Endogenna produkcja tlenku azotu (NO) reguluje szeroki wachlarz funkcji biologicznych. Coraz wyraźniej staje się jasne, że zaburzenia lub dysregulacja sygnalizacji opartej na NO są zaangażowane w wiele ludzkich chorób. Metody ilościowego oznaczania odpowiednich metabolitów NO mogą dostarczyć nowych diagnostycznych lub prognostycznych biomarkerów chorób ludzkich.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Techniki analityczne do badania bioaktywności tlenku azotu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Tlenek azotu (NO) jest dwuatomowym wolnym rodnikiem, który jest niezwykle krótkotrwały w systemach biologicznych (mniej niż 1 sekunda we krwi krążącej)1. NO można uznać za jedną z najważniejszych cząsteczek sygnałowych produkowanych w naszym organizmie, regulującą kluczowe funkcje, w tym między innymi regulację ciśnienia krwi, odpowiedź immunologiczną i komunikację neuronalną. Dlatego jego dokładne wykrywanie i ilościowe oznaczanie w matrycach biologicznych jest krytyczne dla zrozumienia roli NO w zdrowiu i chorobie. Ze względu na tak krótki fizjologiczny okres półtrwania NO, opracowano alternatywne strategie wykrywania produktów reakcji biochemii NO. Ilościowe oznaczanie odpowiednich metabolitów NO w wielu przedziałach biologicznych dostarcza cennych informacji dotyczących produkcji NO in vivo, jego biodostępności i metabolizmu. Samo pobieranie próbek z jednego przedziału, takiego jak krew lub osocze, nie zawsze może zapewnić dokładną ocenę stanu NO w całym organizmie, szczególnie w tkankach. Możliwość porównania krwi z wybranymi tkankami u zwierząt doświadczalnych pomoże wypełnić lukę między nauką podstawową a medycyną kliniczną w zakresie użyteczności diagnostycznej i prognostycznej biomarkerów NO w zdrowiu i chorobie. Z tego powodu ekstrapolacja stanu NO w osoczu lub krwi na konkretne tkanki nie jest już uznawana za właściwe podejście. W rezultacie stale opracowywane i walidowane są metody pozwalające na wykrywanie i ilościowe oznaczanie NO oraz produktów/metabolitów związanych z NO w wielu przedziałach zwierząt doświadczalnych in vivo. Ustanowiony paradygmat biochemii NO – od produkcji przez syntazy NO, przez aktywację rozpuszczalnej cyklazy guanylowej (sGC), aż po końcowe utlenienie do azotynów (NO2-) i azotanów (NO3-) – może reprezentować jedynie część efektów NO in vivo. Oddziaływanie NO i pochodnych metabolitów NO z tiolami białkowymi, aminami wtórnymi i metalami w celu tworzenia odpowiednio S-nitrozotioli (RSNO), N-nitrozamin (RNNO) i nitrosylohemu reprezentuje efekty NO niezależne od cGMP i prawdopodobnie są one fizjologicznie równie ważne jak aktywacja sGC przez NO. Prawdziwe zrozumienie roli NO w fizjologii wynika z eksperymentów in vivo polegających na jednoczesnym pobieraniu próbek z wielu przedziałów. Metodyka badania tlenku azotu (NO) jest złożoną i często mylącą dziedziną nauki, będącą przedmiotem wielu debat i dyskusji dotyczących biochemii NO. Wyjaśnienie nowych mechanizmów i szlaków sygnałowych z udziałem NO zależy od naszej zdolności do specyficznego, selektywnego i czułego wykrywania oraz ilościowego oznaczania NO oraz wszystkich istotnych produktów i metabolitów NO w złożonych matrycach biologicznych. Przedstawiamy tutaj metodę szybkiej i czułej analizy azotynów i azotanów za pomocą HPLC, a także wykrywanie wolnego NO w próbkach biologicznych z wykorzystaniem chemiluminescencji opartej na ozonie in vitro z derywatyzacją chemiczną w celu określenia molekularnego źródła NO, a także metodą ex vivo z wykorzystaniem miografii w kąpieli organowej.
