Analiza fenotypowa i izolacja mysich hematopoetycznych komórek macierzystych oraz progenitorów zadeklarowanych do określonej linii

Podsumowanie

Opisano metodę analizy rozkładu progenitorów krwiotwórczych szpiku kostnego w cytometrii przepływowej, a także efektywnej izolacji wysoko oczyszczonych komórek macierzystych krwiotwórczych (HSCs). Procedura izolacji opiera się przede wszystkim na magnetycznym wzbogaceniu komórek c-Kit+ oraz sortowaniu komórek w celu oczyszczenia HSCs do badań komórkowych i molekularnych.

Streszczenie

Szpik kostny jest głównym miejscem, w którym w organizmie dorosłego osobnika bytują i różnicują się HSC oraz bardziej dojrzałe komórki progenitorowe linii krwiotwórczych. HSC stanowią niewielką populację komórek pluripotencjalnych, zdolnych do generowania wszystkich linii komórek krwi przez całe życie.¹Molekularna analiza homeostazy HSC w szpiku kostnym ma istotne znaczenie dla hematopoezy, onkologii oraz medycyny regeneracyjnej. Opisujemy protokół znakowania przeciwciałami fluorescencyjnymi oraz procedurę bramkowania elektronicznego w cytometrii przepływowej w celu oceny podzbiorów progenitorów hematopoetycznych i rozkładu HSC u poszczególnych myszy (Ryc. 1). Ponadto opisujemy metodę rozległego wzbogacania populacji progenitorów krwiotwórczych, a także długoterminowych (LT) i krótkoterminowych (ST) HSC zdolnych do rekonstrukcji, z połączonych zawiesin komórek szpiku kostnego poprzez magnetyczne wzbogacanie komórek wykazujących ekspresję c-Kit. Otrzymany preparat komórkowy może być wykorzystany do sortowania wybranych subpopulacji do badań in vitro oraz in vivo badania funkcjonalne (Ryc. 2).

Zarówno osteoblasty beleczkowe^2,3, jak i śródbłonek zatokowy⁴ tworzą funkcjonalne nisze wspierające HSC w szpiku kostnym. Kilka mechanizmów w niszy osteoblastycznej, w tym podzbiór osteoblastów N-kadheryna⁺³ oraz oddziaływanie receptora tyrozynowej kinazy Tie2 eksprymowanego w HSC z jego ligandem angiopoetyną-1⁵, współdziała w określaniu stanu spoczynku HSC. „Hibernacja” w szpiku kostnym jest kluczowa dla ochrony HSC przed replikacją i ewentualnym wyczerpaniem w wyniku nadmiernej aktywności cyklicznej⁶. Bodźce egzogenne działające na komórki wrodzonego układu odpornościowego, takie jak ligandy receptorów Toll-podobnych⁷ i interferon-α⁶, mogą również indukować proliferację i różnicowanie HSC w progenitorów zaangażowanych w konkretne linie komórkowe. Niedawno opisano populację uśpionych mysich HSC w obrębie populacji lin^- c-Kit⁺ Sca-1⁺ CD150⁺ CD48^- CD34^-8. Sortowanie komórek na podstawie ekspresji CD34 z zawiesiny komórkowej wzbogaconej w progenitorów krwiotwórczych, zgodnie z opisem w niniejszej pracy, pozwala na izolację zarówno spoczynkowych, samoodnawiających się LT-HSC, jak i ST-HSCs⁹. Podobna procedura oparta na usuwaniu komórek linii pozytywnych i sortowaniu LT-HSC za pomocą przeciwciał przeciwko CD48 i Flk2 została opisana wcześniej¹⁰. W niniejszym raporcie przedstawiamy protokół fenotypowej charakterystyki i analizy cyklu komórkowego ex vivo progenitorów krwiotwórczych, który może być użyteczny w monitorowaniu hematopoezy w różnych warunkach fizjologicznych i patologicznych. Ponadto opisujemy procedurę sortowania FACS dla HSC, która może być wykorzystana do określenia czynników i mechanizmów regulujących ich samoodnawianie, ekspansję i różnicowanie w badaniach z zakresu biologii komórki i transdukcji sygnałów, a także w transplantologii.

