy biochemiczne można łatwo skorelować z badaniami funkcjonalnymi izolowanych pierścieni aortalnych w celu określenia produkcji NO w śródbłonku u zwierząt doświadczalnych. Ten klasyczny eksperyment farmakologiczny może łatwo i dokładnie ocenić funkcję i produkcję NO śródbłonka. Pomiar reaktywności naczyń na agonistów śródbłonka, takich jak acetylocholina, może bezpośrednio określić produkcję NO w śródbłonku, która może być następnie skorelowana z biomarkerami biochemicznymi wykrytymi we krwi i tkankach zwierząt doświadczalnych. Typowy obraz reakcji na dawkę acetylocholiny przedstawiono na rycinie 4. Zdrowe myszy kontrolne z normalną funkcją śródbłonka reagują na acetylocholinę relaksując się. Myszy z dysfunkcją śródbłonka (myszy z hipercholesterolemią) wykazują zmniejszone rozluźnienie z powodu zmniejszonej produkcji NO na ten sam bodziec.

figure-protocol-1
Rysunek 1. Zasada wykrywania azotynów i azotanów za pomocą ENO-20 i chromatogramu próbki. (Góra) Schemat metody wykrywania azotynów i azotanów ENO-20. (na dole) Standardowy chromotogram 10 pmol azotynu i azotanu wstrzykniętego do ENO-20 (100 μl 100 nM roztworu azotynów i azotanów). Czułość 1 nM dla każdego anionu o objętości wtrysku 100 μl. Brak ingerencji w białko lub gatunki kolorowe.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Układ doświadczalny CLD wykorzystujący zarówno denitrozację oksydacyjną przez żelazocyjanek, jak i denitrozację redukcyjną przy użyciu testu jodku/jodu z detekcją fazy gazowej oczyszczonego gazowego tlenku azotu.

figure-protocol-3
Rysunek 3. (Panel A) Chemiluminescencyjna detekcja azotynów, RSNO, RNNO w redukcyjnym teście denitrozacji przez wstępną inkubację próbki z odczynnikami chemicznymi specyficznymi dla grupy. Odejmowanie obszarów pików umożliwia wykrywanie azotynów i RSNO. (Panel B) Chemiluminescencyjna detekcja gatunków nitrozylu hemowego za pomocą utleniającego roztworu denitrozacji żelazocyjanku. Metoda ta jest specyficzna dla produktów NO-hemowych bez reaktywności krzyżowej z RSNO (GSNO lub SNO-albuminą) lub RNNO (NO-pirolidyną i N-nitrozoalbuminą).

figure-protocol-4
Rysunek 4. Kąpiel narządowa ex vivo na izolowanych pierścieniach aortalnych zapewnia bezpośredni pomiar produkcji NO w śródbłonku, który można następnie skorelować z biomarkerami biochemicznymi wykrywanymi przez HPLC i CLD. Rysunek ten ilustruje zmniejszoną relaksację u myszy z dysfunkcją śródbłonka z powodu zmniejszonej produkcji NO.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisane tutaj metody oznaczania ilościowego istotnych metabolitów NO w wielu kompartmentach biologicznych pozwolą na pobranie odcisków palców biologii NO w zdrowiu i chorobie, które można skorelować z funkcjonalnymi pomiarami NO przez śródbłonek. Metody te wymagają prostego przygotowania próbki z możliwością dostosowania do wysokiej przepustowości. Względna ilość tych cząsteczek może pomóc w zrozumieniu produkcji NO i jego losów metabolicznych w wielu eksperymentalnych modelach choroby, a nawet w seryjnych próbkach od lu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Hong Jiang, Ph.D. i Deepa Parathasarthy, MPH, BDS za pomoc techniczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
N-etylomaleimidThermo Fisher Scientific, Inc.23030
EDTASigma-AldrichE7889
Fluka żelazocyjanku potasu60299
HPLCEicom CorpENO-20
AutosamplerAlcott
DMT MyographADInstruments
PowerLabADInstruments
Chemiluminescencyjna wirówka EcoPhysicsCLD 88Y
Eppendorf5415D
AcetylocholinaSigma-AldrichA6625
R-(-) FenylefrynaSigma-AldrichP6126

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kelm, M. Nitric oxide metabolism and breakdown. Biochimica et Biophysica Acta. 1411, 273-289 (1999).
  2. Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetycholine. Nature. 288, 373-376 (1980).
  3. Ignarro, L. J. Endothelium-derived relaxing factor produced and released from artery and vein is nitric oxide. Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 84, 9265-9269 (1987).
  4. Feelisch, M. Concomitant S-, N-, and heme-nitrosylation in biological tissues and fluids: implications for the fate of NO in vivo. FASEB J. 16, 1775-1785 (2002).
  5. Wang, X. Measurement of nitric oxide levels in the red cell: validation of tri-iodide-based chemiluminescence with acid-sulfanilamide pretreatment. J. Biol. Chem. 281, 26994-27002 (2006).
  6. Angelo, M., Singel, D. J., Stamler, J. S. An S-nitrosothiol (SNO) synthase function of hemoglobin that utilizes nitrite as a substrate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 8366-8371 (2006).
  7. Bryan, N. S. Bound NO in human red blood cells: fact or artifact. Nitric Oxide. 10, 221-228 (2004).
  8. Feelisch, M. Tissue Processing of Nitrite in Hypoxia: An Intricate Interplay of Nitric Oxide-Generating and -Scavenging Systems. J. Biol. Chem. 283, 33927-33934 (2008).
  9. Bryan, N. S., Grisham, M. B. Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples. Free Radic. Biol. Med. 43, 645-657 (2007).
  10. Lundberg, J. O., Weitzberg, E. NO generation from inorganic nitrate and nitrite: Role in physiology, nutrition and therapeutics. Arch. Pharm. Res. 32, 1119-1126 (2009).
  11. Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat. Rev. Drug. Discov. 7, 156-157 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Nitric Oxide DetectionNitrite Nitrate AnalysisHPLC ChemiluminescenceOrgan Bath MyographyBlood Plasma ProcessingTissue Harvest PreparationRSNO RNNO AssayEndothelial Function AssessmentSoluble Guanylyl CyclaseNitric Oxide Metabolites

Powiązane artykuły