Protokół
1. Pobieranie krwi pełnej
- Pobrać krew żylną od ludzi lub zwierząt doświadczalnych do probówek zawierających NEM/EDTA.
- Natychmiast wirować krew w wirówce stołowej przy 14 300 rcf (względna siła odśrodkowa) przez 7 minut w celu przygotowania osocza oraz osadu erytrocytów.
- Przygotować próbki osocza do analizy metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) oraz detekcji chemiluminescencyjnej (CLD).
HPLC: Do osocza dodać objętościowo 1:1 zimny metanol, wymieszać w wortexie, a następnie wirować przy 13 200 rpm przez 10 minut w celu wytrącenia białek osocza. Zebrać nadfiltr do analizy HPLC.
CLD: Odprowadzić alikwot próbki i przeprowadzić preinkubację z sulfanilamidem i chlorkiem rtutowego w celu specyficznego oznaczenia nitrosotioli. - Przygotować osad erytrocytów do analizy HPLC i CLD.
HPLC: Do roztworu hipotonicznego do lizy zawierającego 10 mM NEM, 2,5 mM EDTA i 10 mM żelazocyjanku dodać osad erytrocytów w stosunku 1:4. Dokładnie wymieszać w wortexie, a następnie dodać metanol w stosunku 1:1, wymieszać w wortexie i wirować przy 13 200 rpm przez 10 minut w celu wytrącenia białek. Zebrać nadfiltr do analizy HPLC.
CLD: Do roztworu hipotonicznego do lizy zawierającego 10 mM EDTA, 2,5 mM EDTA i 10 mM żelazocyjanku dodać osad erytrocytów w stosunku 1:4. Przenieść alikwoty próbek do probówek zawierających sulfanilamid i chlorek rtutowego w celu specyficznej detekcji nitrosotioli.
2. Ekstrakcja i przygotowanie tkanek
- Aby oznaczyć poziom metabolitów NO w tkankach, w pierwszej kolejności należy pobrać tkankę pozbawioną krwi do przygotowania próbek zgodnie z opisaną powyżej procedurą. Pełna wymiana krwi zostanie przeprowadzona poprzez infuzję buforu fizjologicznego przez wierzchołek lewej komory. Po usunięciu całej krwi można pobrać interesujące nas tkanki.
- Zhomogenizować próbki tkanek i przygotować je do analizy HPLC oraz CLD zgodnie z opisem powyżej.
3. Izolacja pierścieni aorty do oceny funkcji śródbłonka
Kąpiel tkankowa
- Myszy zostaną znieczulone dietyloetrem do momentu utraty reakcji na uciśnięcie palca, a następnie poddane dyslokacji szyjnej przed operacją. Wykonuje się torakotomię w celu odsłonięcia aorty klatki piersiowej i brzusznej. Strzykawkę o rozmiarze 25 G wprowadza się do wierzchołka lewej komory i przepłukuje ją z krwi natlenionym buforem Krebsa-Henseleita.
- Przecina się prawy przedsionek, aby umożliwić odpływ krwi. Aortę brzuszną należy usunąć i oczyścić z osłonki zewnętrznej.
- Pierścienie naczyniowe zostaną pocięte na segmenty o długości 2 mm i umieszczone w czterokanałowej kąpieli tkankowej (DMT 720MO, AD Instruments) wypełnionej fizjologicznym roztworem buforowym.
- Pierścienie naczyń utrzymuje się w 10-ml kąpielach z natlenionym buforem Krebsa (95% O2 i 5% CO2) w temperaturze 37 °C. Na każdy pierścień aorty nakłada się wstępne napięcie 1 g (odpowiednie napięcie początkowe dla optymalnej funkcji naczynioruchowej, określone w poprzednich eksperymentach). Do rejestracji wszystkich pomiarów siły wykorzystuje się ośmiokanałowy mostek oktalny (Powerlab) oraz oprogramowanie do akwizycji danych (Chart wersja 5.2.2).
- Pierścienie pozostawia się do równowagi przez 80 minut, wymieniając bufor w każdej kąpieli co 20 min. Po 80-minutowej równowadze do każdego pierścienia dodaje się 1 μM fenylefryny w celu wywołania skurczu podmaksymalnego.