Protokół

1. Przygotowanie zawiesiny komórek z szpiku kostnego

1. Uśmierć mysz, umieść zwierzę w stalowej kuwecie i spryskaj brzuch oraz grzbiet 70% etanolem. Pobierz kości udowe, piszczelowe z tylnych kończyn oraz kręgosłup.
2. Precyzyjnie usuń wszystkie pozostałości tkanek miękkich z kręgosłupa za pomocą nożyczek o ostrym czubku, a z kości kończyn za pomocą gazy. Przechowuj kości w probówce Falcon 50 mL z 30 mL pożywki RPMI zawierającej 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS), uzupełnionej o 50 μM β-merkaptoetanolu, 100 μM nieessentialnych aminokwasów MEM, 1 mM pirogronianu sodu MEM, 2 mM L-glutaminy, 100 μg/ml streptomycyny i 100 U/ml penicyliny.
3. Wyłóż dno wcześniej wysterylizowanego moździerza sterylnymi filtrami.
4. Przenieś kości do moździerza i przykryj je warstwą filtrów, aby stworzyć powierzchnię tarcia.
5. Przygotuj probówkę Falcon 50 mL wyposażoną w filtr Falcon.
6. Rozdrobnij kości za pomocą tłuczka, aż do uzyskania homogenicznej zawiesiny komórkowej.
7. Przenieś zawiesinę do probówki.
8. Dodaj do moździerza 5 mL świeżej kompletnej pożywki RPMI, aby wypłukać i zebrać pozostałe komórki.
9. Powtarzaj dwa ostatnie kroki, aż homogenizowane kości będą wyglądać na oczyszczone.
10. Przenieś zawiesinę komórkową do nowej probówki i przefiltruj ją w celu usunięcia pozostałych fragmentów tkanek.
11. Wiruj probówkę z prędkością 1,500 rpm przez 5 min i ostrożnie usuń nadsącz poprzez aspirację. Upewnij się, że osad komórkowy nie został naruszony.

2. Analiza fenotypowa

1. Zawiesić ponownie i przemyć komórki od poszczególnych myszy w 15 mL PBS i 2% FBS.
2. Wirować probówkę z prędkością 1 500 rpm przez 5 min i ostrożnie usunąć nadsącz poprzez aspirację. Należy uważać, aby nie naruszyć osadu.
3. Zawiesić osad w 5 mL PBS i 2% FBS, a następnie policzyć komórki.
4. Przenieść 1×10⁶ komórek na dołek do płytki 96-dołkowej z okrągłym dnem.
5. Wirować płytkę z prędkością 1 500 rpm przez 5 min.
6. Przygotować mieszaninę przeciwciał monoklonalnych (mAbs) skierowanych przeciwko następującym markerom powierzchniowym. Rozcieńczyć je w PBS i 2% FBS zgodnie z poniższymi wskazazkami w celu zabarwienia komórek:
   • CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, Ter119, NK1.1 sprzężone z PE-Cy5 1:200
   • c-Kit sprzężone z APC 1:100
   • Sca1 sprzężone z biotyną 1:50
   • CD34 sprzężone z FITC 1:50
   • FcγR sprzężone z PE 1:100
   • IL-7R sprzężone z PE-Cy7 1:100
7. Usunąć nadsącz i dodać 50 μL mieszaniny mAbs do każdego dołka. Rozbić skupiska do pojedynczych komórek poprzez pipetowanie.
8. Inkubować komórki przez 20 min w ciemności w temperaturze 4 °C.
9. Przemyć komórki dwukrotnie 150 μL PBS i 2% FBS.
10. Wirować płytkę z prędkością 1 500 rpm przez 5 min i usunąć nadsącz poprzez odwrócenie płytki.
11. Rozcieńczyć streptawidynę w PBS i 2% FBS zgodnie z poniższymi wskazazkami w celu zabarwienia komórek:
    • Streptawidyna sprzężona z APC-Cy7 1:300
12. Dodać 50 μL roztworu do każdego dołka. Rozbić skupiska do zawiesiny pojedynczych komórek poprzez pipetowanie.
13. Inkubować komórki przez 10 min w ciemności w temperaturze 4 °C.
14. Przemyć komórki dwukrotnie 150 μL PBS i 2% FBS.
15. Wirować płytkę z prędkością 1 500 rpm przez 5 min i usunąć nadsącz.
16. Zawiesić ponownie komórki w 100 μL PBS i 2% FBS.
17. Przeanalizować próbki za pomocą FACS.