- Po stabilizacji dodaje się agonistę śródbłonkowego, taki jak acetylocholina, aby określić produkcję NO oraz stopień rozkurczu naczynia. Po badaniu zależności dawka-odpowiedź na acetylocholinę kąpiele zostaną wypłukane, naczynia ponownie skurczone, a następnie poddane działaniu zewnętrznego źródła tlenku azotu, nitroprusydu sodu, aby określić reaktywność mięśni gładkich i uzyskać wartość dla 100% rozkurczu.
- Do kąpieli można dodać wychwytywacze NO, aby wyraźnie zobrazować uwalnianie NO i hamowanie rozkurczu naczyń.
4. Reprezentatywne wyniki
Zastosowanie dedykowanego systemu HPLC ENO-20 zapewnia łatwą w obsłudze i wysokoprzepustową metodę specyficznego i czułego wykrywania azotynów i azotanów w matrycach biologicznych. Zasada detekcji oraz oryginalny chromatogram przedstawione są na Rysunku 1. Metodę tę można zastosować do dowolnej próbki biologicznej w celu oznaczenia azotynów i azotanów. Detekcja metabolitów NO oparta na CLD wymaga etapu derywatyzacji chemicznej w celu określenia molekularnego źródła NO. Układ eksperymentalny do jednoczesnej oksydacyjnej i redukcyjnej denitrozacji dla detektora chemiluminescencyjnego przedstawiono na Rysunku 2. Naczynie reakcyjne po prawej stronie wypełnione jest 800mM ferycyjanku w PBS pH 7.4, a naczynie reakcyjne po lewej stronie mieszaniną jodku potasu/jodu w kwasie octowym do denitrozacji redukcyjnej (Rysunek 2A). Cały układ przedstawiono na Rysunku 2B. Rysunek 3 ilustruje specyficzne dla grup analizy denitrozacji, które pozwalają wykryć i ilościowo określić azotyny, nitrozotiol, nitrozaminy oraz produkty nitrozylu hemu. Metoda ta została wcześniej opisana i zwalidowana4,5. Te istotne analizy biochemiczne można łatwo skorelować z badaniami funkcjonalnymi na wyizolowanych pierścieniach aorty w celu oznaczenia produkcji NO przez śródbłonek u zwierząt doświadczalnych. Ten klasyczny eksperyment farmakologiczny pozwala na łatwą i dokładną ocenę funkcji i produkcji NO w śródbłonku. Pomiar reaktywności naczyń na agoniści śródbłonkowi, takie jak acetylocholina, pozwala bezpośrednio określić produkcję NO przez śródbłonek, co następnie można skorelować z biomarkerami biochemicznymi wykrytymi we krwi i tkankach zwierząt doświadczalnych. Typowa reprezentacja odpowiedzi na dawkę acetylocholiny przedstawiona jest na Rysunku 4. Zdrowe myszy kontrolne z prawidłową funkcją śródbłonka reagują na acetylocholinę rozkurczem. Myszy z dysfunkcją śródbłonka (myszy hipercholesterolemiczne) wykazują zmniejszony rozkurcz ze względu na obniżoną produkcję NO w odpowiedzi na ten sam bodziec.
Rysunek 1. Zasada wykrywania azotynów i azotanów za pomocą ENO-20 oraz chromatogram próbki. (Góra) Schemat metody ENO-20 do wykrywania azotynów i azotanów. (Dół) Standardowy chromatogram 10 pmol azotynów i azotanów wstrzykniętych do ENO-20 (100 μl roztworu azotynów i azotanów o stężeniu 100 nM). Czułość wynosząca 1 nM dla każdego anionu przy objętości wtrysku 100 μl. Brak interferencji z białkami lub związkami barwnymi.
Rycina 2. Układ eksperymentalny CLD wykorzystujący zarówno utleniającą denitrozację za pomocą żelazocyjanku, jak i redukującą denitrozację z zastosowaniem analizy jodkowej/jodynowej z detekcją w fazie gazowej usuwanego tlenku azotu.