3. Magnetyczne wzbogacanie populacji komórek c-Kit⁺

1. Przygotować roztwór buforowy zawierający PBS, pH 7.2, 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) oraz 2 mM EDTA.
2. Resuspendować pellet komórek szpiku kostnego pochodzących z co najmniej 10 myszy w 1 mL roztworu buforowego zawierającego przeciwciało mAb przeciwko c-Kit sprzężone z APC w rozcieńczeniu 1:50.
3. Inkubować komórki przez 20 min w ciemności w temperaturze 4 °C.
4. Przemyć komórki dwukrotnie 40 mL roztworu buforowego.
5. Wirować probówkę z prędkością 1 500 rpm przez 5 min i ostrożnie usunąć nadsącz poprzez aspirację. Należy uważać, aby nie naruszyć pelletu.
6. Resuspendować pellet komórek i dodać 50 μl Anti-APC MicroBeads bezpośrednio do pelletu dla każdej uśpionej myszy.
7. Dokładnie wymieszać i inkubować przez 20 min w ciemności w temperaturze 4 °C.
8. Przemyć komórki, dodając 40 mL roztworu buforowego, a następnie wirować z prędkością 1 500 rpm przez 5 min. Całkowicie odessać nadsącz.
9. Resuspendować pellet komórek w wielokrotności 4 mL roztworu buforowego na każde trzy uśpione myszy.
10. Umieścić kolumny MACS LS w polu magnetycznym odpowiedniego separatora MACS Separator. Stosować jedną kolumnę na każde trzy uśpione myszy.
11. Przygotować kolumny poprzez przemycie ich 4 mL roztworu buforowego.
12. Nanieść zawiesinę komórkową na kolumny.
13. Zebrać nieoznaczone komórki, które przepłynęły przez kolumnę, i przemyć kolumnę 4 mL roztworu buforowego. Etapy płukania wykonać poprzez trzykrotne dodanie 4 mL roztworu buforowego. Dodać nowy bufor, gdy zbiornik kolumny zostanie opróżniony.
14. Wyjąć kolumny z separatora i umieścić każdą z nich nad probówką typu Falcon 15 mL.
15. Nanieść pipetą 4 mL roztworu buforowego na każdą kolumnę. Bezzwłocznie wypłukać magnetycznie oznaczone komórki, wcisnąć tłok do wnętrza kolumny.
16. Wirować probówki z prędkością 1 500 rpm przez 5 min i ostrożnie usunąć nadsącz poprzez aspirację.
17. Resuspendować każdy pellet w 1 mL roztworu buforowego i zebrać wszystkie pellety do jednej probówki typu Falcon 15 mL.