Rysunek 3. (Panel A) Detekcja chemiluminescencyjna azotynów, RSNO oraz RNNO w teście redukcyjnego denitrozowania poprzez preinkubację próbki z odczynnikami chemicznymi specyficznymi dla danej grupy. Odjęcie pól powierzchni pików umożliwia detekcję azotynów i RSNO. (Panel B) Chemiluminescencyjna detekcja gatunków nitrozylohemu przy użyciu roztworu ferycyjanku do oksydacyjnego denitrozowania. Metoda ta jest specyficzna dla produktów NO-hem i nie wykazuje reaktywności krzyżowej z RSNO (GSNO lub SNO-albuminą) ani RNNO (NO-pirolidyną i N-nitrozoalbuminą).
Rysunek 4. Ex vivo badanie w kąpieli organowej na izolowanych pierścieniach aorty zapewnia bezpośredni pomiar produkcji NO przez śródbłonek, który można następnie skorelować z biomarkerami biochemicznymi wykrytymi za pomocą HPLC i CLD. Rysunek ten ilustruje zmniejszony rozkurcz u myszy z dysfunkcją śródbłonka wynikający ze zmniejszonej produkcji NO.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Metody opisane tutaj w celu ilościowego oznaczenia istotnych metabolitów NO w wielu przedziałach biologicznych pozwolą na stworzenie profilu biologii NO w zdrowiu i chorobie, który można skorelować z funkcjonalnymi pomiarami NO w śródbłonku. Metody te wymagają prostego przygotowania próbek z potencjałem do adaptacji w systemach wysokoprzepustowych. Względna ilość tych cząsteczek może pomóc w zrozumieniu produkcji NO i jego losów metabolicznych w szeregu eksperymentalnych modeli chorób, a nawet w próbkach seryjnych pobran...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować dr. Hong Jiang oraz Deepa Parathasarthy, MPH, BDS za pomoc techniczną.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| N-etylomaleimid | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 23030 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Ferrocyjanek potasu | Fluka | 60299 | |
| HPLC | Eicom Corp | ENO-20 | |
| Autosampler | Alcott | ||
| Miograf DMT | ADInstruments | ||
| PowerLab | ADInstruments | ||
| Detektor chemiluminescencyjny | EcoPhysics | CLD 88Y | |
| Wirówka | Eppendorf | 5415D | |
| Acetylocholina | Sigma-Aldrich | A6625 | |
| R-(-)-fenylefryna | Sigma-Aldrich | P6126 |
Bibliografia
- Kelm, M. Nitric oxide metabolism and breakdown. Biochimica et Biophysica Acta. 1411, 273-289 (1999).
- Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetycholine. Nature. 288, 373-376 (1980).
- Ignarro, L. J. Endothelium-derived relaxing factor produced and released from artery and vein is nitric oxide. Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 84, 9265-9269 (1987).
- Feelisch, M. Concomitant S-, N-, and heme-nitrosylation in biological tissues and fluids: implications for the fate of NO in vivo. FASEB J. 16, 1775-1785 (2002).
- Wang, X. Measurement of nitric oxide levels in the red cell: validation of tri-iodide-based chemiluminescence with acid-sulfanilamide pretreatment. J. Biol. Chem. 281, 26994-27002 (2006).
- Angelo, M., Singel, D. J., Stamler, J. S. An S-nitrosothiol (SNO) synthase function of hemoglobin that utilizes nitrite as a substrate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 8366-8371 (2006).
- Bryan, N. S. Bound NO in human red blood cells: fact or artifact. Nitric Oxide. 10, 221-228 (2004).
- Feelisch, M. Tissue Processing of Nitrite in Hypoxia: An Intricate Interplay of Nitric Oxide-Generating and -Scavenging Systems. J. Biol. Chem. 283, 33927-33934 (2008).
- Bryan, N. S., Grisham, M. B. Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples. Free Radic. Biol. Med. 43, 645-657 (2007).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E. NO generation from inorganic nitrate and nitrite: Role in physiology, nutrition and therapeutics. Arch. Pharm. Res. 32, 1119-1126 (2009).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat. Rev. Drug. Discov. 7, 156-157 (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