4. Sortowanie komórek macierzystych krwi oraz progenitorów zdeterminowanych liniowo

1. Przygotować mieszaninę przeciwciał monoklonalnych (mAbs) skierowanych przeciwko następującym markerom powierzchniowym. Rozcieńczyć je zgodnie z instrukcją w 500 μL PBS i 2% FBS w celu barwienia komórek.
   • CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, Ter119, NK1.1 sprzężone z PE-Cy5 1:200
   • c-Kit sprzężone z APC 1:100
   • Sca-1 sprzężone z biotyną 1:50
   • CD34 sprzężone z FITC 1:50
   • FcγR sprzężone z PE 1:100
2. Wirować probówkę z poprzedniej sekcji przy 1,500 rpm przez 5 min i ostrożnie usunąć nadsącz poprzez aspirację.
3. Dodać mieszaninę mAbs do osadu. Rozbić osad do postaci zawiesiny pojedynczych komórek poprzez pipetowanie.
4. Inkubować komórki przez 20 min w ciemności w temperaturze 4 °C.
5. Przemyć komórki dwukrotnie 14 mL PBS i 2% FBS.
6. Wirować probówkę przy 1,500 rpm przez 5 min i odrzucić nadsącz.
7. Rozcieńczyć streptawidynę zgodnie z instrukcją w 500 μL PBS i 2% FBS w celu barwienia komórek.
   • Streptawidyna sprzężona z APC-Cy7 1:300
8. Dodać roztwór do probówki. Rozbić osad do postaci zawiesiny pojedynczych komórek poprzez pipetowanie.
9. Inkubować komórki przez 10 min w ciemności w temperaturze 4 °C.
10. Przemyć komórki dwukrotnie 14 mL PBS i 2% FBS.
11. Wirować probówkę przy 1,500 rpm przez 5 min i odrzucić nadsącz.
12. Resuspendować komórki w 500 μL PBS i 2% FBS.
13. Przenieść i przefiltrować zawiesinę komórkową do nowej probówki 5 mL, aby wyeliminować agregaty komórkowe, które mogą zakłócać procedurę sortowania.
14. Dodać 5 μL 7-AAD (użyć w rozcieńczeniu 1:100) do zawiesiny komórkowej, aby wykluczyć martwe komórki 7-AAD⁺ z sortowanych populacji.
15. Posortować komórki za pomocą BD FACSAria zgodnie z następującymi fenotypami:
    • komórki LKS: lin^- c-Kit⁺ Sca-1⁺
    • LT-HSCs: LKS CD34^-
    • ST-HSCs: LKS CD34⁺
    • GMPs: lin^- c-Kit⁺ Sca-1^low FcγR^high CD34⁺
    • MEPs: lin^- c-Kit⁺ Sca-1^low FcγR^low CD34^-
    • CMPs: lin^- c-Kit⁺ Sca-1^low FcγR^low CD34⁺

5. Reprezentatywne wyniki

Rycina 1 przedstawia przykład procedury bramkowania elektronicznego w celu wyznaczenia wspólnych progenitorów limfoidalnych (CLPs) jako komórek Lin^-/c-Kit^lo/interleukiny (IL)-7R⁺; komórek Lin^-/c-Kit⁺/Sca-1⁺ (LKS) oraz Lin^-/c-Kit⁺/Sca-1^lo (c-Kit⁺); z bramy c-Kit⁺ identyfikowane są wspólne progenitory mieloidalne (CMPs) jako komórki FcγR^loCD34⁺, progenitory granulocytów/monocytów (GMPs) jako komórki FcγR^hiCD34⁺ oraz progenitory megakariocytów/erytrocytów (MEPs) jako komórki FcγR^loCD34^-; z bramy LKS identyfikowane są odpowiednio LT-HSC i ST-HSC jako komórki CD34^- oraz CD34⁺. Tę zawiesinę komórek szpiku kostnego można wzbogacić w komórki c-Kit⁺ za pomocą kulek magnetycznych (Ryc. 2); następnie LT-HSC i ST-HSC można wyseparować na podstawie ekspresji CD34, a pozostałe progenitory zgodnie z opisanym powyżej fenotypem.

Komórki HSC można analizować za pomocą konfokalnej mikroskopii obrazowania na żywo, jak pokazano na Ryc. 4, gdzie komórki CD34^- barwiono związkiem wiążącym nukleotydy – chinakryną¹¹, a także barwnikiem jądrowym red (DRAQ5). W komórkach HSC, ale nie w GMP, w cytoplazmie widoczne są pęcherzyki dodatnie dla chinakryny¹². Ponadto posortowane komórki HSC mogą być wykorzystane w eksperymentach funkcjonalnych, co zademonstrowano na ryc. 5, która przedstawia wzrost stężenia cytosolowego Ca²⁺ w LT-HSC poprzez aktywację purynergicznych receptorów P2 po ekspozycji na adenozynotrifosforan (ATP) i jonomycynę¹².

Rysunek 1. Reprezentatywna analiza na wykresach kropkowych komórek Lin- z szpiku kostnego. Procedura bramkowania elektronicznego w cytometrze przepływowym w celu identyfikacji i oceny progenitorów hematopoetycznych oraz HSC z zawiesiny komórek szpiku kostnego barwionych zgodnie z opisem w tekście protokołu.

Rycina 2. Schemat selektywnego wzbogacania komórek c-Kit⁺ z szpiku kostnego.

Rycina 3. Analiza cyklu komórkowego elektronicznie bramkowanych komórek LKS CD34^- HSC u zdrowych kontroli oraz u myszy z IBD, barwionych przeciwciałem przeciwko Ki-67 i DAPI. Komórki utrwalono i permeabilizowano za pomocą buforów Lyse/Fix oraz Perm, a następnie barwiono koniugatem Ki-67 z FITC oraz DAPI w stężeniu 1 μg/ml. Komórki w cyklu są ledwo wykrywalne, jeśli w ogóle, w populacji LKS CD34^- HSC zdrowych kontroli¹².

Rysunek 4. Konfokalna mikroskopia obrazowania na żywo CD34^- HSC i GMP wyselekcjonowanych metodą FACS, barwionych związkiem wiążącym nukleotydy – chinakryną oraz czerwonym barwnikiem jądrowym (DRAQ5). Małe kwadranty przedstawiają pęcherzyki dodatnie pod względem chinakryny, wykryte w cytoplazmie HSC, ale nie w GMP.

Rycina 5. Wzrost stężenia Ca²⁺ w cytozolu w posortowanych komórkach HSC obciążonych Fura-2 i stymulowanych ATP oraz ionomycyną. Przedstawiono zapisy z pojedynczych komórek. Wszystkie komórki reagowały na zewnątrzkomórkowe ATP, wykazując wyraźny wzrost poziomu Ca²⁺ w cytozolu po dodaniu ATP.

Dyskusja

Opisana tutaj metoda umożliwia szybką i dokładną analizę hematopoezy u poszczególnych myszy (Rysunek 1). Analiza ta w różnych warunkach eksperymentalnych, w tym w mysich modelach stanu zapalnego, autoimmunizacji, immunodeficyjności, chorób degeneracyjnych, zaburzeń metabolicznych i nowotworów, pozwala na zbadanie wpływu stanów patologicznych na hematopoezę. Rysunek 3 przedstawia analizę aktywności cyklu komórkowego w elektronicznie bramkowanych komórkach LKS CD34^- p...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
RPMI 1640	Gibco	42401
MEM NEAA 100X	Gibco	11140
Piwczan sodu	Gibco	11360
PenStrep	Gibco	15070
PBS	Gibco	20012
FBS	Gibco	16000
Sito do komórek 40 μm	BD Falcon	352340
Roztwór barwiący 7-AAD	BD Pharmingen	559925
Bufor do lizy i fiksacji	BD Pharmingen	558049
Bufor do permeabilizacji III	BD Pharmingen	558050
Ki-67	BD Pharmingen	556026
DAPI	Invitrogen	D21490
CD4 (GK1.5)	eBioscience	150041
CD8 (53-6.7)	eBioscience	150081
CD3 (145-2C11)	eBioscience	150031
CD45R (RA3-6B2)	eBioscience	150452
CD19 (6D5)	eBioscience	150193
Gr1 (RB6-8C5)	eBioscience	155931
Tre119 (TER-119)	eBioscience	155921
NK-1.1 (PK136)	eBioscience	455941
c-Kit (2B8)	eBioscience	171171
Sca-1 (D7)	eBioscience	135981
CD34 (RAM34)	eBioscience	110341
FcγR (2.4G2)	eBioscience	553145
Mikrokulki przeciw-APC	Miltenyi Biotec	130-090-855
Kolumny LS	Miltenyi Biotec	130-042-401